黄芩(
Scutellaria baicalensis),是唇形科多年生草本植物
[1].黄芩植物干燥的根是入药部位,其产地主要分布在东北亚,包括中国、俄罗斯、韩国和日本等地
[2].黄芩药材最早记载于《神农本草经》中,归为中品,其味苦平
[3].根据《中国药典》(2020版)中的描述,具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效
[4].黄芩中主要含有黄酮类、萜类、多糖类、苯乙醇苷类、挥发油等化学成分
[5].目前已从黄芩中分离到黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等主要药效成分,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、保肝、免疫调节等多种药理活性
[6].
研究
[7]表明,内生菌寄生于植物中、是一种重要的微生物资源,其种类丰富多样,分布范围广泛,存在于绝大多数的药用植物中.植物内生菌也具有复杂的生物多样性,在不同地域的同种植物产生的内生菌多样性有所差异
[8].从植物内生菌发酵产物中分离的代谢产物表现出各种化学结构,包括生物碱、甾体、萜烯、蒽醌、环肽和类黄酮等,且具有多种生物活性,主要包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、杀虫和酶抑制活性
[9].
本文以黄芩内生菌、次级代谢产物、生物活性等为关键词,在中国知网、维普、万方等中文数据库,以“S. baicalensis”和“endophyte”为关键词,在Pubmed、ScienceDirect、SciFinder等外文数据库检索对黄芩内生菌的多样性、内生菌的次级代谢产物及其生物活性、内生菌的生物转化等研究进行检索并综述,讨论目前黄芩内生菌研究中存在的问题,对未来黄芩内生菌资源的开发和利用提供一定的理论依据.
1 黄芩内生菌多样性
内生菌的多样性通常受到植物的种类、地理环境、生长状况、气候条件等多种因素的影响,具有丰富的生物多样性
[10].研究
[11]表明,黄芩内生菌的多样性主要体现在从黄芩的不同属地中分离得到的内生菌种类和数量不同,野生和人工栽培的黄芩的内生菌种类和数量也有差异.内生菌分布在宿主植物的不同部位,在宿主的根、茎、叶等不同器官中的种类和数量也各有差异.如
表1所示,本文总结近二十年(2005—2025)关于黄芩内生菌的分离和鉴定结果,为研究黄芩内生菌的多样性提供依据.
1.1 内生真菌
内生真菌是指在某些时期或整个生命阶段生活在健康植物的组织和器官内而不会在宿主植物中引起明显症状的一类真菌.该类包括一些在其生命周期特定阶段生活在地表的腐生真菌、潜伏病原体和菌根真菌
[12].内生真菌作为自然界中内生菌最主要的微生物资源之一,几乎存在于目前所有研究的植物中,已成为内生菌研究的热点
[13].
冀玉良等
[14]从商洛香菊药源基地采集的黄芩的根、茎、叶等96份组织中分离到36株内生真菌.其中根、茎、叶分别有14、10、12株.经过鉴定,所分离的菌株属于12个属,其中根、茎、叶各有8、4、5个不同属.链格孢属(
Alternaria)是优势属,共计有12株.
崔晋龙等
[15]从山西绛县的“山西省中药种子繁殖基地”中采集的栽培黄芩植株中分离内生真菌54株,根、茎、叶中分别有19、19、16株.其中自7月份生长的健康黄芩(生长期)中分离内生真菌24株,根、茎、叶各分离到9、10、5株,分别属于镰孢霉属、帚梗柱孢属、链格孢属等;自10月份采集的栽培黄芩(成熟期)中分离内生真菌30株,根、茎、叶各分离到10、9、11株,分别属于镰孢霉属、小葚核属、枝顶孢属、链格孢属等.
李青连等
[16]从山西省长治县雄山林场采集的野生黄芩的根、茎、叶等192份组织中分离到97株内生真菌,其中生长期黄芩中有33株,根、茎、叶分别为12、10、11株;成熟期黄芩中有64株,根、茎、叶分别为21、22、21株.结果表明,成熟期黄芩中的内生真菌菌株数量远大于生长期的.通过鉴定这些菌株属于38个真菌属,其中链格孢属为优势属.
魏希颖等
[17]从陕西师范大学长安校区采集的黄芩植株的根、茎、叶和花等不同组织中共分离出17株内生真菌,其中根、茎、叶、花各部分分别有3、7、1、6株.此外从其中筛选出两株能够产生与宿主相同的活性成分黄芩苷的菌株J1和H3,经过形态学鉴定为青霉菌属.
马宗敏等
[18]从河北省承德市滦平县安纯沟门乡桑园村西梁山采集到的野生黄芩植株的根、茎、叶中分离得到14株内生真菌,其中有6株菌株生长较快.并且从根中分离出1株能够发酵转化黄芩苷的内生真菌
Penicillium sp
. R3,经鉴定为青霉菌属.此外从其中筛选出1株能够高效转化黄芩苷为黄芩素的菌株RM3,经鉴定为青霉菌属
[19].
Cui等
[20]从河北省承德市、张家口市等5个采集点采集到的野生和栽培黄芩植株的1 980份组织切片中共分离到687株内生真菌菌株,属于57个属,最常见的2个属为链格孢属和镰刀菌属.其中链格孢菌在黄芩的叶部和茎部中分布均占优势,而黄芩的根部则是镰刀菌分布占优势.从野生黄芩中分离到501株内生真菌,从栽培黄芩中分离到186株内生真菌,而野生和栽培黄芩的优势属均为链格孢属.
1.2 内生细菌
内生细菌是指能存在于宿主植物体内并与之长期共生,且不会给植物本身造成明显损害的细菌.内生细菌作为内生菌的重要组成部分,关于药用植物的内生细菌的研究报道较少
[21].
郭纯等
[22]从安徽毫州子芩(经鉴定为黄芩)的根中分离出8株内生细菌,其中有革兰氏阴性和革兰氏阳性的菌株.通过对8株内生细菌的形态学观察,发现有球状、杆状或短杆状的菌体形态.Xu等
[23]从江苏南京中国药科大学药用植物园中采集到的黄芩健康的新鲜根部中分离得到内生细菌菌株
Pseudomonas sp. 2B,经分子生物学鉴定为假单胞菌属.Sun等
[24]从安徽科技大学中药材种植园中采集到的黄芩根部中分离到1株内生细菌菌株ES - 2,经形态学和分子生物学鉴定为解淀粉芽孢杆菌.
1.3 内生放线菌
内生放线菌是指以共生或寄生方式存在于植物组织内而不在宿主植物中引起明显症状的放线菌.药用植物中内生放线菌资源丰富多样,具有巨大的研究潜力,但是目前因其生长缓慢、分离困难而研究较少
[25].
Tuo等
[26]从贵州采集到黄芩表面灭菌的表皮中分离得到的内生放线菌菌株M1HQ - 2
T,经过形态学和分子生物学鉴定该菌株M1HQ - 2
T是短杆菌属的一个新种,因此将其命名为内生短杆菌.同时闫晓睿
[27]从贵州省遵义市余庆县采集的药用植物黄芩皮中分离到内生放线菌菌株M1HQ - 2
T,其化学成分特征与短杆菌属的分类特征一致,可以归属为短杆菌属.通过ANI和DDH值分析证实,证实菌株M1HQ - 2
T代表了一个新的物种,命名为
Brachybacterium endophyticum sp.nov.
2 黄芩内生菌及其次级代谢产物的活性研究
2.1 黄芩内生菌的抑菌活性
植物内生菌的抑菌活性是研究抑菌微生物资源重点,对于寻找新的抑菌药物具有重要意义
[37].药用黄芩的有效成分具有显著的抑菌活性,作为研究抗细菌和抗真菌的药理活性具有重要意义
[38].当前研究通过对分离到的黄芩内生菌进行抑菌活性的筛选,如
表2所示,结果表明有许多黄芩内生菌都具有较好的抑菌活性.
冀玉良等
[14]通过对分离到的36株内生真菌进行病原真菌拮抗作用的活性筛选,初步发现了6株具有较高活性的菌株.其中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌的抑制率分别为75.21%和77.63%;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌的抑制率分别为81.63%和82.36%;SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉的抑制率分别为80.17%和77.54%;而SBF08和SBF32则对烟草赤星病菌及草燕麦镰孢霉的抑制率分别为75.52%、72.58%和64.25%、76.35%,均表现出较好的抑制作用.
崔晋龙等
[15]以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、深红酵母为指示菌,对分离自黄芩的30株内生真菌进行抑菌活性评价,结果发现有17株显示出显著的抑菌效果.其中SBG5和SBM7对大肠杆菌的抑菌圈直径为14.22 mm,SBM2对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为15.54 mm,均表现出较好的抑制活性.通过选取其中1株高抑菌活性的菌株SBO23进行抑菌活性试验.对枯草芽孢杆菌抑菌圈大小的分析,结果表明,抑菌圈直径在第8天达到(3.020 ± 0.012) mm,即在第8天时菌株SBO23抑菌效果最好
[39].
李青连等
[16]通过14种指示菌对分离到的95株内生真菌进行抑菌活性试验,结果发现,有91株菌株对至少一种指示菌表现出抑菌活性,占总分离菌株的95.8%.在生长期黄芩中分离的33株菌中对大肠杆菌有抑制作用的菌株最多,为30株;其中有9株对大肠杆菌抑菌圈直径大于20 mm,N.SBA27的抑菌圈直径达到26.30 mm.并且抑制枯草芽孢杆菌、致病性大肠埃希氏菌和宋内氏痢疾杆菌的菌株分别为15、14和11株.而在成熟期黄芩中分离的62株菌中,有54株可以抑制大肠杆菌.并且对白色念珠菌、小孢拟盘多毛孢、九州镰孢霉等3种真菌指示菌表现出较高的拮抗活性,其中有6株对小孢拟盘多毛孢的抑菌圈直径大于20 mm,N.SBO40和N.SBO45的抑菌圈直径达到22.70和19.40 mm.在62株菌中只有12株对5种供试指示菌表现出抑菌活性,表明其菌株对细菌的拮抗活性相对较差,但可能具有较好的选择性抗性.抑菌试验结果显示,黄芩内生真菌表现出广泛的抑菌活性,其中一些菌株表现出广谱抗性或选择性抗性,而在成熟期某些菌株的抗真菌活性更为显著.
曹晋忠等
[28]对4株内生真菌进行抑菌活性测定,结果显示,其发酵液原液以及发酵液和菌丝体的乙醇提取物对7种指示菌均表现出抑菌作用.其中N.SBA10发酵液原液对致病性大肠埃希氏菌和宋内氏痢疾杆菌的抑菌圈直径分别为21.04和20.04 mm;发酵液和菌丝体乙醇提取物对肠炎沙门氏菌的抑菌圈直径分别为20.82和22.36 mm.N.SBA34发酵液和菌丝体乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为21.78和27.82 mm.N.SBA9发酵液和菌丝体乙醇提取物对肠炎沙门氏菌的抑菌圈直径分别为22.89和22.09 mm.研究还发现,发酵原液具有较宽的抗菌谱,而发酵液和菌丝体的醇提物则显示出较窄的抗菌谱,但其抗菌活性较高.
魏希颖等
[17]评价了17株内生真菌对10种指示菌的抑菌活性,结果显示,有12株菌株对至少一种指示细菌表现出抑菌活性.特别是G2、J4和J5菌株对多种指示细菌显示出抑菌活性,表明具有广谱的抗菌能力.其中G2对巨大芽孢杆菌的抑菌圈直径为14.65 mm,J4对藤黄八叠球菌的抑菌圈直径为28.13 mm,J5对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为24.75 mm.张黎光
[30]通过10种指示菌对17株内生真菌进行抑菌活性测定,结果显示,12株菌株对一种或多种指示细菌展现出不同程度的抑制活性,其中J1、J4、J5和G2的抗菌谱相对较广,J1对肺炎链球菌抑菌圈直径为16.24 mm.
孙力军
[40]对分离的6株内生菌使用6种指示菌评估其抑菌活性.结果表明,有3株表现出良好的抑菌活性,特别是ES - 2和ES - 3菌株对6种指示菌均有抑菌作用.此外,菌株的发酵提取物显示出广泛的抑菌谱,对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强的抑制作用,尤其对霉菌的抑制效果非常突出.其中ES - 2对藤黄微球菌和荧光假单胞菌的抑菌圈直径大于25 mm,对黑曲霉的抑菌圈直径在15 ~ 25 mm.
潘景芝
[33]评价了内生真菌HQin0116对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌的抑菌活性.结果表明,该菌株的发酵产物、甲醇提取物和乙醇提取物对指示细菌表现出一定的抑菌作用,其中甲醇和乙醇提取物对3种指示菌的抑菌圈直径均大于10 mm.
郭纯等
[22]对8株分离的内生细菌,以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌进行抑菌活性测定.结果显示,7株菌株的发酵液对大肠杆菌的生长具有抑制作用,6株对枯草芽孢杆菌有抑制效果,而5株则能抑制金黄色葡萄球菌的生长.
Sun等
[24]通过对菌株ES - 2进行抑菌活性测试,发现37种指标菌中的大多数对淀粉芽孢杆菌ES - 2产生的抑菌物质敏感.该菌株的滤液能强烈抑制除枯草芽孢杆菌外的所有革兰氏阳性细菌和除人苍白杆菌外的所有革兰氏阴性细菌的生长,其中对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、溶血性链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌抑菌圈直径均大于25 mm.此外,其滤液对植物病原真菌也有很好的抑制作用,对无花果曲霉、黄色镰刀菌、伞枝梨头霉的抑菌圈直达均大于25 mm.因此,ES - 2产生的抑菌物质被认为具有食品保鲜和植物真菌疾病防治的潜力.
2.2 次级代谢产物的活性研究
内生真菌与植物形成共生关系,导致产生与宿主相似的次生代谢物.这些代谢物通常表现出抗肿瘤、抗菌、抗病毒和杀虫特性
[41].目前在内生菌的研究中,抗菌活性是主要的研究方向,大多数从植物内生菌中提取到的次生代谢产物都具有抗菌活性
[42].如
表3所示,黄芩内生菌的次级代谢产物具有抗菌、抗氧化、抗炎和其他活性.
2.2.1 抗氧化
郑朝辉等
[43]从黄芩中分离到1株内生真菌菌株N.SBA10,经鉴定隶属于链格孢属.通过对该内生真菌菌株发酵代谢产物的乙酸乙酯相提取物的DPPH自由基清除能力的测定,结果表明,其乙酸乙酯相提取物在质量浓度为20和50 mg/mL时,清除率分别为91.26%和97.5%,具有较好的抗氧化活性.从乙酸乙酯相提取物中首次分离得到3个化合物,分别被鉴定为邻苯二甲酸二丁酯(
1)、alternariol methyl ether (
2)、alternariol (
3).
2.2.2 抗菌
黄丹等
[34]从分离到内生真菌菌株HQ100X - 1的乙酸乙酯相组分中分离出2种新化合物,即terrustone (
4)和asperteretone G (
5),如
图1所示,还有10种已知化合物,分别为(+) - asperteretone B (
6)、rbrolide R (
7)、butyrolactones - 2 (
8)、terrusnolide A (
9)、versicolactone B (
10)、butyrolactone I (
11)、terrelactone (
12)、aspernolide E (
13)、3 - hydroxy - 5 - ((4 - hydroxy - 3 - (3 - methyl - 2 - buten - 1 - yl)phenyl)methyl) - 4 - (4 - hydroxyphenyl) - 2(5H) - furanone (
14)、aspernolide A (
15).以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为测试菌对所有化合物进行抗菌活性检测,结果表明,仅化合物 rbrolide R对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性,其MIC值为2.5 μg/mL.
Yang等
[35]从分离到内生真菌菌株FAE17的乙酸乙酯相组分中分离出4种吡喃酮类的衍生物和1种已知的类似物,如
图1 所示,分别为ascomycopyrone A (
16)、ascomycopyrone B (
17)、ascomycopyrone C (
18)、ascomycopyrone D (
19) 以及simplicilopyrone (
20).选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和嗜麦芽糖单胞菌等4种病原菌为指示剂,对所有化合物进行抗菌活性的测定,结果其MIC值都超过64 μg/mL,均表现出较弱的抗菌活性.
2.2.3 抗炎
Maharjan等
[36]从分离到的内生真菌菌株QF001的乙酸乙酯相提取物中分离出了2种新的lucilactaene异构体(
22 ~
23)以及7种已知化合物,它们分别被鉴定为 fusarubin (
21)、solaniol (
24)、javanicin (
25)、lucilactaene (
26)、9 - desmethylherbarine (
27)、NG391 (
28)和 NG393 (
29).然后评估了分离出的化合物在 LPS 诱导的巨噬细胞中通过产生 NO、TNF -
α 和IL - 6而产生的抗炎活性(1 μg/mL LPS和10 μmol/L DEX为对照组).脂多糖显著增加了巨噬细胞中NO的产生,然而,地塞米松(DEX)或分离的化合物
21 ~
29可抑制NO的产生(LPS产生的NO浓度为5.2 μmol/L,DEX产生的NO为1.6 μmol/L,化合物
21 ~
29产生的NO在2 ~ 3 μmol/L之间).同样,DEX或化合物
21 ~
29处理LPS诱导的巨噬细胞后,TNF -
α和IL - 6等促炎细胞因子的表达也受到抑制(LPS产生的TNF -
α 和IL - 6质量浓度分别为2.2和0.6 pg/mL,DEX产生的TNF -
α和IL - 6质量浓度分别为2.3和1.4 pg/mL, 化合物
21 ~
29产生的TNF -
α和IL - 6质量浓度分别在0.5 ~ 0.7 pg/mL和1.2 ~ 1.5 pg/mL之间).
3 黄芩内生菌的生物转化
研究
[57]表明,黄芩的主要活性化学成分为黄酮及其苷类,包括黄芩素、汉黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、千层纸素A等.其主要有效成分主要为黄芩苷和黄芩素,具有广泛的药理活性,包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用
[58].黄芩苷在人体内需要转化为黄芩素才能发挥其药理作用,但有研究
[59]表明黄芩中的黄芩素的质量分数相对于黄芩苷较低,如何提高其转化率是应用黄芩生物转化的关键.目前通过研究微生物发酵转化法以此来实现对黄芩的多种活性成分的生物转化,具有一定的应用价值
[60].
马宗敏等
[19]从黄芩中分离到的3株内生真菌中筛选出1株能够高效转化黄芩苷为黄芩素的菌株RM3.该菌株在添加质量分数0.1%黄芩苷的PDB培养液中能够将黄芩苷转化为黄芩素,未经任何优化条件下,28 ℃,150 r/min孵育5 d后摩尔转化率达到83.87%,可见菌株RM3作为青霉菌在黄芩苷的生物转化中效率较高.千层纸素A也是黄芩中重要的活性成分,目前研究内生真菌对黄芩素和千层纸素A的生物转化的新方法.马宗敏等
[18]在其分离到的14株内生真菌,筛选出从其根部分离得到一株发酵转化黄芩苷的内生真菌
Penicillium sp. R3.通过不用底物添加法分析其生物转化途径,用高效液相色谱检测其产物.该菌株能够在添加0.1%黄芩苷的PDB中转化黄芩苷,产生2种产物:黄芩素和千层纸素A.在28 ℃、150 r/min下孵育5 d后,摩尔转化率达到61.09%.
有研究
[61]表明,内生真菌可促进宿主植物次级代谢产物的生物合成.因此,筛选能提高药用植物中次级代谢产物的质量分数的内生真菌是促进宿主植物药效成分的有效途径.
张鑫等
[29]通过对分离到的17株黄芩内生真菌制作为菌丝诱导子和菌液诱导子,并将其添加到黄芩愈伤组织培养体系中,筛选出对黄芩愈伤组织中黄酮类成分合成具有促进作用的活性内生真菌.结果表明,发现有2株内生真菌的菌液诱导子对黄芩愈伤组织中黄酮类成分的合成具有促进作用,其中链格孢菌CL79和镰刀菌CL105 的菌液诱导子均可以显著促进黄芩愈伤组织中的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的合成,促进黄芩愈伤组织中黄酮类成分积累.
Cui等
[20]分离到687株内生真菌菌株,并通过分析黄芩中内生真菌的相对丰度与黄酮类化合物质量分数之间的相关性,来筛选出能促进黄芩中黄酮类化合物生物合成的潜在内生真菌.结果表明,叶片中的优势内生真菌属与黄酮类化合物无显著相关性,茎中的汉黄芩素和千层纸素A的质量分数与链格孢菌的相对丰度呈显著正相关,而千层纸素A的质量分数与间座壳属和拟茎点霉属的相对丰度呈显著负相关.此外,根中黄芩苷和汉黄芩苷的质量分数与链格孢菌的相对丰度呈显著正相关.总之,黄芩中的黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、千层纸素A与链格孢菌的相对丰度呈正相关,因此推测链格孢菌可能有助于黄酮类化合物在黄芩中的生物合成.
Xu等
[23]通过研究黄芩愈伤组织与假单胞菌
Pseudomonas sp.
2B共培养过程中次级代谢的变化,发现在复合培养体系中,黄芩愈伤组织中黄酮类、木质素类、苯乙酮类、蒽醌类和二芳基庚酮类的代谢发生了显著变化.与假单胞菌
Pseudomonas sp.
2B共培养的黄芩愈伤组织中黄芩苷和汉黄芩苷质量分数降低,但促进了黄芩素、汉黄芩素和白杨素的积累,PPO的活性在此过程中也有所提高.
4 结语
黄芩内生菌拥有丰富的药用资源,在目前研究中集中在菌种分离鉴定、次级代谢产物分离及其活性研究等领域.虽然现代药理及植物化学研究在证实黄芩内生菌具有抗菌、抗炎等药用活性方面取得了一定成果,但在解析其传统的广谱疗效如安胎、保肝等民间用途方面尚存在缺口.故从内生菌资源中筛选到与其宿主植物黄芩相似甚至新的药用活性物质,在天然药物的开发及应用中具有广阔的前景.
为了进一步发掘黄芩内生菌的潜在药用资源,未来应从以下方面深入研究:(1)结合宏基因组学技术挖掘黄芩内生菌的功能基因资源;(2)探索黄芩内生菌对药效成分生物合成的机制;(3)开发黄芩药用活性成分的微生物合成技术.这些不同方向的探索不仅能够完善黄芩传统药用机制的空缺,还能更好地开发黄芩与内生菌共同增效的药用前景,为中医药现代化提供关键理论支撑.