锅铲叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究

Study on extraction technology and antioxidant activity in vitro of total flavonoids from Passiflora wilsonii Hemsl foliage

摘要

以锅铲叶为原料，以乙醇体积分数、液料比、提取时间和提取温度为自变量，黄酮得率为因变量，通过单因素实验和响应面分析法，优化锅铲叶总黄酮的乙醇回流提取工艺.此外，以维生素C和芦丁为阳性对照，通过1，1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、2，2' - 联氮 - 双 - 3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸（ABTS）和铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP） 3种方法评价锅铲叶总黄酮的抗氧化能力.结果表明液料比、提取温度和时间会显著影响乙醇回流提取锅铲叶总黄酮的得率，以体积分数为70%的乙醇溶液为溶剂，在液料比为27 mL/g，61 ℃条件下回流提取42 min，黄酮平均得率可达23.4485 mg/g.提取所得总黄酮对DPPH、ABTS⁺和Fe³⁺ - TPTZ等均具有较好的清除能力，表现出良好的抗氧化活性，为进一步解析锅铲叶化学成分和活性研究提供重要的研究基础.

Abstract

Taking Passiflora wilsonii Hemsl foliage as raw material and based on single factor experiment， the effects of ethanol volume fraction， liquid - solid ratio， extraction time and extraction temperature on the yield of total flavonoids from P. wilsonii Hemsl foliage were investigated. The antioxidant capacity of total flavonoids from P. wilsonii Hemsl was evaluated by DPPH， ABTS and FRAP， vitamin C and rutin were used as positive controls. The results showed that the yield of total flavonoids was significantly affected by liquid - solid ratio， extraction temperature and extraction time. With 70% ethanol solution as solvent， liquid - solid ratio of 27 mL/g， and extraction at 61 ℃ for 42 min， the average yield of flavonoids was 23.448 5 mg/g. The extracted total flavonoids had good scavenging ability for DPPH， ABTS⁺ and Fe³⁺ - TPTZ， providing an valuable research foundation for further analysis of the chemical composition and activity of P. wilsonii Hemsl foliage.

Graphical abstract

关键词

锅铲叶 / 总黄酮 / 提取工艺 / 响应面法 / 抗氧化

Key words

Passiflora wilsonii Hemsl / total flavonoids / extraction technology / response - surface methodology / antioxidant

锅铲叶，泛称西番莲科西番莲属植物镰叶西番莲（Passiflora wilsonii Hemsl）的各药用部位^［1］.《云南中草药选》^［2］记载锅铲叶可用于治疗风湿腰痛、肝炎、肝硬化、肿瘤、跌打损伤、骨折等疾病.锅铲叶多以全草入药，用法以水煎服或酒泡服为主，云南傣族、景颇族、哈尼族、拉祜族、佤族等常以锅铲叶单独或配伍其他药物治疗黄疸、肝炎、肝硬化、乙肝等肝脏疾病，或将其水煎液用于解酒和日常保健^［3］，但关于锅铲叶生物活性和物质基础的研究尚不充分.相关研究显示，可从锅铲叶根茎或地上部分分离获得萜类、甾体类等化合物^［4-5］，其地上部分水提物对酒精诱导的肝脏损伤具有保护作用^［6］，但目前未见对锅铲叶叶片独立的化学成分和生物活性研究.

黄酮类成分是西番莲属植物中普遍存在的一类化学物质^［7-8］，课题组在前期研究中发现锅铲叶叶片中含有黄酮类成分.黄酮类成分作为一种广泛存在于天然药物中，具有抗炎、抗氧化、抗病毒等活性的物质，对各类肝脏病变具有防治作用^［9］，因此其可能是锅铲叶在多种肝脏疾病中发挥防治作用的物质基础之一.响应面分析法作为一种适用于多因素、多水平试验，并能通过较少试验次数确定最佳工艺的实验设计方法，长期应用于中药成分提取、制剂工艺等领域^［10-11］.

基于此，本文以锅铲叶黄酮成分为目标，结合单因素和响应面法考察不同因素对锅铲叶总黄酮得率的影响，优化锅铲叶中黄酮类成分的提取工艺，并应用1，1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）、2，2' - 联氮 - 双 - 3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸（ABTS）和铁离子还原/抗氧化能力法（FRAP）等方法评价锅铲叶总黄酮体外抗氧化活性，为研究锅铲叶的生物活性和物质基础提供新角度.

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

锅铲叶采自云南省德宏傣族景颇族自治州梁河县，经保山中医药高等专科学校中药教研室副教授赵兴蕊鉴定为西番莲科西番莲属植物镰叶西番莲的叶.

芦丁对照品（纯度 ≥ 98%）：上海源叶生物科技有限公司；DPPH自由基清除能力试剂盒、ABTS、FRAP法总抗氧化能力测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；维生素C（Vc）注射液（5 mL/g）：上海现代哈森（商丘）药业有限公司.

1.2 主要仪器

UV - 1800紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；R - 300旋转蒸发仪：步琦实验室设备贸易（上海）有限公司；FA1004电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电热鼓风干燥器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Feyond - A300酶联免疫分析仪：杭州奥盛仪器有限公司；1524高速离心机：基因有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 锅铲叶粉末制备

将锅铲叶置于恒温鼓风干燥箱中60 ℃干燥3 h后，用多功能粉碎机研磨成细粉，密封保存.

1.3.2 芦丁标准曲线制备

精密称取芦丁对照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中，用体积分数为70%的乙醇配制成0.2 mg/mL的芦丁对照溶液.在10 mL容量瓶中分别加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁对照溶液，继续加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，反应6 min.然后加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.4 mL，混匀，反应6 min.然后加入质量分数为10%的氢氧化钠溶液4 mL，混匀，反应15 min后加水定容至10 mL.用去离子水调零，以510 nm波长处测得的吸光度值（A）为纵坐标，各容量瓶中芦丁质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，所得芦丁标准曲线在0.00 ~ 0.10 mg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为A = 11.113C + 0.013 5，R² = 0.996 5.

1.3.3 锅铲叶总黄酮得率的测定

精密称取锅铲叶粉末1.0 g，加入体积分数为70%的乙醇水溶液25 mL，70 ℃回流提取60 min，趁热过滤，用溶剂将滤液定容至50 mL，得锅铲叶提取液.准确量取1 mL锅铲叶提取液，加入试管中，并按照“1.3.2”的方法加入相应试剂，测定吸光度，代入式（1）计算黄酮得率.

R=\frac{CVn}{m}.（1）

式中，R为锅铲叶总黄酮得率，单位为mg/g；C为按吸光度值计算所得黄酮质量浓度，单位为mg/mL； n为稀释倍数；V为提取液体积，单位为mL；m为锅铲叶粉末质量，单位为g.

1.3.4 单因素实验

通过控制变量法研究不同体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）乙醇溶液，液料比（10、15、20、25、30、35 mL/g），提取温度T（50、60、70、80、90 ℃），提取时间t（30、60、90、120、150 min）对锅铲叶总黄酮得率的影响，按照“1.3.3”的方法进行提取并计算锅铲叶总黄酮得率，每组实验平行3次.

1.3.5 响应面实验

以锅铲叶总黄酮得率为响应值，将通过单因素实验获得的试验因素和关键参数通过Box - Behnken设计4因素3水平响应面优化试验.因素水平见表1.

1.3.6 体外抗氧化活性检测

1） 样品溶液配制

锅铲叶提取液、芦丁用体积分数为70%的乙醇溶液，Vc用水，配制成2.0 mg/mL的母液，用相应溶剂将其分别稀释成质量浓度为1.5、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125 mg/mL和100、75、50、25、12.5 μg/mL的样品溶液.

2） DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除能力测定参考试剂盒说明书进行改造.将400 μL不同质量浓度的样品溶液和600 μL DPPH工作液混合于测定管中，室温下避光反应30 min，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液200 μL，在517 nm波长下测定吸光度值记为A_测定；分别将400 μL不同质量浓度的样品溶液和600 μL空白溶剂混合于对照管中，同法测定吸光度值记为A_对照；将400 μL空白溶剂和600 μL DPPH工作液混合于空白管中，同法测定吸光度值记为A_空白，代入式（2）计算DPPH的清除率.

\mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{清除}\mathrm{率}=\left(\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{测定}}-A_{\mathrm{对照}}}{A_{\mathrm{空白}}}\right)\times \mathrm{100}\%.（2）

3） ABTS法总抗氧化能力测定

ABTS法总抗氧化能力测定参考试剂盒说明书进行改造.将10 μL不同质量浓度的样品溶液、20 μL试剂4应用液和170 μL ABTS工作液混合于测定孔中，室温反应6 min，在405 nm波长下测定吸光度值，记为A′_测定；分别将10 μL不同质量浓度的样品溶液和190 μL空白溶剂混合于对照孔中，同法测定吸光度值记为A′_对照；将10 μL空白溶剂、20 μL试剂4应用液和170 μL ABTS工作液混合于空白孔中，同法测定吸光度值记为A′_空白，代入式（3）计算ABTS⁺清除率.

\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}{\mathrm{S}}^{+}\mathrm{清除}\mathrm{率}=\left(\mathrm{1}-\frac{A{\mathrm{\text{'}}}_{\mathrm{测定}}-A{\mathrm{\text{'}}}_{\mathrm{对照}}}{A{\mathrm{\text{'}}}_{\mathrm{空白}}}\right)\times \mathrm{100}\%.（3）

4） FRAP法总抗氧化能力测定

FRAP法总抗氧化能力测定参考试剂盒说明书进行改造.将5 μL不同质量浓度的样品溶液和180 μL FRAP工作液混合于测定孔，37 ℃孵育3 min后，在593 nm波长下测定吸光度值记为A″_测定；分别将5 μL不同质量浓度的样品溶液和180 μL空白溶剂混合于对照孔，同法测定吸光度值记为A″_对照；将5 μL空白溶剂和180 μL FRAP工作液混合于空白孔中，同法测定吸光度值记为A″_空白，代入式（4）计算Fe³⁺ - TPTZ还原率（以2 mg/mL Vc对Fe³⁺ - TPTZ还原率为100%计）.

\mathrm{F}{\mathrm{e}}^{\mathrm{3}+}-\mathrm{T}\mathrm{P}\mathrm{T}\mathrm{Z}\mathrm{还原}\mathrm{率}=\frac{A{″}_{\mathrm{测定}}-A{″}_{\mathrm{对照}}-A{″}_{\mathrm{空白}}}{A{″}_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（4）

式中，A″₀为2 mg/mL Vc 的A″_测定 - A″_对照 - A″_空白.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

由图1a可知，黄酮得率随乙醇体积分数增大呈现出先升高后降低的趋势.其原因可能是锅铲叶中的黄酮成分与体积分数为70%的乙醇极性相似，有利于锅铲叶中黄酮成分溶出.当溶剂乙醇体积分数大于70%，黄酮得率下降，一方面可能是溶剂与目标物质的极性存在差异导致目标物质溶出减少，另一方面乙醇体积分数的提高可能增加了其他物质的溶出而阻碍了黄酮类成分的溶出^［12］.因此选择70%作为乙醇体积分数的关键参数^［13］.

2.1.2 液料比对黄酮得率的影响

由图1b可知，当液料比大于25 mL/g时，黄酮得率不再随溶剂体积增加而增加.其原因可能是单位质量的锅铲叶粉末中所含黄酮质量一定，随着溶剂量的增加，黄酮溶出不再增加^［14］.因此选择25 mL/g作为液料比的关键参数.

2.1.3 提取温度对黄酮得率的影响

由图1c可知，随着提取温度的升高，黄酮得率先升高后降低.其原因可能是温度低于60 ℃时，温度的升高可加快溶剂和目标物质分子的运动，增强了植物细胞内部与溶剂之间的物质交换，使黄酮成分溶出增加；当温度过高时，高温可能使溶剂挥发损失增大或破坏锅铲叶中的黄酮成分，导致黄酮得率逐渐降低^［15］.因此选择60 ℃作为提取温度的关键参数.

2.1.4 提取时间对黄酮得率的影响

由图1d可知，提取时间在30 ~ 60 min内，黄酮得率随时间延长的增长小于1 mg/g，而当提取时间大于60 min后，黄酮得率随提取时间的延长而降低，并在60 ~ 90 min的范围内出现急速降低.结合提取温度对锅铲叶总黄酮得率的影响，其原因可能是随着时间的延长，黄酮成分被破坏，导致黄酮得率降低^［16］.综合考虑温度和时间对黄酮得率的影响，选择45 min作为提取时间的关键参数.

2.2 基于响应面法的工艺优化与分析

2.2.1 响应面设计及结果

依照表1试验因素与水平表，以黄酮得率为响应值，对4个因素进行响应面实验设计，按照“1.3.3”的方法获得各组总黄酮得率，每组平行实验3次计算其平均值.设计和实验结果见表2.

2.2.2 统计分析和模型拟合

将表2的实验数据通过Design - Expert12软件进行回归拟合，得到多元二次响应面回归方程：R = 23.43 + 0.086 2A + 0.704 9B - 0.332 4C + 0.406 2D - 0.401 2AB - 0.423 7AC + 0.056 2AD + 0.296 2BC - 0.614 9BD - 0.389 9CD - 1.12A² - 0.673 4B² - 0.658 4C² - 0.937 7D².

由表3可知，模型F = 13.27，P < 0.000 1，表明该模型极显著，说明该模型中各项对响应值的变异有显著贡献；失拟项F = 1.39，P = 0.403 4 > 0.05，不显著，说明实验随机误差较小^［16］.模型系数R² = 0.929 9，R²_Adj = 0.859 9，表明模型拟合度较好^［17］，变异系数CV= 1.71%，说明模型置信度高，综上该模型能较好地预测响应值的变化^［18］.单因素的P值越小，说明该因素对锅铲叶总黄酮得率的影响越显著，比较A、B、C、D 4个因素的P值可知，液料比对锅铲叶总黄酮得率的影响最大，其次为提取温度和提取时间，乙醇体积分数的影响不显著^［19］.

2.2.3 响应面图分析

响应曲面3D图与等高线图可以直观反映各因素对锅铲叶总黄酮得率的影响和各因素间交互作用的强弱^［20］.图2中6个响应曲面均为凸面，即在试验范围内有极值，符合本试验优化总黄酮提取工艺的目的^［17］.比较响应曲面图中各因素曲面随试验条件变化的趋势可知，锅铲叶总黄酮得率随液料比的变化趋势最显著，其次是提取温度，提取时间再次，其随乙醇体积分数的变化趋势较为平缓，该结果与方差分析结论一致^［21］.

由图2的等高线图可知，图2c中的等高线图趋于圆形，图2a、2b、2d、2e、2f中的等高线图呈现椭圆形，表明除乙醇体积分数和提取温度间交互作用不显著外，其他两两组合的因素间均存在交互作用，结合方差分析，乙醇体积分数和提取时间，液料比和提取温度的交互作用显著^［20］.

2.2.4 响应面最优法验证结果

经响应面分析，乙醇体积分数70.01%，液料比为27.14 mL/g，提取时间为42.12 min，提取温度为61.17 ℃，锅铲叶总黄酮得率的预测值为23.636 7 mg/g.综合考虑分析结果和提取工艺的操作性，按照1.0 g锅铲叶粉末加27 mL体积分数为70%的乙醇溶液，61 ℃回流提取42 min的条件验证分析结果，按照“1.3.3”的方法计算黄酮得率，实验平行3次，实验结果见表4.从表4中可知，总黄酮平均得率为23.448 5 mg/g，对应的相对标准偏差（RSD）为0.399 4%；与预测值（23.636 7 mg/g）相比，误差较小，通过单样本t检验，实测平均值与预测值相比无显著性差异（P > 0.05）^［22］.综上可知该模型对锅铲叶总黄酮得率预测较为准确，且预测所得提取工艺条件重复性较好.

2.3 锅铲叶总黄酮体外抗氧化结果

2.3.1 DPPH自由基清除结果

锅铲叶总黄酮、芦丁和Vc对DPPH的清除能力见图3a.由图3a可知，锅铲叶总黄酮和芦丁质量浓度达到50 μg/mL时，其对DPPH的清除能力趋于最大，清除率接近90%，高于同质量浓度的Vc.说明锅铲叶总黄酮具有较强的抗氧化能力，且锅铲叶所含黄酮类成分和芦丁可能较Vc更适合用于清除DPPH这种含氮的自由基^［23］.DPPH法在试验过程中可能受到样品颜色或反应体系中乙醇体积分数等因素的影响^［23］.此外，研究发现，相同的抗氧化物质对不同物质的抗氧化效果存在差异，这可能与其作用机制不同有关.因此有针对性的选择或叠加不同类型的抗氧化物质可能可以达到更好的抗氧化效果.

2.3.2 ABTS法总抗氧化能力结果

锅铲叶总黄酮、芦丁和Vc对ABTS⁺的清除能力见图3b.由图3b可知，在样品质量浓度低于1.0 mg/mL时，Vc和芦丁对ABTS⁺的清除能力强于锅铲叶总黄酮，样品质量浓度高于1.0 mg/mL后，三者的抗氧化能力逐渐接近并趋于持平.这说明锅铲叶总黄酮具有较强的抗氧化能力，可通过适当提高质量浓度达到与Vc相似的抗氧化效果.

2.3.3 FRAP法总抗氧化能力结果

FRAP法不同于DPPH和ABTS法，是一种用非自由基氧化物评价物质抗氧化能力的方法^［19］.锅铲叶总黄酮、芦丁和Vc对Fe³⁺ - TPTZ的还原能力见图3c.由图3c可知，在质量浓度为0.0 ~ 2.0 mg/mL范围内，三者对Fe³⁺ - TPTZ的还原能力随质量浓度增大而提高，当质量浓度达到2.0 mg/mL时，锅铲叶总黄酮对Fe³⁺ - TPTZ的还原能力达到相同质量浓度Vc的71.5%，与相同质量浓度芦丁的抗氧化能力基本相同.上述结果说明锅铲叶总黄酮具有较好的抗氧化活性.

3 结语

通过单因素试验和响应面分析法综合分析各因素对锅铲叶总黄酮得率的影响，并对其提取工艺进行优化，确定采用乙醇体积分数70%的乙醇溶液作为溶剂，液料比27 mL/g，61 ℃提取42 min，每克锅铲叶可平均提取获得23.448 5 mg总黄酮，提取所得锅铲叶总黄酮对DPPH、ABTS⁺和Fe³⁺ - TPTZ均有较强的清除能力，说明其具有良好的抗氧化活性.未来可通过解析锅铲叶中的黄酮类成分，深入开展活性和药理研究，充分挖掘其在功能性食品和药品等方面开发应用的潜力.但由于液料比、提取温度和提取时间会显著影响锅铲叶总黄酮的得率，提示在锅铲叶的后续开发应用过程中应该充分考虑温度、时间等因素对加工过程的影响.

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基金资助

云南省教育厅科学研究基金(2023J1804)

2022年市级重点领域自筹经费科技计划(2022zc32)