灯盏花胶囊对高糖高脂饮食诱发糖尿病肾病模型的影响

The effect of Erigeron breviscapus capsule on a model of diabetic nephropathy induced by high-sugar and high-fat diet

摘要

考察灯盏花胶囊对小鼠糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）模型的影响，为深入研究提供试验依据.选取9只C57BL/6J小鼠为正常对照，另取70只采用高糖高脂饲料饲喂16周后复制DN模型，将成功复制DN模型的45只小鼠随机分为模型对照、苯那普利（10 mg/kg）以及灯盏花胶囊组（0.78、1.56、3.12 g/kg），每组9只.于给药8周后观察各组小鼠的一般状况，检测各组小鼠尿蛋白、白蛋白（ALB）、空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）；HE染色观察小鼠肾脏组织病理形态.结果表明，阳性对照（苯那普利）及各剂量灯盏花胶囊组小鼠一般状况明显改善，24 h尿蛋白及FBG水平降低（P < 0.05/0.01），血清TG、TC、LDL、BUN、Cre和FINS水平降低（P < 0.05/0.01），ALB明显升高（P < 0.05/0.01）；肾脏和肝脏指数明显降低，肾组织病理形态学明显改善，与模型对照组比较.表明灯盏花胶囊对早期DN具有一定治疗作用.

Abstract

To investigate the effect of Erigeron breviscapus capsules on a diabetic nephropathy （DN） model in mice and provide a basis for further study， nine C57BL/6J mice were selected as normal controls， and another 70 mice were fed with high - sugar and high - fat diet for 16 weeks to replicate the DN model. After that， 45 mice were randomly divided into model control， positive control （benazepril， 10 mg/kg） and low dose （0.78 g/kg）， medium dose （1.56 g/kg） and high dose groups （3.12 g/kg） doses of Erigeron breviscapus capsules， with nine mice in each group. The general conditions of mice in each group were observed after 8 weeks of administration， and these parameters including fasting blood glucose （FBG）， urinary protein， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， low density lipoprotein （LDL）， albumin （ALB）， alanine transaminase （ALT）， aspartate transaminase （AST）， creatinine （Cre）， urea nitrogen （BUN）， fasting insulin （FINS） levels were detected. Histopathological morphology of mice kidney was observed by HE staining. The results showed that compared with the model control group， the general condition of the mice in the positive control and each Erigeron breviscapus capsule dose group was significantly improved， with lower 24 h urine protein and FBG levels （P < 0.05/0.01）； lower serum BUN， Cre， TC， TG， LDL and FINS levels （P < 0.05/0.01） and significantly higher ALB （P < 0.05/0.01）. Kidney and liver indices were significantly reduced and renal histopathological morphology was significantly improved. Erigeron breviscapus capsules have a therapeutic effect on early DN.

Graphical abstract

关键词

灯盏花胶囊 / 糖尿病肾病 / 高糖高脂 / 尿蛋白

Key words

Erigeron breviscapus capsule / diabetic nephropathy / high - sugar and high - fat / urinary protein

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是最常见的微血管病变，可见于Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，是导致终末期肾病的主要原因.早期DN的临床特征及表型不明显，常常出现微量白蛋白尿，肾小球滤过率降低，基底膜增厚以及基质增宽，随着疾病的进展出现大量持续性白蛋白尿，水肿，肌酐持续升高，最后发展为尿毒症，其病理表现为多数肾单位的闭锁^［1］.DN是糖尿病的重要的并发症之一，给患者和社会带来严重的经济负担，其发病机制复杂，目前尚无特效的治疗方法.因此对DN进行早期干预，延缓疾病的进展，具有重要的现实意义.灯盏花胶囊有6味组成，是云南省名中医李琦教授创制，用于治疗复杂慢性肾脏疾病的经验方^［2］，也是云南省中医医院的院内制剂，药效学研究表明，灯盏花胶囊能改善慢性肾衰大鼠的肾功能^［3］.临床实践^［4］表明，保护早、中期慢性肾衰患者的残存肾功能，延缓病程进展，总有效率为81.25%，其临床作用与尿毒清颗粒相当.本文以高糖高脂饮食诱发DN小鼠模型为对象，探究灯盏花胶囊对DN的改善作用，旨在为其深入研究及临床运用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及受试药物

雄性C57BL/6J小鼠80只，体重24 ~ 28 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证：SCXK（京）2019 — 0010.动物饲养于IVC环境中，温度20～26 ℃（日温差 ≤ 3 ℃），湿度40%～70%，照明12 h：12 h明暗交替，照度150～300 lx，噪音 ≤ 60 dB.普通饲料购买于苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，高糖高脂饲料来源于鼠一鼠二生物科技有限公司.

灯盏花胶囊，0.25 g/粒，江阴天江药业有限公司生产，云南省中医医院监制.血糖试纸条及血糖测试仪，艾康生物技术（杭州）有限公司生产.尿蛋白定量测试盒（CBB法）购自南京建成生物科技有限公司.总胆固醇（TC）检测试剂盒（酶比色法），低密度脂蛋白（LDL）胆固醇检测试剂盒，甘油三酯（TG）检测试剂盒（比色法），谷丙转氨酶（ALT）检测试剂盒（IFCC法），谷草转氨酶（AST）检测试剂盒（比色法），尿素氮（BUN）检测试剂盒（比色法），肌酐（Cre）检测试剂盒（脲酶法）；空腹胰岛素（FINS）检测试剂盒（比色法），均由罗氏集团提供.

1.2 造模及分组

参照文献［5］并根据现有实验室设备稍作改动，即80只C57BL/6J小鼠适应性饲养7 d后，饲喂普通饲料和自由饮水，随机抽取10只作正常对照，正常饲喂；其余分笼后投发高糖高脂饲料，自由饮水，连续饲养16周，造模期间观察动物状况并记录.造模16周后，所有小鼠均饥饿处理8 h，尾部取血测定空腹血糖，以FBG值 ≥ 7.0 mmol/L、体重 ≥ 40.0 g者为Ⅱ型糖尿病模型（成模率64%），未达标小鼠予以剔除，并继续给予高糖高脂饲料.将成功复制DN模型的小鼠随机分为模型对照组、苯那普利组（10 mg/kg）及灯盏花胶囊低（0.78 g/kg）、中（1.56 g/kg）、高剂量组（3.12 g/kg），每组9只；同时剔除正常对照组中体重低于29 g小鼠一只，以确保给药前每组动物数量均为9只.

1.3 给药及检测

所有小鼠给药前，收集尿液样本，根据尿蛋白试剂盒说明书测定各组小鼠24 h尿蛋白水平.正常对照和模型组灌胃给予纯水，其余各组给予相应浓度的药物，分别于每日上午灌胃给药1次，连续给药8周，给药容积均为10 mL/kg，药物干预期间除正常对照组给予普通饲料外，其余各组动物喂饲高糖高脂饲料，每日观察动物一般状况，空腹血糖及体重均每周测定1次，每2周用代谢笼收集各组小鼠尿液并测定24 h尿蛋白.末次给药后，禁食不禁水8 h，取血、取材测定以上各指标.

1.4 一般情况观察

药物干预期间，每日重点观察各组小鼠的体质量和精神状态，及尿量、体毛、饮水量、进食量等次要状态.

1.5 指标检测

药物干预8周末次后，禁食不禁水8 h，称取体重，剪尾用试纸测定FBG；内眦取血，血液样本静置30 min，4 ℃，2 500 r/min离心15 min，分别检测血清中白蛋白（ALB）、空腹FINS、TG、LDL、总胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、Cre、BUN.取血后脱颈椎处死小鼠，摘取肝和肾称重，计算脏器系数，并取左肾固定于体积分数10%福尔马林溶液中，常规脱水、浸蜡、包埋，制备组织切片，厚4.0 ~ 5.0 µm，脱蜡，苏木精 - 伊红（H&E）染色，盖片后光镜下观察组织形态变化.

2 实验结果

2.1 对动物体重和血糖的影响

正常对照组动物体重分组时明显低于模型组（P < 0.01），给药期间趋于平稳，而模型组动物体重持续增加，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）；在各测量时间点，给药组体重与模型组相比增长较缓，但无统计学差异（P > 0.05），见图1a.正常对照组动物血糖分组时明显低于模型组（P < 0.01），给药期间趋于平稳，而模型组动物血糖持续增高，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）.在各测量时间点，给药组血糖较模型组有下降，自第7周起，阳性对照、灯盏花中、高剂量组明显低于模型对照组（P < 0.05），见图1b.

2.2 对尿蛋白的影响

由表1可见，模型动物调整分组后，除正常对照组外，其余各组给药前小鼠24 h尿蛋白水平大致均匀，并显著高于正常对照组（P < 0.01），该指标表明给药前各组小鼠病期和肾脏的损伤程度相对一致.

给药2周，与模型对照组相比，各药物组小鼠的24 h尿蛋白总量均略有降低，以阳性对照组作用较为显著（P < 0.01），与模型对照相比降低了25.79%，其余各组仅有降低趋势但统计学差异不明显（P > 0.05）.

给药4周，模型对照组24 h尿蛋白持续升高，各给药组对24 h尿蛋白有改善作用，较模型组，其中苯那普利和灯盏花胶囊高剂量组的作用较为显著（P < 0.05/0.01）.

给药6周，模型对照组24 h尿蛋白与4周相比持续增高，表明模型相对稳定；苯那普利和灯盏花胶囊高剂量组对小鼠24 h尿蛋白表现出持续抑制作用（P < 0.01），并且灯盏花胶囊中剂量也开始表现出此作用（P < 0.05）.

给药8周，模型对照组24 h尿蛋白持续增高，苯那普利组和灯盏花胶囊各剂量组均能非常显著地降低模型小鼠24 h的尿蛋白（P < 0.05/0.01），以高剂量组作用最佳.

2.3 对肝肾系数的影响

模型组小鼠的肾脏和肝脏明显增大，其系数显著增加（图2a，肾脏；图2b，肝脏；P < 0.01），与正常组比较；苯那普利组和灯盏花胶囊低、中、高剂量组均能显著降低DN模型小鼠的肾和肝脏系数（P < 0.05/0.01），与模型组比较.

2.4 对血清生化指标的影响

对血脂代谢指标的影响：由表2可见，与正常组比较，模型组小鼠血脂代谢重要指标TC、TG及LDL均显著升高（P < 0.01/0.05）；与模型组比较，苯那普利能明显降低血清TC和LDL含量（P < 0.01），灯盏花胶囊各剂量组均能显著降低TG和TC水平（P < 0.05/0.01），此外低、中剂量组还能降低血清LDL含量（P < 0.05），但量效关系不明显.

对肝功能指标的影响：由表2可见，与正常组比较，模型组血清ALT和谷草转氨酶（AST）均显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，苯那普利及灯盏花胶囊三剂量组对ALT和AST仅有降低趋势而无统计学差异（P > 0.05）.

对肾功能指标的影响：由表2可见，与正常组比较，模型组小鼠血清Cre和BUN均显著升高（P < 0.01/0.05），ALB显著降低（P < 0.01），表明肾功能受到一定程度的损伤；与模型组比较，苯那普利及灯盏花胶囊各剂量组均能明显降低血清Cre、BUN（P < 0.05/0.01），并能明显提高ALB水平（P < 0.05/0.01），对肾功能具有一定的改善作用.

对胰岛功能指标的影响：由表2可见，与正常组比较，模型组小鼠血清空腹胰岛素（FINS）显著升高（P < 0.01）；与模型组比较，苯那普利及灯盏花胶囊各剂量组均能明显降低血清FINS水平（P < 0.05/0.01）.对胰岛功能可能有潜在的作用.

2.5 对肾脏组织病理学的影响

组织病理学检查结果显示，正常对照小鼠肾脏组织表面被膜由厚薄均匀的致密结缔组织构成；肾实质为浅层皮质和深层髓质，皮质髓质分界明显；皮质中肾小球分布均匀，肾小球中细胞数量以及基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则，髓质未见明显异常；泌尿小管之间结缔组织为肾间质，间质无明显增生；未见明显的炎性改变.模型组小鼠给予高糖高脂饲料喂饲24周后，见皮髓质交界处少量的肾小管上皮细胞呈颗粒变性，细胞肿胀，胞质疏松淡染；炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞呈空泡变性，胞质内可见体积较小的圆形空泡；肾小管、集合管轻度扩张，管腔形状不规则，上皮扁平化，表明DN模型制备成功.灯盏花胶囊3剂量组对DN小鼠的肾组织病变均有改善（图3）.

3 讨论与结语

中药配伍是中医用药的特色和优势，充分体现了中医的“整体观念”和“辨证论治”的精髓.灯盏花胶囊全方以灯盏花、薏苡仁、杜仲、黄芪为君，司活血泄浊、补肾健脾之职；仙灵脾、山药、苍术、生大黄辅助君药为臣，增强补肾固精、健脾益气、活血泄浊之功；千张纸、党参共为佐使.全方扶正祛邪并重，补虚泄实兼备，具有活血泄浊、补肾健脾之功效.李琦教授^［6］认为糖尿病肾病病情错杂，缠绵难愈，故其治疗关键在于分清主次，扶正和祛邪标本兼治，因此灯盏花胶囊在治疗糖尿病肾病有独特疗效.

现代药理研究^［7］表明灯盏花素可通过降低血液黏稠度、扩张血管，从而改善肾脏血流量，起到保护糖尿病肾组织肾小管功能，从而有效抑制DN的发生和发展.此外，临床研究^［8］报道，灯盏花素注射液可通过促进微循环、降低肾小球小动脉阻力，改善肾脏血流状态，缓解肾小动脉玻璃样变及肾小管间质纤维化，从而有效防止肾小球的硬化.薏苡仁提取物可提高髓样分化因子水平，明显改善肾功能，降低血糖水平，抑制IL - 6的表达，减轻肾脏纤维化和炎症；以及激活肾脏中的TGF和Toll样受体信号通路，减轻肾间质纤维化和肾小管上皮细胞凋亡，从而减少炎症因子的产生，保护肾功能^［9］.文献［10］报道，杜仲黄酮除对糖尿病小鼠具有明显降糖作用外，还可抑制胰腺细胞凋亡，其作用机制可能与调节胰腺组织中相关凋亡因子表达，减少炎症因子含量有关.此外，杜仲黄酮还可通过调节Nrf2/HO - 1信号通路，改善肾脏组织氧化应激状态，显著降低DN小鼠空腹血糖和改善肾功能^［11］.黄芪可显著降低DN大鼠的肾脏指数、24 h尿蛋白、血清及尿尿素氮和肌酐，提示其对肾脏起保护作用，可改善肾损害^［12］.黄茂甲苷可通过增加糖尿病小鼠肾脏AMPK磷酸化及自噬水平，进而缓解蛋白尿并减轻肾小球硬化^［13］.黄芪甲苷能有效改善DN的症状，其作用机制可能抑制PI3K/Akt/FoxO1信号通路，增加肾组织细胞自噬活性有关，减轻肾组织的损伤，从而减缓了DN的发展进程^［14］.现代药理研究^［15］证明，大黄对肾脏代谢具有明显的保护作用，大黄素具有促进系膜细胞的凋亡，抑制系膜细胞增殖和细胞外基质的分泌，从而抑制肾小球系膜过度肥大，治疗DN中的药理作用主要有减少DN小鼠的尿白蛋白、血清肌酐、血尿素氮^［16］.

采用灯盏花胶囊治疗8周，可明显降低高糖高脂饮食所致DN小鼠的FBG值，降低24 h尿蛋白及血清Cre、BUN、TG、TC、LDL及FINS，提高血清ALB水平，改善模型小鼠的肾脏组织病理形态，提示其对C57/BL6J小鼠早期DN具有一定的治疗作用.灯盏花胶囊可通过降血糖、血脂及胰岛素抵抗，修复肾小球 - 肾间质病变，减少尿蛋白生成，改善肾功能，从而延缓肾脏损害的进程.至于灯盏花胶囊对肾脏起保护作用的物质基础、配伍后的成分变化及作用机制仍有待于进一步研究.

参考文献

[1] 葛均波，徐永健，王晨.内科学［M］.北京：人民卫生出版社，2018.

[2] 杜义斌，李琦，张坤扬，等.云南灯盏花胶囊对慢性肾衰竭大鼠CTGF及Smad 7mRNA表达影响的研究［J］.环球中医药， 2014，7（9）：666 - 669.

[3] 杜义斌，吴晓，吴锋，等.云南灯盏花胶囊对慢性肾功能衰竭大鼠TGF - β₁与PAI - 1 mRNA 表达及肾功能的影响［J］. 上海中医药大学学报，2014，28（4）：70 - 73.

[4] 王志祥，杜义斌，段艳蕊，等.云南灯盏花胶囊治疗慢性肾功能衰竭60例临床研究［J］.云南中医中药杂志，2006，27（5）： 29 - 30.

[5] 刁俊玲，刘灵俪，杜鹃，等.新型PPARγ激动剂CMHX008对高脂饮食诱发的糖尿病肾病的改善作用［J］.中国药理学通报，2018，34（8）：1114 - 1119.

[6] 刘颖希，李琦.李琦教授扶正祛邪法治疗糖尿病肾病临床经验［J］.云南中医中药杂志，2017，38（6）：1 - 4.

[7] 邓丽萍，武红梅，龙爱梅.灯盏花素对糖尿病肾病大鼠肾组织肾小管超微结构的影响［J］.中国热带医学，2015，15（7）： 789 - 791.

[8] 焦彦辉.灯盏花素注射液用于糖尿病肾病80例临床疗效观察［J］.甘肃医药，2015，34（1）：33 - 35.

[9] 彭湘，陈丽，薛琳.薏苡仁提取物对糖尿病肾病大鼠肾功能的作用及机制研究［J］.中国现代医学杂志，2022，32（3）：10 - 15.

[10] 范春惠，张琳惠，郑妮，杜仲黄酮对 2 型糖尿病小鼠胰腺凋亡因子的影响［J］.吉林中医药，2022，42（1）：62 - 65.

[11] 许碧琪，戴燕青，傅倩云，等.杜仲黄酮对糖尿病肾病小鼠Nrf2/HO - 1氧化应激信号通路的影响［J］.吉林中医药，2020， 40（6）：788 - 791.

[12] 李书瑞，张绍义，关连颖，等.黄芪注射液对糖尿病对比剂肾病大鼠肾功能作用的研究［J］.中国中西医结合肾病杂志， 2017，18（2）：138 - 140.

[13] GUO H， WANG Y， ZHANG X， et al. Astragaloside IV protects against podocyte injury via SERCA2 - dependent ER stress reduction and AMPKα - regulated autophagy induction in streptozotocin - induced diabetic nephropathy［J］. Scientific reports， 2017，7（1）：6852.

[14] 马可可，鞠营辉，陈清青，等.黄芪甲苷对2型糖尿病肾病大鼠肾组织PI3K/Akt/FoxO1信号调控的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2019，25（2）：74 - 81.

[15] 纪孝伟，吴春玲，谭颖.白芍总苷及大黄素治疗糖尿病肾病的研究进展［J］.内蒙古中医药，2014，33（32）：77.

[16] 郝洁，梁艳，张瑞，等.大黄素改善糖脂代谢异常、糖尿病周围神经病变及糖尿病肾病的作用机制研究进展［J］.中药药理与临床，2020，36（3）：265 - 272.

基金资助

云南省科学技术厅 - 云南中医药大学应用基础研究联合专项资助(202001AZ070001-062)