复方南板蓝根片HPLC指纹图谱及多指标成分分析

HPLC fingerprint and simultaneous determination of multiple components in compound nanbanlangen tablets

摘要

采用高效液相色谱法（HPLC），同时测定秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸的质量分数，建立HPLC的指纹图谱，并结合化学模式识别对复方南板蓝根片质量进行整体评价.建立了11批复方南板蓝根片的HPLC指纹图谱，在13个共有峰中指认峰3为秦皮乙素，峰4为咖啡酸，峰8为菊苣酸，11批复方南板蓝根片相似度均大于0.900.秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸分离效果良好，在各自范围内线性关系良好（r ≥ 0.999 5），平均回收率分别为97.52%、99.80%和100.96%，对应的相对标准偏差（RSD）分别为1.15%、0.85%和1.32%.聚类分析将11批复方南板蓝根片分成2类和4类.方法操作简单、重复性好、灵敏度高、可靠性强，可为复方南板蓝根片的监督和检验工作提供参考依据.

Abstract

High performance liquid chromatography （HPLC） was used to simultaneously determine the mass fraction of cichorigenin， caffeic acid and cichoric acid， to establish the fingerprints of HPLC， and to combine with chemical pattern recognition for the overall evaluation of the quality of the compound nanbanlangen tablets. The HPLC fingerprints of the 11 batches of compound nanbanlangen tablets were established.Among the 13 common peaks， peak 3 was cichorigenin， peak 4 as caffeic acid， and peak 8 as cichoric acid， and the similarity of the 11 batches of compound nanbanlangen tablets was greater than 0.900. The separation of Cichorigenin， caffeic acid and cichoric acid was effective， with a good linear relationship within their respective ranges （r ≥ 0.999 5）. The average recovery rates were 97.52%， 99.80%， and 100.96%， and the corresponding relative standard deviations （RSD） were 1.15%， 0.85%， and 1.32%， respectively. Cluster analysis was performed to classify the 11 batches of compound nanbanlangen tablets into 2 and 4 categories. The method established was simple， reproducible， sensitive and reliable， which can provide a reference basis for the supervision and testing of the compound nanbanlangen tablets.

Graphical abstract

关键词

复方南板蓝根片 / 高效液相色谱法 / 指纹图谱 / 主成分分析 / 偏最小二乘判别分析

Key words

compound nanbanlangen tablets / high performance liquid chromatography / fingerprinting / principal component analysis / partial least squares discriminant analysis

复方南板蓝根片由南板蓝根、紫花地丁和蒲公英三味药组成，该现行质量标准仅有性状、鉴别项，无质量分数测定项目^［1-2］.高效液相色谱法（HPLC）法能够同时检测复方南板蓝根片中秦皮乙素和菊苣酸^［3］.此处，该法还可以应用于测定复方南板蓝根片中的其他成分，例如咖啡酸和靛蓝^［4-6］.目前，有关于应用HPLC在复方南板蓝根片质量控制方面的研究多集中在成分检测与定量分析.然而，有关该中药复方制剂在指纹图谱方面的研究尚未见报道.

鉴于复方南板蓝根片成分较多且复杂，中药复方制剂起效通常为多种成分共同作用的结果，仅通过单一成分质量分数或几个成分的质量分数测定难以全面反应其内在整体质量^［7］.指纹图谱是一种综合的、可量化的质量分析方法，与多个有效成分质量分数测定相互结合，能够与中药复方制剂的有效性高度关联，发挥整体、多元质控的优势，能更好地反映中药复方制剂的整体质量.近年来，中药指纹图谱技术与化学模式识别技术相结合，被广泛应用于中药复方制剂的质量控制.化学模式识别技术可通过对中药指纹图谱中所包含的大量信息进行提取和处理，揭示各数据间潜在规律，筛选出引起批次间差异的标志性成分^［8-9］.

本文采用HPLC法建立11批复方南板蓝根片样品的HPLC指纹图谱，并采用相似度与聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）及偏最小二乘判别分析（PLS - DA）化学计量学方法相结合对复方南板蓝根片进行综合评价.旨在为复方南板蓝根片的监督、检验工作提供科学、有效的参考.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Sartorius BP 211D十万分之一电子分析天平（赛托利斯公司）；AB204 - N型万分之一电子分析天平（梅特勒 - 托利多公司）；KQ - 250DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ULUP - I - 10T型纯水/超纯水机（西安优普仪器设备有限公司）；LC - 20AT型液相色谱仪（日本岛津公司）.

1.2 试剂

秦皮乙素对照品（批号：110741 - 202109，质量分数以96.0%计）；咖啡酸对照品（批号：110885 - 201703，质量分数以99.7%计）；菊苣酸对照品（批号：111752202105，质量分数以100%计）均购于中国食品药品检定研究院.甲醇（天津市康科德科技有限公司，批号：220711，色谱纯）、甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）、乙腈（天津市康科德科技有限公司，批号：220914，色谱纯）、磷酸（广州化学试剂厂，批号：20170201 - 1，分析纯）.复方南板蓝根片11批（220211、220325、220333、220342、220645均由云南通大生物药业有限公司（M公司）生产，2112029、2202004、2204010、2205011、2205014、2206014由广东省罗浮山白鹤制药厂（N公司）生产.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ACE Excel 5 Super C₁₈（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温为：30 ℃；检测波长为323 nm； 流动相为乙腈（Y） - 体积分数为0.2%磷酸水溶液（L），梯度洗脱具体如下：0 ~ 10 min，10% → 12% Y；10 ~ 20 min，12% → 15% Y；20 ~ 30 min，15% Y；30 ~ 45 min，15% → 30% Y；45 ~ 55 min，30% → 85% Y；55 ~ 60 min，85% → 95% Y；60 ~ 82 min，95% Y（涉及%的均为体积分数）；流速为1.0 mL/min；进样量：10 μL.

2.2 质量分数测定

2.2.1 混合对照溶液制备

精密称取秦皮乙素（15.84 mg）、咖啡酸（5.83 mg）和菊苣酸对照品（10.14 mg），分别置于10、20、50 mL容量量瓶中，用甲醇溶解配制对照品储备液.取上述3种储备液各1 mL，置于同一20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到混合对照品溶液.

2.2.2 供试品溶液制备

取复方南板蓝根片6片，研细后精密称取0.900 0 g，加入25 mL体积分数为5%甲酸甲醇溶液，称重后超声处理30 min，冷却至室温后再次称重，以上述甲酸甲酸溶液补足损失的重量，取续滤液为供试品溶液.

2.2.3 阴性样品溶液

按处方比例及工艺^［1］，分别制备缺蒲公英阴性、缺紫花地丁阴性、缺蒲公英和紫花地丁阴性，并按“2.2.2”节中制备成阴性样品溶液.

2.2.4 专属性试验

取混合对照品、供试品、缺蒲公英阴性、缺紫花地丁阴性、缺蒲公英和紫花地丁阴性，分别进样10 μL，按“2.1”节中的条件测定.供试品色谱中出现与秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸对照品保留时间相应的色谱峰，各目标色谱峰分离度良好，阴性无干扰（图1）.

2.2.5 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”节混合对照品溶液1、5、10、15、20和25 µL进样，进行线性拟合，秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸在相应范围内具有良好的线性（表1）.

2.2.6 精密度评估

取10 μL混合对照品溶液，连续6次进样，计算各对照品峰面积相对标准偏差（RSD）.秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸的RSD分别为0.14%、0.11%和0.13%.

2.2.7 稳定性评估

取批号为220211复方南板蓝根片样品，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定.不同时间点，秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸峰面积RSD分别为0.31%、0.35%和0.27%.

2.2.8 重复性试验

取批号为220211复方南板蓝根片样品，平行制备6份供试品溶液，分别进样，秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸平均质量分数分别为2.046 8、0.075 7和0.246 4 mg/g，对应的RSD分别为0.35%、0.54%和0.24%.

2.2.9 加样回收率试验

取批号为220211复方南板蓝根片样品（已知质量分数样品），各精密称取0.450 0 g，分别加入1.0 mL混合对照品溶液（含0.927 4 mg/mL秦皮乙素、0.033 8 mg/mL菊苣酸和0.112 5 mg/mL菊苣酸），制备供试品溶液进样测定，秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸平均加样回收率分别为97.52%、99.60%、100.96%，对应RSD分别为1.15%、0.86%和1.32%（表2）.

2.2.10 样品质量分数测定

复方南板蓝根片取自2个厂家的样品，制备成供试品后进样测定，各批次间秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸差异明显（表3）.

2.2.11 指纹图谱的建立及相似度评价

将11批复方南板蓝根片制备供试品溶液后进行测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以S1号图谱为参照图谱，采用中位数法，设置“时间窗宽度”为0.1 min，进行多点校正和目标（Marker）峰匹配，生成复方南板蓝根片标准指纹图谱（Std），共检测到13个共有峰（图2）.通过对照品比指认3、4和8号峰分别归属于为秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸.11批复方南板蓝根片的相似性均 > 0.900，指纹图谱能反映复方南板蓝根片的主要化学特征（表4）.

3 化学模式识别

3.1 聚类分析

以11批复方南板蓝根片中13个共有峰的峰面积为原始数据，基于SPSS26.0标准化处理后，以平方欧氏距离为测度，用组间数联接进行聚类分析.当分类距离为25时，11批样品可聚为2类，第1类均为M公司产品（S1 ~ S5），第2类均为N公司产品（S6 ~ S11）.当分类距离为10时，11批样品可聚为4类，S6 ~ S9、S11聚为第1类，S10聚为第2类，S1~S4聚为第3类，S5聚为第4类（图3）.

3.2 主成分分析

将11批复方南板蓝根片中13个共有峰的峰面积已SPSS26.0标准化处理后行因子分析，计算主成分的特征值、方差贡献率及主成分综合得分.以特征值大于0.8为标准进行因子抽取，并以累积方差贡献率大于85％为主成分提取的标准.样品所含3个主成分，特征值分别为9.718、1.651和0.933，累积方差贡献率分别为74.756％、87.456％和94.629％，可代表11批复方南板蓝根片样品中3个成分的大部分信息，具有较好的代表性（表5），各主成分因子载荷矩阵见表6.

根据文献［10 - 11］中的公式（1） ~ （5）获得主成分的线性表达式.

U_{\mathrm{i}}={\mathit{A}}_{\mathrm{i}}/\sqrt[]{{\lambda }_i}.（1）

Y_{\mathrm{1}}=U_{\mathrm{1}(\mathrm{1})}\times A_{\mathrm{1}}+U_{\mathrm{1}(\mathrm{2})}\times A_{\mathrm{2}}+\dots U_{\mathrm{1}(\mathrm{13})}\times A_{\mathrm{13}}.（2）

Y_{\mathrm{2}}=U_{\mathrm{2}(\mathrm{1})}\times A_{\mathrm{1}}+U_{\mathrm{2}(\mathrm{2})}\times A_{\mathrm{2}}+\dots U_{\mathrm{2}(\mathrm{13})}\times A_{\mathrm{13}}.（3）

Y_{\mathrm{3}}=U_{\mathrm{3}(\mathrm{1})}\times A_{\mathrm{1}}+U_{\mathrm{3}(\mathrm{2})}\times A_{\mathrm{2}}+\dots U_{\mathrm{3}(\mathrm{13})}\times A_{\mathrm{13}}.（4）

F=\mathrm{74.756}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{1}}+\mathrm{12.699}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{2}}+\mathrm{7.173}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{3}}.（5）

其中， A_i 为主成分因子矩阵；λ_i 为特征值；U_i 为主成分因子的系数；A为标准化处理后的峰面积；F为方差比例.

主成分1线性关系表达式：Y_{\mathrm{1}}=-\mathrm{0.300}{A}_{\mathrm{1}}-\mathrm{0.248}{A}_{\mathrm{2}}+\mathrm{0.299}{A}_{\mathrm{3}}+\mathrm{0.302}{A}_{\mathrm{4}}-\mathrm{0.117}{A}_{\mathrm{5}}+\mathrm{0.273}{A}_{\mathrm{6}}+\mathrm{0.289}{A}_{\mathrm{7}}+

\mathrm{0.204}{A}_{\mathrm{8}}+\mathrm{0.207}{A}_{\mathrm{9}}+\mathrm{0.315}{A}_{\mathrm{10}}+\mathrm{0.300}{A}_{\mathrm{11}}+\mathrm{0.311}{A}_{\mathrm{12}}+\mathrm{0.310}{A}_{\mathrm{13}}

主成分2线性关系表达式：Y_{\mathrm{2}}=-\mathrm{0.009}{A}_{\mathrm{1}}+\mathrm{0.472}{A}_{\mathrm{2}}-\mathrm{0.081}{A}_{\mathrm{3}}+\mathrm{0.086}{A}_{\mathrm{4}}+\mathrm{0.596}{A}_{\mathrm{5}}+\mathrm{0.349}{A}_{\mathrm{6}}+\mathrm{0.026}{A}_{\mathrm{7}}+

\mathrm{0.510}{A}_{\mathrm{8}}+\mathrm{0.017}{A}_{\mathrm{9}}+\mathrm{0.045}{A}_{\mathrm{10}}-\mathrm{0.138}{A}_{\mathrm{11}}+\mathrm{0.044}{A}_{\mathrm{12}}-\mathrm{0.048}{A}_{\mathrm{13}}

主成分3线性关系表达式：Y_{\mathrm{3}}=\mathrm{0.301}{A}_{\mathrm{1}}-\mathrm{0.030}{A}_{\mathrm{2}}+\mathrm{0.083}{A}_{\mathrm{3}}-\mathrm{0.196}{A}_{\mathrm{4}}+\mathrm{0.520}{A}_{\mathrm{5}}-\mathrm{0.107}{A}_{\mathrm{6}}-\mathrm{0.255}{A}_{\mathrm{7}}-

\mathrm{0.386}{A}_{\mathrm{8}}+\mathrm{0.448}{A}_{\mathrm{9}}+\mathrm{0.136}{A}_{\mathrm{10}}+\mathrm{0.300}{A}_{\mathrm{11}}+\mathrm{0.169}{A}_{\mathrm{12}}+\mathrm{0.310}{A}_{\mathrm{13}}

将主成分得分表达式与所对应的3个主成分的方差贡献率加权后，得到复方南板蓝根片质量综合评价函数的表达式为：Y=\mathrm{74.756}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{1}}+\mathrm{12.699}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{2}}+\mathrm{7.173}\mathrm{\%}{Y}_{\mathrm{3}}.以复方南板蓝根片13个共有峰的峰面积为评价指标，综合得分排名前五的均来自M公司，说明其产品质量较好（表7）.

3.3 偏最小二乘判别分析

采用SIMCA 14.1软件，以11批复方南板蓝根片指纹图谱共有峰面积为变量，建立PLS - DA模型^［12-13］，得到 X 矩阵解释率参数（X²_cum）为0.974，模型稳定性参数（Y²_cum）为0.962，预测能力参数（Q²）为0.917，均高于0.5，模型具有较好的解释率、稳定性及预测率.以200次随机排列置换检验验证模型有效性，R²回归直线在Y轴的截距为0.171，Q²回归直线在Y轴的截距为-0.341，均小于0.05，提示模型可靠且不存在过度拟合的现象.载荷散点图中峰3（秦皮乙素）、峰1、峰8（菊苣酸）、峰2、峰4距离原点较远，对样本区分作用较大（图4）.以变量重要性投影（variable importance in projection，VIP） > 1为标准，对影响复方南板蓝根片成分差异的标志性成分进行筛选，贡献较大的成分依次为峰3（秦皮乙素，VIP = 2.402）、峰1（VIP = 1.214）、峰8（菊苣酸，VIP = 1.213）、峰2（VIP = 1.021），见图5.

4 讨论

4.1 色谱条件的选择

对秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸进行全波长扫描.咖啡酸在323 nm处有最大吸收，且秦皮乙素与菊苣酸在该波长下，具有良好的吸收.因此，选择323 nm作为检测波长.咖啡酸与菊苣酸均为有机酸，在流动相中加入适量的磷酸可以抑制其电离，改善峰形^［4，14］.考察了不同流动相系统，包括甲醇 - 水、乙腈 - 水、乙腈 - 磷酸对色谱峰形的影响，结果表明使用乙腈-体积分数为0.2%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱时，色谱峰峰形稳定，基线较平稳.在选择流动相比例时，曾尝试采用乙腈-磷酸等度洗脱的方法同时分离测定秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸3种成分，结果发现各成分的分离度较差.后续参考梯度洗脱相关采用梯度洗脱的方法^［15-16］，设置梯度洗脱条件，结果发现色谱峰的数量较多但均较靠后且相互重叠，改进方法后色谱峰出峰时间提前并完全分离，达到分析要求.

4.2 提取条件的选择

本实验分别考察了甲醇、体积分数5%甲酸甲醇、不同的提取溶剂对各成分提取效果的影响，结果表明5%甲酸甲醇在相同情况下提取的效果更好.此外，比较了超声提取和加热回流2种提取工艺，结果表明2种提取方式对各色谱峰的影响均较小.为了方便操作，所以选择超声提取方法.同时不同提取时间对指标测定结果无明显差异，因此超声时间30 min即可满足检测要求.

4.3 结果分析

采用HPLC，同时测定复方南板蓝根片中秦皮乙素、咖啡酸和菊苣酸的质量分数.结果显示N公司生产的6个不同批次的复方南板蓝根片中，批号为2205014中菊苣酸的质量分数是其他5个批次的2 ~ 4倍，提示同一厂家的生产不同批次产品在质量方面存在一定差异，个别批次质量差异较大.此外，2个厂家生产的复方南板蓝根片产品中秦皮乙素、咖啡酸、菊苣酸成分的质量分数差异显著，有必要加强对该制剂产品中上述指标的质量控制.

为了进一步评价复方南板蓝根片样品质量，建立了复方南板蓝根片HPLC指纹图谱，确认了13个共有峰.通过与阴性对照图谱及对照品HPLC图谱的对比，对样品图谱中的部分色谱峰进行了归属.采用相似度评价、聚类分析、主成分分析及偏最小二乘判别分析多种指纹图谱评价方法，对复方南板蓝根片进行系统研究.相似度评价结果显示，2个厂家生产的复方南板蓝根片指纹图谱相似度均大于0.900，说明指纹图谱体现了复方南板蓝根片的共性特征.

通过聚类分析，11批复方南板蓝根片样品可分为2类和4类，结果表明相同厂家生产的不同批次复方南板蓝根片的质量存在差异，个别批次的质量差异较大.两厂之间生产的产品各成分质量分数相差较大，可能与原料药材的产地、生长年限、采收的时期及储存条件等因素有关，进而对制剂的质量产生较大影响.因此，在制剂生产过程中，需重点关注药材的质量，确保产品质量的稳定性和一致性.

采用主成分分析方法，对复方南板蓝根片HPLC指纹图谱中的13个共有峰进行综合分析，筛选出影响复方南板蓝根片质量的主成分因子，并通过综合得分对复方南板蓝根片的整体质量进行排名.通过偏最小二乘判别分析，筛选出以秦皮乙素为代表的4个贡献较大的成分，在日常质量控制中可考虑以秦皮乙素为代表的4个成分作为复方南板蓝根片的控制指标.

5 结语

通过建立指纹图谱及多指标成分分析的化学模式识别方法，对11批复方南板蓝根片质量进行综合评价.在指纹图谱13个共有峰中，指认峰3为秦皮乙素，峰4为咖啡酸，峰8为菊苣酸.聚类分析及主成分分析结果均显示不同厂家、不同批次复方南板蓝根质量存在一定差异.此外，采用偏最小二乘判别分析筛选出4个影响复方南板蓝根片成分差异的标志性成分，并对其中的秦皮乙素、菊苣酸及蒲公英的指标成分咖啡酸进行质量分数测定.结果显示不同厂家、不同批次间上述成分质量分数差异显著.因此，建议在修订复方南板蓝根片质量标准时，可考虑采用指纹图谱结合质量分数测定的方法以进行定性、定量分析，以加强对该药品的质量控制.

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基金资助

广东省药品监督管理局2022年科技创新项目(2022TDB34)

广东省药品监督管理局办公室2022年市县药品监管综合改革创新项目(ZG - DS - 2022018)