水杨酸和纳米氧化铈引发提高青稞耐旱性研究

Salicylic acid and CeO₂ - NPs priming improve drought resistance of Qingke barley

摘要

在模拟干旱胁迫下，以“长黑青稞”种子为实验材料，采用水杨酸（SA）和纳米氧化铈（CeO₂ - NPs）进行种子引发处理，通过种子发芽率、幼苗生长及生理生化指标，综合评估2种引发对青稞种子活力及幼苗生长的影响.结果表明，干旱胁迫下SA和CeO₂ - NPs引发提升种子活力指数，显著促进幼苗生长，具体表现为幼苗全长、根长、茎长和鲜重显著增加.并通过提高抗氧化酶活力，降低青稞幼苗内的氧自由基和丙二醛，从而有效缓解干旱胁迫对青稞幼苗造成的氧化损伤，增强青稞幼苗的抗旱性，促进青稞幼苗生长.通过隶属函数分析，SA引发的最适宜浓度为0.15 mmol/L，CeO₂ - NPs引发的最适宜质量浓度为50 mg/L.

Abstract

Under simulated drought stress， using "Changhei" Qingke seeds as the experimental material， seed priming treatments with different concentrations of salicylic acid （SA） and cerium oxide nanoparticles （CeO₂ - NPs） were applied. The effects of the two priming treatments on the seed vigor and seedling growth of Qingke were comprehensively evaluated through seed germination rate， seedling growth， and physiological and biochemical indicators. The results showed that under drought stress， SA and CeO₂ - NPs priming enhanced the seed vigor index and significantly promoted seedling growth， as evidenced by a significant increase in the total length， root length， stem length， and fresh weight of the seedlings. And by improving the antioxidant enzyme activity， the oxygen radicals and malondialdehyde contained in the Qingke seedlings were effectively reduced， so as to effectively alleviate the oxidative damage caused by drought stress on the Qingke seedlings， enhance the drought resistance of the Qingke seedlings， and promote the growth of the Qingke seedlings. The analysis of the affiliation function showed that the most suitable concentration of SA priming was 0.15 mmol/L and the most suitable mass concentration of CeO₂ - NPs priming was 50 mg/L.

Graphical abstract

关键词

干旱胁迫 / 种子活力 / 引发处理 / 纳米氧化铈 / 水杨酸

Key words

drought stress / seed vigor / seed priming / cerium oxide nanoparticles / salicylic acid

禾本科大麦属（Hordeum Linn.）是地球上的主食谷物和粮食作物^［1］，青藏高原地区的青稞（Hordeum vulgare var. coeleste L.）是其特有品种，主要栽培于海拔为3 000 ~ 4 000 m的西藏、青海、四川和云南等地^［2］.青稞富含β-葡聚糖，具有多种功能^［3-5］，可用于食用、饲用、酿造和医药等.近年来，青稞种植深受水资源匮乏的影响^［6-8］，因此，研究者重点开展抗旱型青稞品种培育及抗旱生物技术研发.彭玉琳等^［9］通过隶属函数聚类分析，提出高度抗旱、中度抗旱和敏感3类材料，为选育青稞抗旱材料提供理论依据.此外，研究者还从生理、生化和分子等方面开展了研究^［10］，但缺乏种子引发技术抗旱方面的研究.

1973年，Heydecker^［11］提出种子引发技术来解决干旱抑制种子萌发和幼苗生长问题.该技术使种子处于“萌而未发”的状态，能提高干旱胁迫下种子的活力和幼苗的抗旱性^［12］.作为一种经济且可持续的技术，它能提升作物发芽率、幼苗整齐度、田间表现和作物生产力^［13-15］.因此，用不同试剂进行种子预处理是作物抗旱管理中具有前景的研究领域.水杨酸（Salicylic acid， SA）引发处理能增强种子发芽能力和作物抗旱能力^［16-17］，而纳米氧化铈（CeO₂ - NPs）用于种子引发处理后，可加速种子萌发及幼苗生长、增强植物抗干旱、盐碱等非生物胁迫能力^［18-21］.但SA与CeO₂ - NPs引发处理对干旱胁迫下青稞种子的活力和幼苗生长的影响尚未见报道.为了青稞种子种业发展和产业高效生产提供理论指导和借鉴，利用PEG模拟干旱条件，探究了SA和CeO₂ - NPs引发对青稞种子活力和幼苗生长的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

青稞种子购自云南省迪庆藏族自治州香格里拉市，为香格里拉地方品种“长黑青稞”.用自封袋封口，室温下保存待用.

1.2 方法

1.2.1 种子引发处理

将颗粒饱满的青稞种子按料液比0.2 g/mL分别浸入不同浓度SA溶液（0.05、0.1、0.15和0.2 mmol/L，标记为SA - 0.05、SA - 0.1、SA - 0.15和SA - 0.2）和不同质量浓度CeO₂ - NPs溶液（50、100、200、400、600、800和1 000 mg/L，标记为CNP - 50、CNP - 100、CNP - 200、CNP - 400、CNP - 600、CNP - 800和CNP - 1 000）中.20 ℃条件下持续引发9 h，引发结束后用流水冲洗种子3 min并在室温下回干至原始重量.CeO₂ - NPs溶液采用超声波（100 W，40 kHZ）处理30 min制成^［22］.

1.2.2 种子发芽试验

采用12 × 12标准发芽盒滤纸法进行种子发芽试验.每个处理3盒，每盒100粒种子，每盒中放入滤纸两张并加入 PEG - 6000 （15 g/L）溶液10 mL.将各处理组的种子置于人工气候箱中，持续光照条件下20 ℃恒温连续培养.第3天开始每天向发芽盒中补充2 mL蒸馏水以保持发芽盒湿度，以种子“露白”为发芽标准.每日定时记录种子发芽数并在第7天结束发芽实验^［17］.按公式（1） ~ （4）计算发芽率（GR）、发芽势（GE）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）.

\mathrm{G}\mathrm{R}=({\mathrm{G}}_{\mathrm{7}}/n)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（1）

\mathrm{G}\mathrm{E}=({\mathrm{G}}_{\mathrm{4}}/n)\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（2）

\mathrm{G}\mathrm{I}=\sum ({\mathrm{G}}_t/{\mathrm{D}}_t).（3）

\mathrm{V}\mathrm{I}=\mathrm{G}\mathrm{I}/\mathrm{F}\mathrm{W}.（4）

式中，G₇为第7天种子发芽数；n为供试种子总数；G₄为第4天种子发芽数；G _t 为第t天的发芽数；D _t 为萌发第t天；FW为幼苗鲜重.

种子发芽实验结束后，当天测定各处理组青稞幼苗的鲜重、全长、根长，并计算茎长及根茎比.

1.3 幼苗生理指标测定

采用乙醇法测定青稞幼苗叶绿素和类胡萝卜素，考马斯亮蓝法测定幼苗氧自由基，硫代巴比妥酸法测定幼苗丙二醛（MDA），愈创木酚法测定幼苗过氧化物酶（POD）活力和索莱宝试剂盒测定幼苗过氧化氢酶（CAT）活力^［23-25］.

1.4 最适宜引发浓度筛选

采用公式（5）计算各引发处理的隶属函数及各处理组平均值，筛选出最佳引发处理的SA浓度和CeO₂ - NPs质量浓度^［9］.

X=(X-X_{min})/(X_{max}-X_{min}).（5）

式中，X为参试指标的测定值；X_max 和X_min 分别为该指标的最大值和最小值.

2 结果

2.1 引发处理对青稞种子萌发和活力指数的影响

在PEG模拟干旱胁迫条件下，所有引发处理均提高了青稞种子的萌发指标和活力指数.与对照（CK）相比，青稞种子的萌发指标变化并不显著.SA处理组中，SA - 0.05处理组青稞种子的发芽势（89.67%）和发芽率（89.67%）最高，SA - 0.15处理组发芽指数最高，为19.42（图1 a ~ c）.CeO₂ - NPs处理组中，CNP - 50处理组种子的发芽势、发芽率和发芽指数均为最高，分别是93 %、94 %和21（图1 a ~ c）.在所有处理组中，青稞种子的活力指数与CK相比均得到了极显著的提高，其中CeO₂ - NPs处理组的平均活力指数（3.24）高于SA处理组（2.96），见图1 d.

2.2 引发处理对青稞幼苗生长的影响

在PEG模拟干旱胁迫条件下，所有处理组的青稞幼苗全长、根长、茎长和幼苗鲜重与CK相比均显著增加.SA - 0.15和CNP - 800处理组全长和茎长增幅最大（图2 a ~ b），SA - 0.05和CNP-800处理组根长增幅最大（图2 c），SA - 0.15和CNP - 200处理组幼苗鲜重增幅最大（图2 e）.从整体而言，CeO₂ - NPs处理组各项幼苗生长指标优于SA处理组.与CK相比，经SA与CeO₂ - NPs引发处理后，青稞幼苗的根茎比例均有不同程度的下降，但各处理组之间的差异并不显著（图2 d）.

2.3 引发处理对青稞幼苗叶绿素和类胡萝卜素的影响

整体上，SA和CeO₂ - NPs引发增加了叶绿素b，但并没有引起叶绿素a、叶绿素总量和类胡萝卜素的明显变化（图3）.SA处理组中，与CK相比，SA - 0.2处理明显降低了青稞幼苗叶绿素（图3 a ~ c）.但SA - 0.1处理组的总叶绿素与CK相比却有所增加，主要是叶绿素b增加所造成的（图3 b ~ c）.SA - 0.1处理组，青稞幼苗的类胡萝卜素也有所增加，但不明显（图3 d）.CeO₂ - NPs处理中，CNP-200处理组青稞幼苗叶绿素和类胡萝卜素明显增加（图3 a ~ d），且各处理组的叶绿素b与CK相比均呈现增长趋势（图3 b）.

2.4 引发处理对青稞幼苗抗氧化指标的影响

与CK相比，SA和CeO₂ - NPs引发均可极显著降低青稞幼苗中氧自由基，其中SA - 0.15和CNP - 200处理组分别是各自处理组中降幅最明显的（图4 a），且SA处理组平均降幅大于CeO₂ - NPs处理组.与CK相比，青稞幼苗中的MDA也显著降低，同样SA - 0.15和CNP - 200 2个处理组的降幅是最大的（图4 b）.SA和CeO₂ - NPs引发处理下，青稞幼苗的POD活力表现出不同的变化趋势.与CK相比，SA处理组中，除SA - 0.05处理组POD活力降低外，其余处理组的POD活力均增加（图4 c）.CeO₂ - NPs处理组中，除CNP - 50和CNP - 800 2个处理组POD活力提高外，其余处理组均呈现降低趋势，但变化并不显著（图4 c）.与POD活力变化不同，SA和CeO₂ - NPs引发处理均提高了青稞幼苗的CAT活力，且SA处理组的平均增幅大于CeO₂ - NPs处理组的（图4 d）.SA处理组中，随处理浓度增加CAT活力呈现先增加后降低的趋势，其中SA - 0.1处理组CAT活力最大.而CeO₂ - NPs处理组中，CAT活力随处理浓度整体呈现“V”字型变化趋势，CNP - 200处理组CAT活力增幅最小.

2.5 最适宜引发处理浓度筛选结果

以上结果显示，在干旱胁迫下，不同浓度SA和不同质量浓度CeO₂ - NPs引发处理对青稞种子和幼苗生长的影响不尽相同，有必要通过隶属函数计算判定最适宜引发处理的SA和CeO₂ - NPs.结果显示，不同处理组各指标隶属函数平均值从高到低依次为CNP - 50 > CNP-200 > CNP - 800 > CNP - 1 000 > CNP - 600 > CNP - 100 > SA - 0.15 > SA - 0.05 > CNP - 400 > SA - 0.2 > SA - 0.1（图5）.据此判定，SA处理组中，最适宜引发处理浓度为0.15 mmol/L；CeO₂ - NPs处理组中，最适宜引发处理质量浓度为50 mg/L.且根据隶属函数平均值顺序可知，后者效果整体优于前者.

3 讨论

干旱胁迫下，SA和CeO₂ - NPs处理组青稞种子的发芽指数、发芽势和发芽率有提高，但无明显差异；虽然种子活力指数显著提高，但从幼苗生长指标可知，这是幼苗鲜重差异显著造成的.即2种引发处理对青稞种子萌发的影响不明显，这与苏昀等^［26］的研究结果相一致.表明引发处理可能改善了种子的某些生理特性，如提高种子活力、增强幼苗的抗逆性，但这些改善可能并不直接转化为萌发率等种子萌发指标.另外，实验材料“长黑青稞”种子的初始质量和活力本身已经很高，使得引发处理的潜在益处不明显.SA和CeO₂ - NPs引发处理对青稞幼苗生长影响明显，并且是对根伸长和鲜重增加具有明显的促进作用.各处理组青稞幼苗的全长、根长和鲜重均有明显提高.但青稞幼苗的叶绿素和类胡萝卜素均无显著变化.因此，幼苗生长显著变化可能原因是干旱胁迫导致的损伤，主要是膜脂过氧化.SA和CeO₂ - NPs处理主要通过降低植物体自由基、减轻细胞膜脂过氧化、保护生物大分子、提高水分利用效率发挥作用^［27-28］.抗氧化指标分析也证明SA和CeO₂ - NPs引发处理可以降低青稞幼苗组织内MDA和氧自由基（ROS），显著提高干旱胁迫下青稞幼苗体内的POD和CAT酶的活力.这符合Aswathi等^［12］总结出的种子引发缓解干旱胁迫生理机制，即通过提高植物细胞内抗氧化酶数量及酶活力，快速清除细胞内过量ROS，将干旱胁迫对植物造成的氧化损伤降到最低.

隶属函数分析表明，SA处理组的整体效果不如CeO₂ - NPs处理组，表明2种试剂在植物生理和分子层面上具有不同的机制.结合本研究结果，幼苗生长的变化比种子萌发变化更显著，CeO₂ - NPs可能通过调节植物激素水平、增强抗氧化酶活性和改善养分吸收来提高植物的抗逆性^［21］.而SA以增强植物的抗氧化系统为主要机制^［29］，在干旱胁迫下，SA引发处理的抗氧化酶活力增幅大于CeO₂ - NPs引发处理.但除抗氧化指标外，其余实验测定指标结果并不一致，故二者在缓解青稞干旱胁迫的具体作用机制和长期影响仍需进一步研究.同时值得注意的是，MDA和POD变化并不显著.该结果与曾经的研究^［30-31］不一致，水杨酸处理后，甘青青兰和葡萄幼苗叶肉细胞MDA显著降低.这可能是由于采用引发处理的水杨酸浓度和纳米氧化铈的质量浓度、作物种子等有所差异而导致的.

4 结语

在PEG模拟干旱胁迫条件下，各浓度SA和各质量浓度CeO₂ - NPs引发均有效提高青稞种子活力指数，并极大促进青稞幼苗生长，幼苗全长、根长、茎长和鲜重均明显增加，但对总叶绿素和类胡萝卜素影响不显著.不同处理组均降低青稞幼苗氧自由基和MDA，除200和400 mg/L CeO₂ - NPs处理外，其余处理均显著提高了CAT活力，且SA处理组的增幅大于CeO₂ - NPs处理组.表明干旱胁迫下SA和CeO₂ - NPs通过增强CAT活性，降低氧自由基和MDA，有效减轻氧化损伤，从而促进青稞幼苗生长.隶属函数分析表明SA处理最佳引发浓度为0.15 mmol/L，CeO₂ - NPs处理最佳引发质量浓度为50 mg/L，且CeO₂ - NPs的整体效果优于SA.

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基金资助

云南省高层次人才培养支持计划项目(YNWR - QNBJ - 2020 - 287)

国家中医药管理局全国中医药管理局全国中药资源普查项目(GZY - KJS - 2018 - 004┫子课题)