MDM2通过P53/GPX4通路对结肠癌细胞铁死亡的影响

Effect of MDM2 on ferroptosis in colon cancer cells through the P53/GPX4 pathway

摘要

探讨MDM2表达水平对人结肠癌细胞铁死亡的影响.将MDM2 siRNA质粒和MDM2过表达质粒分别转染入结肠癌HCT116细胞，设置空白对照组、MDM2干扰对照组、MDM2干扰组、空载体对照组、MDM2过表达组；CCK8检测各组细胞增殖活性，试剂盒检测亚铁离子（Fe²⁺）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）浓度，免疫荧光检测活性氧（ROS）表达水平，Western blot和RT - qPCR分别检测MDM2、P53、GPX4、PTGS2蛋白和mRNA表达水平.与对照组比较，MDM2干扰后细胞中MDA、Fe²⁺浓度及ROS水平、P53和PTGS2 mRNA及蛋白表达均明显上升，GSH浓度、细胞增殖活性、MDM2和GPX4 mRNA及蛋白表达均明显降低；在MDM2过表达后细胞中MDA浓度、ROS水平、P53和PTGS2 mRNA及蛋白表达均明显下降，GSH浓度、细胞增殖活性、MDM2和GPX4 mRNA及蛋白表达均明显上升.MDM2可通过调控P53/GPX4信号通路，抑制人结肠癌细胞铁死亡.

Abstract

To investigate the effect of MDM2 expression on ferroptosis in colon cancer cells， MDM2 siRNA plasmid and MDM2 overexpression plasmid were transfected into colon cancer cells and the blank control group， empty vector control group， MDM2 interference control group， MDM2 interference group， and MDM2 overexpression group were established. The proliferative activity of cells in each group was detected by CCK8； Fe²⁺， GSH， MDA content in each group were detected using kit； ROS expression levels in cells from each group were assessed via immunofluorescence； Western blot and RT - qPCR were used to detect the expression levels of MDM2， P53， GPX4，and PTGS2 proteins and mRNAs Tespectively. Compared with the control groups， MDM2 interference significantly increased the levels of MDA， Fe²⁺， and ROS， as well as the p53 and PTGS2 mRNA/protein expression level， while it significantly decreased the levels of GSH， cell proliferation activity， and the MDM2 and GPX4 mRNA/protein expression.Conversely， MDM2 overexpression significantly decreased the levels of MDA and ROS， as well as the P53 and PTGS2 mRNA/protein expression level， while it significantly increased the levels of GSH， cell proliferation activity， and the MDM2 and GPX4 mRNA/protein expression level.MDM2 inhibits ferroptosis in human colon cancer cells by regulating the p53/GPX4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

MDM2 / P53/GPX4通路 / 结肠癌 / 铁死亡

Key words

MDM2 / P53/GPX4 pathway / colon cancer / ferroptosis

结直肠癌是具有居高不下的发病率与死亡率的常见消化道肿瘤，在2020年其全球新发190万例，死亡约93.5万例，发病率、死亡率分别居恶性肿瘤第三位和第二位^［1-2］.目前结直肠癌的治疗手段以手术、化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗为主，但受到适应症、毒副作用、耐药性等因素影响，预后仍不理想，其5年生存率仍低于50％^［3］.因此，深入探究结直肠癌的分子通路机制，探索新的有效治疗方法意义重大.

铁死亡是不同于坏死、凋亡、自噬的新型细胞死亡方式，近年来已成为肿瘤方向的研究热点^［4］.铁死亡受到多条细胞信号通路调控，其中谷氨酸/胱氨酸逆向转运体（System xc^-）/GPX4是重要的调控通路^［5］.System xc^-是重要的抗氧化体系，由SLC7A11和SLC3A2蛋白构成，其中SLC7A11蛋白是氨基酸转运的重要部分.P53蛋白通过抑制SLC7A11蛋白表达，导致GPX4蛋白失活，脂质过氧化堆积，促进铁死亡^［6-7］.MDM2是P53重要的负向调节因子，过表达MDM2可以促进P53蛋白的泛素化降解，并抑制其转录活性^［8-9］.研究^［10］显示，铁死亡诱导剂RSL3干预结肠癌细胞HCT116等后引起GPX4蛋白表达降低，活性氧（ROS）表达水平升高，导致结肠癌细胞铁死亡，表明铁死亡与结肠癌关系密切.铁死亡激活剂erastin可以增强人结肠腺癌耐顺铂细胞株LOVO/DDP对顺铂的敏感性；P53蛋白可能通过抑制SLC7A11、GPX4蛋白的表达，诱导人结肠腺癌耐顺铂细胞株LOVO/DDP铁死亡，增强其对顺铂的敏感性^［11］.结直肠癌组织中MDM2蛋白的阳性表达与临床分期、静脉侵袭、淋巴结及肝转移等肿瘤生物学行为密切相关^［12-13］.本文旨在从细胞水平探究MDM2表达对结肠癌细胞铁死亡的影响，MDM2与P53/GPX4信号通路在结肠癌中的关系，探讨MDM2在结肠癌铁死亡中的作用机制.

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器设备

HCT - 116结肠癌细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供；引物、pCDNA3.1（+）质粒、siRNA（small interfering RNA）均购自武汉四维加生物科技有限公司；质粒小提试剂盒购于江苏康为世纪生物科技股份有限公司；Lipofectamin 2000转染试剂购于美国Invitrogen公司；McCoy's 5A培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司；CCK - 8检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供的亚铁离子比色法测定试剂盒；南京建成生物工程研究所提供的丙二醛（MDA）测定试剂盒、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒；ROS测定试剂盒购于美国Sigma公司；SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒购于湖南艾科瑞生物工程有限公司；MDM2蛋白单克隆抗体购于英国Abcam公司；PierceTM Rapid Gold BCA Protein Assay Kit购于美国Thermo公司.

倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；正置荧光显微镜（上海徕卡仪器有限公司）；CO₂恒温培养箱（美国SHEL - LAB公司）；洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；酶标仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司）；凝胶成像仪（美国Bio - Rad公司）；荧光定量PCR仪（苏州莫纳生物科技有限公司）；转膜槽、电泳槽、电泳仪（北京六一仪器厂）.

1.2 <italic>MDM2</italic>基因敲减和过表达细胞模型制备

在37 ℃、体积分数为5% CO₂细胞培养箱内，采用McCoy's 5A培养基（含体积分数为1%青链霉素双抗、体积分数10%胎牛血清）进行HCT116结肠癌细胞培养.铺板密度按照每孔1 × 10⁵ ~ 5 × 10⁵个细胞进行.当细胞密度达到60% ~ 80%，即将MDM2 siRNA质粒（siRNA1、siRNA2、siRNA3）与阴性对照质粒，按照转染试剂说明书的实验步骤分别转染至HCT116结肠癌细胞内，依据转染后MDM2 mRNA表达水平，确定最优转染质粒（siRNA1）用于实验；同时将MDM2过表达pCDNA3.1（+）质粒、对照质粒，也按照转染试剂说明书的实验步骤分别转染至HCT116结肠癌细胞内.实验分成空白对照组（Control）、MDM2干扰对照组（siRNA - NC）、MDM2干扰组（siRNA - MDM2）、空载体对照组（Vector）、MDM2过表达组（Oe - MDM2）.

1.3 CCK8检测各组细胞增殖活性

细胞铺板后按照实验分组（Control、siRNA - NC、siRNA - MDM2、Vector、Oe - MDM2组），对siRNA - NC、siRNA - MDM2、Vector、Oe - MDM2组进行相应的质粒转染处理.各组均置于37 ℃、体积分数5% CO₂的培养箱内6 ~ 8 h.换新鲜完全培养基后继续培养48 h，弃去孔中的培养基，再用PBS轻柔清洗后，每孔加入含有体积分数为10%的CCK - 8的孵育液100 µL，充分混匀.在培养箱中孵育1 h后，运用酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度，依据吸光度（OD值）测算出细胞的活性.

1.4 试剂盒检测Fe²⁺、GSH、MDA浓度

收集各组标本后离心10 min，收集细胞上清，按照试剂盒说明书操作，运用比色法检测Fe²⁺、微板法检测GSH、TBA法检测MDA浓度.

1.5 免疫荧光检测ROS表达水平

在各组细胞爬片上滴加ROS染液，避光条件下37 ℃孵育30 min.脱色摇床上用PBS晃动洗涤3次，每次5 min.在室温避光条件下再滴入DAPI染液染核10 min，脱色摇床上用PBS晃动洗涤3次，每次5 min.爬片干后加入抗荧光淬灭封片剂，荧光显微镜观察采集图像，Image J软件测定荧光强度.

1.6 Western blot法检测MDM2、P53、GPX4、PTGS2蛋白的表达水平

RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入5 × 上样缓冲液，涡旋混匀，98 ℃加热10 min.配制质量分数5%的浓缩胶与质量分数10%的分离胶，灌胶，上样，SDS - PAGE蛋白电泳，转到PVDF膜，PVDF膜放于质量浓度5%脱脂奶粉内封闭并在脱色摇床上振荡1 h.在4 ℃条件下一抗孵育过夜，用TBST洗5次（5 min/次）.在37 ℃条件下二抗孵育1 h，TBST洗5次（5 min/次）、曝光显影后收集蛋白条带，Image J软件分析目标条带的灰度值.

1.7 RT - qPCR法检测<italic>MDM2</italic>、<italic>P53</italic>、<italic>GPX4</italic>、<italic>PTGS2</italic> mRNA的表达水平

按照Trizol法提取各组细胞总的RNA，根据反转录试剂盒说明书的实验步骤合成模板链cDNA，引物序列见表1.根据SYBR^® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒说明书的实验步骤进行检测，运用2^-ΔΔCT法测算MDM2、P53、GPX4、PTGS2 mRNA的表达水平.

1.8 统计学分析

使用统计软件进行数据分析，数据以平均值 ± 标准差（\overline{x} ± s）表示.两组数据比较使用t检验，多组数据比较选用单因素方差分析，P < 0.05表明差异具有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 <italic>MDM2</italic>对HCT116细胞增殖活性的影响

MDM2干扰组细胞增殖活性明显下降，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有明显差异（P < 0.001）.MDM2过表达组细胞增殖活性与空白对照组、空载体对照组比较均明显上升（P < 0.001），见图1.MDM2作为一种癌基因，在多种正常组织中都有表达，但在多种肿瘤中突变、扩增和过表达，参与肿瘤的发生、发展等.MDM2蛋白在结直肠癌中的表达明显高于正常组织，在低分化结直肠癌中的表达明显高于中、高分化的，在有淋巴结转移的结直肠癌中表达高于无淋巴结转移的，表明其参与结直肠癌的发生、发展和转移^［14］.本研究表明MDM2可促进人结肠癌HCT116细胞增殖.

2.2 <italic>MDM2</italic>对HCT116细胞GSH、MDA、Fe²⁺浓度的影响

MDM2干扰组细胞中MDA、Fe²⁺浓度明显上升，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有显著性差异（P < 0.001）；而细胞的GSH浓度明显下降，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有显著性差异（P <0.001）.MDM2过表达组细胞中MDA浓度明显下降，与空白对照组、空载体对照组比较均有显著性差异（P <0.001）；Fe²⁺浓度下降，但与空白对照组、空载体对照组比较均没有显著性差异（P > 0.05）；而细胞的GSH浓度明显上升，与空白对照组、空载体对照组比较均有显著性差异（P < 0.001）（图2）.在Fe²⁺离子参与下，铁依赖性脂质过氧化，ROS、MDA大量堆积，诱导细胞铁死亡^［15-16］.GSH是重要的抗氧化剂，能通过抗脂质过氧化而抑制细胞铁死亡；GSH减少将影响氧化还原平衡，引起ROS堆积，导致细胞铁死亡^［17-18］.本文表明MDM2可抑制人结肠癌HCT116细胞铁死亡.

2.3 <italic>MDM2</italic>对HCT116细胞ROS水平的影响

MDM2干扰组细胞中ROS水平明显上升，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有显著性差异（P < 0.001）；MDM2过表达组细胞中ROS水平明显下降，与空白对照组（P < 0.01）、空载体对照组（P < 0.05）比较均有显著性差异（图3）.研究表明MDM2抑制HCT116细胞ROS的产生.

2.4 <italic>MDM2</italic>对HCT116细胞P53、GPX4、PTGS2蛋白表达的影响

MDM2干扰组细胞中P53蛋白、铁死亡标志基因PTGS2蛋白表达明显升高，而细胞的MDM2、GPX4蛋白表达明显下降，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有显著性差异（P < 0.001）.MDM2过表达组细胞中P53蛋白（P < 0.001）、铁死亡标志基因PTGS2蛋白（P < 0.01）蛋白表达明显下降，而细胞的MDM2、GPX4蛋白表达明显升高（P < 0.001），与空白对照组、空载体对照组比较均有显著性差异（图4 ~ 5）.P53作为重要的抑癌基因之一，其与MDM2存在经典的负反馈效应.MDM2蛋白与P53蛋白结合，能抑制P53转录活性并通过E3泛素化连接酶将P53蛋白降解，促进肿瘤发生^［19-20］.SLC7A11蛋白是System xc^-的主要组成部分，在氨基酸转运中起到关键作用^［21-22］.GPX4蛋白作用于底物GSH，减少ROS堆积在细胞中，抑制铁死亡^［23］.研究^［24-25］发现，P53活化后与SLC7A11的启动子区结合，抑制SLC7A11的转录和表达，影响胱氨酸的摄取，调节GPX4蛋白的表达，减少GSH的合成，导致ROS堆积，诱导细胞铁死亡.上述结果表明，MDM2可通过下调P53蛋白的表达，上调GPX4蛋白的表达，抑制人结肠癌HCT116细胞铁死亡.

2.5 <italic>MDM2</italic>对HCT116细胞<italic>P53</italic>、<italic>GPX4</italic>、<italic>PTGS2</italic> mRNA表达的影响

MDM2干扰组细胞中P53（P < 0.001）、铁死亡标志基因PTGS2（P < 0.01）mRNA表达明显升高，而细胞的MDM2（P < 0.001）、GPX4（P < 0.05）mRNA表达明显下降，与空白对照组、MDM2干扰对照组比较均有显著性差异；MDM2过表达组细胞中P53（P < 0.01）、铁死亡标志基因PTGS2（P < 0.05）mRNA表达明显下降，而细胞的MDM2、GPX4 mRNA表达明显升高（P < 0.001），与空白对照组、空载体对照组比较均有显著性差异（图6）.本研究表明MDM2可通过下调P53 mRNA的表达，上调GPX4 mRNA的表达，抑制人结肠癌HCT116细胞铁死亡.

3 结语

为探讨MDM2表达水平对人结肠癌细胞铁死亡的影响，经过制备MDM2基因敲减和过表达细胞模型，设置空白对照组、MDM2干扰对照组、MDM2干扰组、空载体对照组、MDM2过表达组；通过CCK8检测各组细胞增殖活性，试剂盒检测Fe²⁺、GSH、MDA浓度，免疫荧光检测ROS表达水平，Western blot和RT - qPCR分别检测MDM2、P53、GPX4、PTGS2蛋白和mRNA表达水平.结果表明MDM2可促进人结肠癌HCT116细胞增殖，抑制人结肠癌HCT116细胞铁死亡，并且可下调P53和上调GPX4的蛋白、mRNA表达水平，初步验证了MDM2可调节P53/GPX4信号通路，从而抑制人结肠癌HCT116细胞铁死亡.本文从体外细胞实验考察了MDM2通过P53/GPX4信号通路对人结肠癌细胞铁死亡的影响，后续需要通过体内动物实验进一步验证.上述结果为抗结肠癌的药物研究提供了实验依据和研究方向.

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基金资助

湖北省自然科学基金(2023AFB868)