结合天然药物化学实验教学的实习课题设计与探索

Design and exploration of internship project combined with experimental teaching of Natural Medicinal Chemistry： extraction and activity study of total flavonoids of Artemisia argyi leaves as an example

摘要

药物成分提取是天然药物化学实验教学的一部分，是基于药物成分性质了解的实验.基于本科生天然药物葛根总黄酮提取的实验教学，开展了艾叶总黄酮的双水相超声提取.与本科生实验教学相比，本研究优化了总黄酮的提取工艺，采用了新型的提取方法.通过该实习课题，实现了科研与教学的深度融合，进一步将天然药物化学与分析化学、药理学等专业知识的融会贯通，达到了学以致用的效果，且提高了实习生独立思考、创新思维以及积极参与科研的兴趣.

Abstract

Drug component extraction is an integral part of Natural Medicinal Chemistry experimental teaching， which is an experiment based on understanding the nature of drug components. In this paper， the dual - phase aqueous ultrasonic extraction of total flavonoids of Artemisia argyi leaves was carried out based on the experimental teaching of total flavonoids extraction of natural drug Puerariae lobatae Radix for undergraduate students. Compared with the experimental teaching of undergraduate students， this study optimizes the extraction process of total flavonoids and adopts a novel extraction method. Through this internship project， the integration of research and teaching was cleverly realized， and the professional knowledge of natural medicinal chemistry and analytical chemistry and pharmacology was better integrated， which achieved the effect of applying the learning to the application and increased the interest of the interns in independent thinking， innovative thinking and active participation in research.

Graphical abstract

关键词

实验教学 / 实习课题 / 艾叶 / 总黄酮 / 双水相

Key words

experimental teaching / internship project / teaching design / Artemisia argyi leaves / flavonoids / double water phase system

湖北医药学院药学专业2022年获批国家级一流本科专业建设点，学生的培养立足湖北、辐射鄂豫陕渝毗邻地区，面向基层、强化应用，培养能够适应区域生物医药产业发展需求，具备创新精神和实践能力，能够提供优质药学服务、解决生产实际问题的高素质应用型药学专门人才.学生完成三年的专业学习后，进入为期45周的实习阶段，即实习教学阶段^［1］，要求学生在实习期间，在带教老师指导下，通过查阅文献，设计实验方案，开展研究，完成一篇实验研究型的毕业论文.得益于学院大力推行的“导师制”，本科生能够有机会进行科研训练，使创新意识和能力得到提高.

天然药物化学是药学专业实践性很强的专业必修课程，其中实验教学是该课程的重要组成部分，承担着培养学生运用专业知识的能力以及严谨认真的科研态度、培养大学生科研思维、创新意识和能力的重任，是培养药学人才的重要阶段^［2］.天然药物化学实验大纲要求学生能根据有效成分或有效部位的性质、特点，设计合理有效的提取方法，将其从天然药物中提取出来，以利于后续的分离和鉴别.为满足教学大纲中药学专业人才培养的创新性和应用性的要求，本实习课题基于我校天然药物化学实验教学中“葛根中黄酮类的提取”等实践中掌握的技能，并结合文献报道，采用双水相辅助的方法对艾叶中总黄酮进行超声提取，响应面法优化其提取工艺，并对此提取条件下的黄酮进行了抗氧化活性的研究，是天然药物实验教学的应用与延伸.

1 实习课题设计

艾叶主要含有（挥发油、黄酮类、多糖类、生物碱、微量元素^［3］等成分，其中的黄酮类化合物在乙醇中具有较好的溶解性，具有抗氧化特性、抗癌、抗菌、抗病毒等多种药理作用和药效^［4］，它在人类许多疾病中都有应用价值.

基于湖北医药学院天然药物化学实验教学大纲（见表1）及实践过程，结合艾叶中黄酮类成分的性质，设计了艾叶总黄酮提取工艺优化的实习课题，具体设计过程见表2.

在实习课题开展过程中，带教老师通过社交软件将任务发放至实验室的实习人员，由实验室负责人组织大家讨论科研任务，并根据各实习人员的专业特长分派任务.实习人员积极主动地通过网络（知网、万方、百度、校图书馆、PubMed等）查阅相关资源、然后提交详细的实验方案，并对实验中可能遇到的问题写出详尽的解决方案.带教老师组织组织实习学生探讨方案，提出问题，并对方案进行修改，线下实践操作.具体线上线下实习教学的设计如下.

2 开展课题

2.1 实验原理

分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大，硫酸铵和乙醇以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相.双水相萃取技术是一种条件温和且绿色环保的液 - 萃取分离技术.在黄酮^［5］、生物碱^［6］、皂苷^［7］、挥发油^［8］等物质的提取和分析中应用广泛，根据其组成成分不同可分为离子液体双水相、聚合物双水相、小分子双水相.小分子双水相以无机盐代替高聚物，具有体系简单、价格低廉等优点，使双水相萃取工业化成为可能.超声提取法利用超声波的“空化作用”，破坏植物组织的细胞，利于细胞内成分和溶剂的相互渗透，促进成分的溶出.具有操作简单、能耗低、提取时间短等优点.超声波辅助双水相技术提取药物成分，可有效提高提取效率.

2.2 试剂或材料

艾叶（2021年购自于中国河南省桐柏县），芦丁（四川省维克奇生物科技有限公司）；3 - 乙基苯并噻唑啉（ABTS）和1，1 - 二苯基 - 2 - 三硝基苯肼（DPPH）（上海宝曼生物科技有限公司），硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）.

2.3 仪器与设备

TU - 1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ - 300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；QUINTIX124 - 1CN型分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；MBF20AX型粉碎机（温岭市迈邦机械设备有限公司），DHG - 9245A鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）.

2.4 实验步骤

2.4.1 原料的预处理

取艾叶，置于鼓风干燥箱内，50 ℃烘干.粉碎，过0.154 mm筛网，得艾叶粗粉，常温贮存备用.

2.4.2 标准曲线的绘制

1） 精密称取芦丁标准品0.010 5 g，以体积分数为65%的乙醇溶液进行溶解，然后移入50 mL容量瓶里，定容至刻度，即可得到芦丁标准溶液的质量浓度为0.210 0 mg/mL.

2） 准确量取上述标准液5.00 mL，置于10 mL容量瓶中，精确加入质量分数为5%的亚硝酸钠0.3 mL，摇匀后在常温下放置6 min；计时结束后，加入质量分数为10%的硝酸铝0.3 mL，摇匀后在常温下放置6 min；计时结束后，加入质量分数为4%的氢氧化钠4.0 mL，充分摇匀后在常温下放置15 min.计时结束后，以体积分数为65%乙醇做空白，紫外波长扫描范围为400 ~ 600 nm，即可得所需要的最大波长（508 nm）.

根据参照鲁宪坤等^［9］的方法，采用NaNO₂ - Al（NO₃）₃ - NaOH法进行吸光度测定.用移液管分别精密移取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL置于6个试管中，以上述加入试剂的方法显色，在最大波长508 nm处测定吸光度.以芦丁质量浓度（X）为横坐标，测得的吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线（图1），其标准曲线方程为A = 16.835X - 0.000 8（R² = 0.999 9），线性范围为0.010 5 ~ 0.052 5 mg/mL.

根据高向阳等^［10］的方法，先配制质量分数为40%的硫酸铵溶液，然后按照清 - 浊点辅助相图，制作双水相萃取系统相图（图2），以便更好地得到两相浓度范围.经回归分析得到成相点拟合曲线为Y = 4.959X² - 3.372 5X + 0.668 4，回归系数为R² = 0.999 2.据此相图来计算乙醇 - 硫酸铵双水相体系中，乙醇和硫酸铵两者所含的质量分数.

2.4.3 艾叶总黄酮（AATFs）的萃取及质量分数测定

在乙醇 - 硫酸铵两相水系统中，研究了上相的提取物，因为AATFs的极性较小，在上相中富集.称取艾叶粉末适量，本实验的取样量为0.499 5 ~ 0.500 5 g，置于具塞锥形瓶中，按照一定量的质量分数，加入乙醇适量，硫酸铵适量，超声提取30 min.提取结束，以3 000 r/min离心10 min后，提取上层以确定其质量分数.并按式（1）计算艾叶总黄酮提取率.

Y=\frac{C\times V\times n}{m\times \mathrm{1}\mathrm{000}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（1）

式中，Y为AATFs提取率，单位为%；C为上相质量浓度，单位为mg/mL；V为上相体积，单位为mL；n是提取液稀释倍数；m是所称取的艾叶质量，单位为g.

2.4.4 单因素实验

本试验采用超声辅助硫酸铵双水相提取AATFs.

（1） 乙醇质量分数的考察

在一定的超声条件下，提取温度和提取时间分别为40 ℃和30 min，硫酸铵质量分数为20%，液料比为40∶1 mL/g的提取条件下，研究提取液中乙醇质量分数分别为26%、28%、30%、32%、34%的5种质量分数条件下对AATFs提取率的影响.

（2） 硫酸铵质量分数的考察

在一定的超声条件下，提取温度和提取时间分别为40 ℃和30 min，乙醇质量分数为30%，液料比为40∶1 mL/g的提取条件下，研究提取液中硫酸铵质量分数分别为16%、18%、20%、22%、24%的5种质量分数条件下对AATFs提取率的影响.

（3） 液料比的考察

在一定的超声条件下，提取温度和提取时间分别为40 ℃ 和30 min，硫酸铵质量分数为20%，乙醇质量分数为30%，研究20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g 5个液料比对AATFs提取率的影响.

（4） 温度的考察

在一定的超声条件下，提取温度和提取时间分别为40 ℃和30 min，硫酸铵质量分数为20%，乙醇质量分数为30%，液料比为40∶1 mL/g的提取条件下，研究30、40、50、60、70 ℃ 5个不同温度对AATFs提取率的影响.

2.4.5 Box - Behnken响应面优化试验

依据单因素实验结果，选择以上3个对AATFs影响较大的因素，即乙醇质量分数（X₁）、硫酸铵质量分数（X₂）、液料比（X₃），以AATFs提取率为指标，进一步对乙醇硫酸铵双水相提取AATFs的提取工艺进行优化.响应面的因素及水平如表3所示.

2.4.6 体外抗氧化活性实验

1） DPPH自由基清除率实验

根据周晓红等^［11］的方法，并根据实验结果选取合适的质量浓度.将DPPH粉末用无水乙醇溶解，得到浓度为0.2 mmol/L的溶液.充分溶解后，避光保存.分别定量移取不同质量浓度的AATFs溶液和DPPH溶液2 mL，摇匀后开始计时，室温下置于黑暗处30 min，在517 nm处测量吸光度值.以维生素C（V_C）溶液为阳性对照，DPPH清除率按公式（2）计算.

\mathrm{D}\mathrm{P}\mathrm{P}\mathrm{H}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除率}=\mathrm{1}-\frac{A_{\mathrm{i}}-A_{\mathrm{X}}}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（2）

式中，A_i为2 mL不同质量浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg/mL）的AATFs和2 mL浓度为0.2 mmol/L 的DPPH混合液的吸光度；A_x为2 mL AATFs溶液和2 mL无水乙醇混合液的吸光度；A₀为2 mL无水乙醇和2 mL DPPH混合溶液的吸光度.

2） ABTS自由基清除率实验

根据尹明松等^［12］的方法，并根据实验结果选取合适的浓度.准确称取ABTS粉末0.038 4 g，放入10 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容.然后，精密称取过硫酸钾粉末0.013 4 g，放入10 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容.最后，将两溶液混匀，在室温下避光14 ~ 16 h，使两者充分反应以产生足够的ABTS自由基，临用前取1 mL混合液，用无水乙醇稀释20倍，控制吸光度在0.7左右.

分别定量移取不同质量浓度的AATFs提取液和ABTS混合溶液各2 mL，充分摇匀，将其置于室温下黑暗中反应30 min，并在734 nm处测量吸光度值.以V_C溶液为阳性对照，ABTS清除率按公式（3）计算.

\mathrm{A}\mathrm{B}\mathrm{T}\mathrm{S}\mathrm{自由}\mathrm{基清}\mathrm{除率}=\mathrm{1}-\frac{A_i^{\mathrm{\text{'}}}-A_{\mathrm{x}}^{\mathrm{\text{'}}}}{A_{\mathrm{0}}^{\mathrm{\text{'}}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}.（3）

式中，A{}_i^{\mathrm{\text{'}}}为2 mL不同质量浓度（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的AATFs溶液和2 mL ABTS混合溶液的吸光度；A_{\mathrm{x}}^{\mathrm{\text{'}}}为2 mL AATFs溶液和2 mL蒸馏水混合液的吸光度值；A_{\mathrm{0}}^{\mathrm{\text{'}}}为2 mL蒸馏水和2 mL ABTS混合溶液的吸光度值.

3 实践结果与讨论

为有效改善艾叶黄酮的提取率，采用Box - Behnken响应面对超声辅助乙醇 - 硫酸铵双水相提取方法的工艺进行优化，主要包括乙醇质量分数、硫酸铵质量分数、料液比、温度等对艾叶总黄酮提取率的影响.

3.1 单因素试验结果

所有的实验组均重复3次，且每一次提取结果均测定3次提取率.

3.1.1 乙醇质量分数对AATFs提取率的影响

由图3可以看出，在液料比、硫酸铵质量分数等条件相同的情况下，随着乙醇质量分数从26%增加到34%，AATFs的提取率先从6.10%升高到7.36%后降低到6.69%.当乙醇质量分数为30%时，AATFs的提取率达到该组实验最大值.这可能是由于在双水相体系中，随着乙醇质量分数的增加，上相的极性降低，更有利于总黄酮的浸出；极性过小时，脂溶性物质的溶解增加，总黄酮的溶解受到抑制.因此，AATFs提取时，乙醇质量分数为30%时，结果最佳.

3.1.2 硫酸铵质量分数对AATFs提取率的影响

由图4可以看出，在其他条件相同的情况下，硫酸铵质量分数为16% ~ 24%时，AATFs的提取率先从6.98%升高到7.51%后降低到7.07%，硫酸铵质量分数为20% ~ 22%时，AATFs的提取率在7.25% ~ 7.50%.随着整个体系中，硫酸铵质量分数的增加，水两相体系中水的质量分数相应降低，盐对水的竞争量也增加.体系中无机盐过多会影响总黄酮的浸出，导致硫酸铵溶解析出.因此，AATFs提取时，硫酸铵质量分数为20% ~ 22%时，结果最佳.

3.1.3 液料比对AATFs提取率的影响

由图5可以看出，在其他条件相同的情况下，随着液料比的增加，AATFs的提取率先从6.51%增大到7.26%后减小到5.77%.当液料比小于40∶1 mL/g时，较少的溶剂限制了AATFs的扩散；随着液料比的增加，细胞内外的浓度差增大，黄酮类化合物的总量继续向细胞外扩散.当液料比为40∶1 mL/g时，萃取率最高.随着提取溶剂的进一步增加，超声传质阻力增大，溶质扩散减慢，导致黄酮类化合物溶解不足，提取率低.在实际生产中，如果液料比过小，AATFs不能完全提取，会降低提取率；如果液料比过高，会造成原料的浪费，增加生产成本.因此，最适液料比为40∶1 mL/g.

3.1.4 温度对AATFs提取率的影响

试验结果表明，在其他条件相同的情况下，不同温度下提取AATFs，提取率为6.17% ~ 6.27%，所以不将温度作为响应面条件进行优化试验.

3.2 AATFs提取Box - Behnken响应面试验结果

3.2.1 回归模型的建立及数据方差分析

为了对AATFs的提取工艺进行优化，采用了响应面法.Box - Behnken响应面试验结果见表4.以AATFs的提取率（Y）为响应值，得到了乙醇质量分数（X₁）、硫酸铵质量分数（X₂）和料液比（X₃）与提取率的回归方程为：Y = 7.63 + 0.39 X₁ - 0.16 X₂ - 0.35 X₃ + 0.29 X₁X₂+0.28 X₁X₃ - 0.21 X₂X₃ - 0.87 X{}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{2}} - 0.57 X{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}} - 0.64 X{}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}}.

回归模型的方差分析见表5，从表5可知回归模型和失拟项的F值为62.50和5.61，回归项显著性检验的P < 0.000 1，表明二次回归模型显著；失拟项显著性检验的P为0.064 6 > 0.05，不显著，说明回归方程拟合度良好.表明模型可用于AATFs提取的分析和预测.

各因素对提取率的影响大小为X₁ > X₃ > X₂，方程的一次项X₂（硫酸铵质量分数）、交互项X₂X₃对AATFs提取率具显著影响（P < 0.05）.一次项乙醇质量分数（X₁）、料液比（X₃），交互项X₁ X₂（乙醇质量分数·硫酸铵质量分数）、X₁ X₃（乙醇质量分数·料液比），二次项X{}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{2}}、X{}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{2}}、X{}_{\mathrm{3}}^{\mathrm{2}}对AATFs提取率具有极显著影响（P < 0.01），说明因变量与自变量呈非线性关系.

3.2.2 响应面分析

交互作用对AATFs提取率影响的响应面图见图6.由图6可知，3个单因素水平都对AATFs提取率产生影响，先逐渐增大，达到最大值后，后逐渐降低.响应面曲线越陡峭，等高线形状向椭圆靠近，对提取率的影响越显著，乙醇质量分数与硫酸铵质量分数的交互作用以及乙醇质量分数与液固比的交互作用响应曲线图曲线较陡，等高线接近椭圆形，两者的相互作用对AATFs的提取率有显著影响.

3.2.3 提取工艺的验证

根据回归模型，可知AATFs的最优提取工艺为：乙醇质量分数30.36%，硫酸铵质量分数19.89%，液料比为37.69 mL/g，此条件下AATFs提取率预测值为7.71%.修正后最佳工艺为：乙醇质量分数30%，硫酸铵质量分数20%，液料比为38 mL/g，在此条件下，艾叶总黄酮提取率为（7.68 ± 0.18）%.

3.3 体外抗氧化活性研究

3.3.1 DPPH清除能力评价

AATFs提取液对DPPH自由基清除率的影响见图7.结果表明，AATFs对自由基的清除率随着浓度的升高逐渐增加，吸光度的大小与抗氧化性强弱有关，当样品质量浓度为0.05 mg/mL时，清除率为5.66%；当质量浓度增加到1.0 mg/mL时，清除率达到91.93%.比较两曲线可知，样品低浓度时，对DPPH自由基的清除率，弱于维生素C对DPPH自由基的清除率.随着AATFs样品的浓度增加，对DPPH的清除率也增加.采用非线性拟合方式得到IC₅₀，其IC₅₀为0.25 mg/mL，具备较好的DPPH自由基清除能力.

3.3.2 ABTS清除能力评价

AATFs提取液对ABTS清除率的影响见图8.结果表明，AATFs对ABTS自由基清除活性具有浓度依赖性，当样品质量浓度为0.05 mg/mL时，清除率为34.72%；当质量浓度增加到1.0 mg/mL时，清除率达到93.89%.比较两曲线可知，样品对ABTS自由基的清除率 < 维生素C对ABTS自由基的清除率.随着AATFs样品的质量浓度增加，对ABTS的清除率也增加.采用非线性拟合方式得到IC₅₀，其IC₅₀为0.125 mg/mL，具备较好的ABTS清除能力.

3.4 讨论

卫星星等^［13］通过正交试验，研究艾叶总黄酮的索氏提取过程，得到艾叶总黄酮的最优提取工艺，提取率高达3.85%.赵宏等^［14］采用正交试验法考察银杏叶总黄酮闪式提取工艺，得到最佳条件下的总黄酮提取率为1.99%.吴娜等^［15］采用中心组合试验法，对艾蒿总黄酮浸渍法提取工艺进行了优化，结果显示总黄酮的提取率最高为4.78%.而本研究确定了乙醇 - 硫酸铵双水相体系提取AATFs的最佳工艺：乙醇质量分数30%，硫酸铵质量分数20%，液料比为38 mL/g，温度为40 ℃.在此条件下，AATFs提取率为（7.68 ± 0.18）%，优于上述文献报道的提取率.

4 结语

本实习课题以天然药物化学实验为依托，采用双水相辅助超声法提取艾叶总黄酮，并验证了提取物的抗氧化活性，有效培养了学生的创新思维、科研能力和解决问题能力.近年来，本课题组以问题为导向，指导学生参与校企合作、创新创业等项目，完成了一系列天然活性组分（如延龄草多糖、景天三七多酚、槐米总黄酮、娑罗子七叶皂苷等）的提取工艺优化及活性研究.课题的实施作为本科生“导师制”与科教融合的成功实践，促进了师生间针对实验问题的积极探讨，提升了学生的科研创新能力，助力学生高质量完成毕业论文，也增强了其专业归属感.同时，教师将相关科研成果引入教学过程，引导学生研读文献、激发科研兴趣，实现了教学与科研的良性互动.

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基金资助

湖北本科高校省级教学改革研究项目(2024410)

湖北省高等教育学会教育科研课题(2024XD152)

十堰市科技局项目(24Y009)

湖北省教育科学规划2022年度课题(2022GB135)

湖北医药学院思政课程示范课程(202101)