瓜类细菌性果斑病RPA-CRISPR/Cas12a快速检测技术的建立及应用

摘要

瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB），是我国检疫性种传细菌病害，对西瓜甜瓜产业的健康发展造成严重危害，种子带菌检测对该病害的综合防控具有重要意义。针对该病害在简易实验室及田间快速检测的需求，本研究设计了西瓜噬酸菌特异性的重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA）引物和规则成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）crRNA，通过优化反应时间、温度、crRNA与LbCas12a蛋白浓度配比、荧光和试纸条报告分子浓度，构建了RPA-CRISPR/Cas12a快速检测方法。结果表明，该体系在39℃恒温条件下RPA扩增10 min,CRISPR/Cas12a在41℃孵育10 min，反应结束后通过蓝光照射或侧向流层析试纸条5 min即可肉眼直接观察检测结果。该检测技术特异性好、灵敏度高，相比蓝光照射，侧向流层析试纸条具有更高的灵敏度，其DNA最低检测量为0.000 1 pg·μL^-1，菌悬液最低检测量为1 CFU·mL^-1。该技术可直接对病组织研磨液和种子浸泡液进行检测，在实际种子样品检测中，当600粒健康种子样品中掺杂1粒带菌种子时，仍能检测到，满足了西甜瓜种子高通量检测的需求，为种子生产企业和农户的田间现场快速检测瓜类细菌性果斑病提供了技术支持。

关键词

瓜类细菌性果斑病 / 重组酶聚合酶等温扩增 / CRISPR / 检测技术

基金资助

国家重点研发计划（2023YFD1401200）; 新疆维吾尔自治区重大科技专项（2023A02009,2024A02007）; 国家西甜瓜产业技术体系（CARS-25）