穗花杉双黄酮通过抑制细胞焦亡减轻小鼠急性肺损伤

Amentoflavone alleviates acute lung injury in mice by inhibiting cell pyroptosis

摘要

目的 探究穗花杉双黄酮（AF）通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1轴介导的细胞焦亡减轻急性肺损伤（ALI）的机制。 方法 体内实验中，将60只BALB/c雌性小鼠随机分为对照组（Control组）、模型组（LPS组）、AF低剂量治疗组（LPS+AF-LD组）、AF中剂量治疗组（LPS+AF-MD组）、AF高剂量治疗组（LPS+AF-HD组），12只/组。灌胃给药0.5 h后气管滴注LPS造模，6 h后取材。体外细胞实验中，将RAW264.7细胞分为对照组（Control组）、模型组（LPS+ATP组）、AF治疗组（LPS+ATP+AF组）、焦亡抑制剂组（LPS+ATP+AC组）、联合处理组（LPS+ATP+AF+AC组），药物预处理2 h后进行造模、指标检测。HE染色法观察肺组织的病理改变，同时检测肺肿胀程度、BALF中蛋白水平、肺组织MPO水平。采用CCK-8法检测AF的细胞增殖毒性及对细胞活力的影响。ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平，通过免疫组化、免疫荧光、免疫印迹等方法检测NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1、GSDMD N等蛋白水平。 结果 在体内实验中，相较于LPS组，AF药物治疗能改善小鼠肺组织的病理损伤状态，改善肺肿胀程度，降低BALF中蛋白水平、肺组织MPO水平（P<0.01）。AF药物治疗抑制了NLRP3/ASC/Caspase-1轴的高表达（P<0.01），对于细胞焦亡的核心基因GSDMD N起到抑制效应（P<0.01），减少了细胞焦亡导致的IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等炎性因子释放（P<0.01）。在细胞实验中，通过细胞增殖毒性实验确定了AF的安全浓度，AF能够减少由于LPS+ATP刺激导致的细胞死亡（P<0.01），抑制NLRP3/ASC/Caspase-1轴的高表达，降低GSDMD N及炎症因子的表达水平（P<0.01）。焦亡抑制剂显示出与AF药物治疗类似的效果，而联合处理组的效果更加明显。 结论 AF可能通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1轴介导的细胞焦亡发挥减轻ALI的效应。

Abstract

Objective To investigate the effect of amentoflavone (AF) for alleviating lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) in mice and inhibiting NLRP3/ASC/Caspase-1 axis-mediated pyroptosis. Methods Female BALB/c mice were randomly divided into control group, LPS group, and AF treatment groups at low, moderate and high doses (n=12). ALI models were established by tracheal LPS instillation, and in AF treatment groups, AF was administered by gavage 30 min before LPS instillation. Six hours after LPS instillation, the mice were euthanized for examining lung tissue histopathological changes, protein levels in BALF, and MPO levels in the lung tissue. In the in vitro experiment, RAW264.7 cells were pretreated with AF, AC (a pyroptosis inhibitor), or their combination for 2 h before stimulation with LPS and ATP. The changes in cell proliferation and viability were detected using CCK-8 assay, and IL-1β, IL-6, IL-18, and TNF-α levels were determined with ELISA. Immunohistochemistry, immunofluorescence assay, and immunoblotting were used to detect the protein levels of NLRP3, ASC, cleaved caspase-1, and GSDMD N in rat lung tissues and the treated cells. Results In mice with LPS exposure, AF treatment significantly improved lung pathologies and edema, reduced protein levels in BALF and pulmonary MPO level, inhibited the high expression of NLRP3/ASC/Aspase-1 axis, reduced the expression of GSDMD N, and lowered the release of IL-1β, IL-6, IL-18, and TNF‑α. In RAW264.7 cells with LPS and ATP stimulation, AF pretreatment effectively reduced cell death, inhibited activation of the NLRP3/ASC/Aspase-1 axis, and reduced GSDMD N expression and the inflammatory factors. The pyroptosis inhibitor showed a similar effect to AF, and their combination produced more pronounced effects in RAW264.7 cells. Conclusion Amentoflavone can alleviate ALI in mice possibly by inhibiting NLRP3/ASC/Caspase-1 axis-mediated cell pyroptosis.

Graphical abstract

关键词

穗花杉双黄酮 / 急性肺损伤 / 细胞焦亡 / NLRP3/ASC/ Caspase-1轴

Key words

amentoflavone / acute lung injury / pyroptosis / NLRP3/ASC/Caspase-1 axis

急性肺损伤（ALI）是一种急性、持续性的肺部炎性损伤病理状态，在缺乏有效干预的情况下可进一步发展为更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），死亡率较高^{［1， 2］}。在目前的临床实践中，针对ALI的治疗主要以对症处理为主，包括机械通气、皮质类固醇药物治疗等，仍然缺乏特效药物^{［3， 4］}。促炎因子的释放在ALI病理发生发展过程中有着十分重要的作用。有研究表明，NOD样受体热蛋白结构域3（NLRP3）/凋亡相关斑点样蛋白（ASC）/半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）轴介导的细胞焦亡，能够诱导IL-1β、IL-18等炎症因子大量由胞内释放，是ALI/ARDS疾病进展的重要病理机制^［5］。同时，抑制NLRP3/ASC/ Caspase-1的激活或是细胞焦亡的高水平活化，可有效改善ALI/ARDS的病理状态^［6］。

穗花杉双黄酮（AF）是来源于卷柏科植物Selaginella moellendorfii Hieron卷柏的天然化合物，在传统医学中卷柏通常被认为具有清热解毒、止痛退热等功效，可用于肺炎、咳喘等病症的治疗^［7］。AF的药理作用近年来已被逐渐重视，前期研究表明AF具有抗炎、抗氧化等效应，同时对于肺损伤有较好的治疗作用^{［8， 9］}。但关于其减轻ALI的研究较少，且其作用机制是否与细胞焦亡有关尚未有文献报道。本研究以AF为干预药物，探究其是否能够通过NLRP3/ASC/ Caspase-1轴介导的细胞焦亡减轻LPS诱导的ALI病理状态。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只清洁级健康BALB/C雌性小鼠（6~8周）（斯贝福生物技术有限公司）， 动物许可证号： SCXK（京）2019-0010。本实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：No. IACUC-202404010）。

1.2 细胞系

小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）购自中国科学院细胞库，在含有10%胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，常规培养、传代。

1.3 药物

AF（C30H18O10，CAS No.1617-53-4，上海诗丹德标准技术服务有限公司），利用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成一定浓度的混悬液。

1.4 主要试剂

IL-1β抗体、Caspase-1抗体、GSDMD抗体（ABCAM），NLRP3、GSDMD N抗体（ABMART），ASC抗体、GAPDH抗体（CST），Cleaved Caspase-1抗体（MCE）。Caspase-1抑制剂（AC-YVAD-CMK，AC， Macklin），ELISA试剂盒（上海西唐生物科技公司），CCK-8试剂盒（东仁化学科技（上海）有限公司），DMEM细胞培养基（苏州沃美生物有限公司）。

1.5 主要仪器

CO₂培养箱（SANYO），酶标仪（Multiskan skyHigh，Thermo Fisher），电泳仪（PowerPac Basic，Bio-Rad），荧光定量PCR分析仪（LightCycler480，Roche），倒置显微镜（TS2，Nikon）。

1.6 方法

1.6.1 体内实验

将小鼠随机分为5组：对照组（Control组）、模型组（LPS组）、LPS+AF低剂量组（LPS+AF-LD组）、LPS+AF中剂量组（LPS+AF-MD组）、LPS+AF高剂量组（LPS+AF-HD组），12只/组。适应性饲养7 d，自由进食。之后参照文献［10］进行造模给药：除Control组、LPS组外，其他组小鼠给予AF（30、60、120 mg·kg^-1·d^-1）灌胃给药，Control组、LPS组给予相同体积的CMC-Na溶液。0.5 h后LPS组、AF组给予气管滴注LPS（5 mg/kg），Control组给予相同体积的0.9% NaCl溶液。6 h后处死取材（图1A）。

1.6.2 细胞增殖毒性实验

将对数生长期的RAW264.7细胞加入96孔板中，在37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中12 h，待细胞数量生长至约80%时，加入经11次梯度稀释后的AF全培溶液（0~50 μmol/L），继续孵育24 h。CCK-8方法检测细胞活性。

1.6.3 细胞造模及给药

根据研究报道^［11］，RAW264.7细胞构建炎性/焦亡细胞模型，选择1 g/mL LPS 24 h+5 mmol/L ATP 30 min的方案进行。将RAW264.7细胞悬液加入96孔板中，设置分组：对照组（Control组），模型组（LPS+ATP组），LPS+AF治疗组（LPS+ATP+AF组），焦亡抑制剂组（LPS+ATP+AC组），联合处理组（LPS+ATP+AF+AC组）。LPS+ATP+AC组与LPS+ATP+AF+AC组预先给予焦亡抑制剂AC处理（40 μmol/L，1 h ^［12］）。进行AF干预，依据细胞增殖毒性实验结果确定剂量为40 μmol/L。除Control、LPS+ATP组外，其余组给予药物处理2 h。之后更换新的培养基进行造模：1 g/mL LPS孵育24 h，5 mmol/L ATP 孵育30 min，最后收集样本检测。

1.6.4 细胞活力检测

采用CCK-8法进行细胞活性检测。每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续在培养箱中孵育1 h，酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，计算细胞活力。

1.6.5 肺组织病理切片制备观察及评分

收集各组小鼠右上肺小叶，经4%多聚甲醛溶液固定，脱水石蜡包埋，制片，HE染色、阅片。根据肺组织损伤的严重程度进行评分，主要关注肺实变、炎性细胞浸润等方面，肺损伤的严重程度由正常、轻度、中度至重度分别评分0~3分。

1.6.6 肺肿胀程度评估

收集右下肺小叶在4 ℃预冷的生理盐水下洗净， 用滤纸吸干生理盐水后，置于天平上称重，记为肺湿重。之后将肺置于65 ℃干燥箱中36 h，再次称重并记为肺干重。根据肺湿重/干重的比值（W/D）评估肺组织肿胀程度。

1.6.7 检测肺泡灌洗液中蛋白水平及肺组织中MPO水平

收集到的肺泡灌洗液（BALF），采用BCA方法检测其中的蛋白水平。将标准品及BALF加入96孔板，再加入混合好的工作液，在37 ℃振荡仪中振荡0.5 h，之后测定吸光度A_{562 nm}，建立标曲，计算蛋白水平。根据试剂盒的说明，测定肺组织中髓过氧化物酶（MPO）水平。

1.6.8 qRT-PCR法检测炎症因子水平

对RAW264.7 细胞进行提取RNA，并利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度与含量。SYBR Green荧光法检测基因mRNA水平，qRT-PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，引物序列见表 1。

1.6.9 ELISA法检测炎症因子水平

检测小鼠血清、BALF、RAW264.7细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平。按ELISA试剂盒说明书对标准品进行分层次浓度稀释、加样孵育、一抗反应、抗体工作液及底物工作液反应。终止反应后测各孔吸光度A_{450 nm}。根据拟和方程，求结果数值。

1.6.10 免疫组化法检测肺组织中蛋白表达水平

取切片进行脱蜡水化、抗原修复、BSA封闭、一抗二抗孵育流程，辣根过氧化氢酶显色，复染，脱水封片后在显微镜观下察。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算，平均累计光密度（IOD）值作为免疫组化结果表达值。

1.6.11 免疫荧光法检测蛋白表达水平

与免疫组化类似，将切片进行脱蜡水化、抗原修复、BSA封闭、一抗二抗孵育。DAPI复染细胞核，再加入荧光淬灭剂，最后用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。结果的量化使用Image-Pro Plus 6.0软件分析。

1.6.12 Western blotting法检测蛋白表达水平

用RIPA+PMSF裂解目标肺组织或RAW264.7细胞，提取其中蛋白，BCA法测定浓度。电泳、并进行NLRP3（1∶1500）、ASC抗体（1：1000）、Caspase-1抗体（1∶1000）、Cleaved Caspase-1抗体（1∶500）、GSDMD抗体（ABCAM，1∶2000）、GSDMD N抗体（1∶1000）、GAPDH抗体（1∶1000）等一抗，及含辣根过氧化酶羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG（1∶5000）二抗反应，曝光。计算目标条带灰度值与内参灰度值之比。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，计量指标以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。每组实验至少重复3次。

2 结果

2.1 AF对肺组织病理改变的影响

肺组织病理改变及评分结果显示，与Control组相比，LPS组小鼠的肺组织炎性损伤较为明显，肺实变、炎性细胞浸润等病理学改变尤为突出；与LPS组相比，AF药物干预可改善肺组织炎性损伤，肺实变、炎性细胞浸润等明显减轻，病理学评分降低（P<0.01，图1B、C）。

2.2 AF对肺肿胀程度、肺泡灌洗液中蛋白水平及肺组织中MPO水平的影响

与Control组相比，LPS组W/D比值升高（P<0.01）；与LPS组相比，不同剂量的AF药物干预能降低肺组织的肿胀程度（P<0.01，图1D）。BALF中蛋白水平测定结果显示，AF药物干预能够以剂量依赖性的方式降低蛋白水平（P<0.01，图1E）。LPS的刺激能够促使肺组织大量释放MPO，而AF药物的干预在不同程度上抑制MPO的高水平状态（P<0.01，图1F）。

2.3 AF对血清、肺泡灌洗液中炎性因子水平的影响

小鼠血清及BALF中炎性因子的测定结果显示，LPS刺激能使小鼠血清及BALF中炎症因子水平升高（P<0.01），不同剂量AF药物干预后，炎症因子水平呈现不同程度的下降（P<0.01，图2A~H）。免疫组化测定结果同样显示，AF药物显著抑制炎性反应（P<0.01，图2I~J）。

2.4 AF对小鼠肺组织NLRP3、ASC蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示，与Control组相比，LPS组NLRP3、ASC蛋白表达水平升高（P<0.01）；与LPS组相比，AF药物干预后NLRP3、ASC的蛋白表达水平呈现不同程度的下降（P<0.01，图3A~D）。

2.5 AF对肺组织NLRP3/ASC/ Caspase-1轴及细胞焦亡水平的影响

免疫印迹结果显示，与Control组相比，LPS组的NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白水平升高（P<0.01）；与LPS组相比，AF组的蛋白水平呈下降趋势（P<0.01，图4A~D）。GSDMD N分析结果显示，LPS的刺激使焦亡核心蛋白GSDMD N水平升高（P<0.01），但在给予AF药物后下降（P<0.01，图4A、E）。

2.6 AF对RAW 264.7细胞增殖毒性及细胞活力的影响

细胞增殖毒性实验结果显示，在累计11个梯度浓度作用下，细胞活力受到不同程度的影响。在45 μmol/L的药物作用下，细胞活力降低（P<0.01，图5A）。因此，后续实验选择45 μmol/L作为药物干预浓度。

与Control组相比，LPS+ATP组构建的炎性/细胞焦亡模型组细胞的活力下降（P<0.01）；与LPS+ATP组相比，LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组细胞的活力升高（P<0.01）；与LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组比较，LPS+ATP+AF+AC组细胞活力升高（P<0.01，图5B）。

2.7 AF对RAW 264.7细胞炎性因子水平的影响

与Control组相比，LPS+ATP组炎性因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ自身及mRNA水平上升（P<0.01）；与LPS+ATP组相比，LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组炎性因子的高水平状态得以逆转（P<0.01）；与LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组比较，LPS+ATP+AF+AC组炎性因子水平更低（P<0.01，P<0.05，图5C~J）。

2.8 AF对RAW 264.7细胞NLRP3/ASC/ Caspase-1轴及细胞焦亡水平的影响

免疫印迹结果显示，与Control组相比，LPS+ATP组的NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白的水平升高（P<0.01）；与LPS+ATP组相比，LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组蛋白的高水平状态有下降趋势（P<0.01），尽管NLRP3蛋白的下降无统计学意义；与LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组比较，LPS+ATP+AF+AC组的NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1蛋白水平更低（P<0.01，P<0.05，图6A~D）。

对剪切状态的GSDMD N蛋白水平分析显示，与Control组相比，LPS+ATP组的GSDMD N蛋白水平升高（P<0.01）；与LPS+ATP组相比，LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组GSDMD N蛋白高水平状态被抑制（P<0.05）；与LPS+ATP+AF组、LPS+ATP+AC组比较，LPS+ATP+AF+AC组的GSDMD N蛋白水平降低（P<0.05，图6E）。

3 讨论

ALI与ARDS是数种疾病的严重并发症，如脓毒症、COVID-19感染、失血性休克、严重烧伤等^［13］。ALI的发生发展主要与炎症因子的过度表达相关，如IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子能够损伤肺血管内皮细胞，导致内皮细胞通透性的改变而引发弥漫性肺间质和肺泡腔水肿；诱导产生细胞间黏附因子，介导内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的黏附浸润；诱导激活中性粒细胞分泌大量炎性介质造成肺组织损伤等^{［14， 15］}。

本研究在LPS诱导的BALB/C小鼠模型上观察到，模型组小鼠肺组织炎性损伤明显，且有显著的肺组织肿胀，同时BALF中蛋白水平、MPO水平、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ等炎症因子水平升高。提示LPS诱导小鼠模型可引起显著的ALI病理状态，炎性反应明显。有研究表明^［16］，AF能够调控TLR4/NF-κB信号通路，进而抑制下游IL-1β、IL-6、TNF-ɑ等炎症因子，发挥减轻ALI的作用。Zong等^［17］研究显示，AF能够显著改善ALI大鼠的肺组织炎性损伤、减轻肺组织水肿，并通过抑制NF-κB p65活化途径降低IL-1β、TNF-α等炎性因子的高表达。本研究结果与上述报道类似，体内外实验结果显示：AF能够显著改善ALI的肺组织病理状态、减轻肺组织水肿，同时抑制BALF中蛋白水平、MPO水平，对于IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等炎症因子同样有显著抑制效应。

细胞焦亡与ALI有着密不可分的联系^［18］。焦亡主要由Caspase-1信号通路进行调控^［19］，即受上游分子调控而完成活化的Cleaved Caspase-1能发挥切割Gasdermin D蛋白两个结构域的效应，被释放的N端结构域能于胞膜聚集形成孔道（GSDMD Pore），导致胞质内容物的释放、细胞破裂死亡^［20-22］。此外，Cleaved Caspase-1还可剪切pro-IL-1β与pro-IL-18等炎性因子的前体使其成熟，从胞内释放从而引起更广泛的炎症反应^［23］。有研究显示^［24］，无论是在ARDS患者BALF中分离得到的肺泡巨噬细胞，或是LPS造模的肺泡巨噬细胞系MH-S模型中，均存在着明显的细胞焦亡现象：Cleaved Caspase-1、Cleaved GSDMD的表达以及IL-1β和IL-18的水平均明显升高。ɑ-麻油酸能够显著抑制细胞焦亡相关蛋白Cleaved Caspase-1、Cleaved GSDMD等的表达^［25］，从而发挥改善ALI/ARDS肺组织炎性损伤的效果。鉴于以上结果我们推测，AF对于ALI的改善与细胞焦亡之间存在关联。在体内/外实验中，我们检测了细胞焦亡核心蛋白GSDMD N的表达水平，结果显示，LPS的刺激能够显著上调GSDMD N的表达水平，而在给予AF治疗后，GSDMD N的水平呈现了明显的下降趋势。提示AF改善ALI的机制与细胞焦亡间可能存在关联。

作为诱导细胞焦亡的上游信号级联反应，NLRP3炎症小体信号通路的激活被认为与细胞焦亡间密切关联^［26］。在巨噬细胞在应对病原体侵袭时，病原相关分子模式等能够激活细胞的模式识别受体（如NLRP3等），能够招募接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、Caspase-1形成大分子复合物，同时Caspase-1被切割活化启动下游的细胞焦亡过程^{［27，28］}。有研究表明^［29］，在LPS刺激的MH-S细胞系中，NLRP3/ASC/Caspase-1轴的表达显著升高，且与焦亡之间存在正相关关系。为进一步明确AF减轻ALI是否与NLRP3/ASC/Caspase-1轴介导的细胞焦亡存在关联，我们在体外进行了靶向验证实验，采用选择性Caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk干预细胞，Ac-YVAD-cmk可特异性抑制Caspase-1活性，从而阻断其介导的焦亡信号通路。结果显示，LPS的刺激能够显著激活NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1的表达水平，而在AF药物干预后上述指标出现了不同程度的下降；与AF药物干预相比，抑制剂AC干预后出现与AF药物干预类似的结果，显示出NLRP3/ASC/Caspase-1轴在AF减轻ALI中可能的靶标效应关系；联合处理组的NLRP3/ASC/Caspase-1轴表达降低水平更加明显，即AF与AC的叠加效应，进一步佐证了AF药物与NLRP3/ASC/Caspase-1轴可能的靶向性关联。此外，焦亡核心蛋白GSDMD N水平的检测结果与上述类似。提示AF可能通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1轴及GSDMD N的表达，从而调控细胞焦亡表型发挥减轻ALI的效应。这与Shen等^［30］的研究结果类似，其报道了某中药复方能够靶向NLRP3/ASC蛋白进而发挥治疗肺部炎性损伤的确切效应。

综上所述，本研究表明AF在抑制NLRP3/ASC/ Caspase-1轴介导的细胞焦亡机制方面的显著特性，为AF药物减轻ALI提供了可靠的分子机制证据支持。AF能否介导其他ALI进程中所涉及到的分子机制还需进一步探究，以期为ALI的临床治疗提供更多可能。

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基金资助

河南省重点研发与推广专项（科技攻关）项目(242102310508)

河南省重点研发与推广专项（科技攻关）项目(252102310456)

2023年度河南省“双一流”创建学科中医学科学研究专项(HSRP-DFCTCM-2023)

河南中医药大学博士科研启动项目(00104311-2024-2-33)

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