铁过载诱导的小鼠肝纤维化过程影响巨噬细胞M2极化

Effects of liver fibrosis induced by iron overload on M2 polarization of macrophages in mice

摘要

目的 观察铁过载诱导的小鼠肝纤维化过程中肝内巨噬细胞极化的演变过程。 方法 选取32只6~8周龄C57BL/6小鼠，随机分为对照组（n=8）、模型组（n=24）。模型组每日给予外源性右旋糖酐铁（50 mg/kg）制作慢性铁过载诱导的小鼠肝纤维化模型，在造模第3、5、7周分别处死小鼠，随机分为模型第3、5、7周组，8只/组；对照组给予腹腔注射同等剂量的生理盐水。取小鼠肝脏组织进行Masson染色、Sirius Red染色及免疫组织化学染色观察各组小鼠纤维化程度。取血清进行生化分析及比色法检测ALT、AST等观察肝功能。检测血清铁、铁蛋白、肝脏总铁及肝脏亚铁水平观察小鼠肝脏铁过载情况。免疫荧光双标法检测iNOS⁺/F4/80⁺细胞、CD206⁺/F4/80⁺等细胞观察M1、M2型巨噬细胞比例及分布情况。Western blotting法检测Arg-1、iNOS等蛋白表达。ELISA法检测IL-6、IL-10、TNF-α等蛋白水平。RT-PCR法检测CD206 等蛋白mRNA表达。 结果 与对照组比较，各模型组小鼠汇管区纤维组织增生逐渐加重，肝小叶结构逐渐破坏，逐见假小叶形成。各模型组小鼠α-SMA、COL-1等蛋白表达呈造模时间依赖升高（P<0.01）。各模型组小鼠血清ALT、AST水平升高，血清铁、铁蛋白、肝脏总铁及亚铁含量均升高（P<0.01）。各模型组小鼠M1极化标志物IL-6、TNF-α、iNOS等蛋白表达升高（P<0.01），以第3周为最高。M2极化标志物IL-10、Arg-1蛋白及CD206 mRNA表达与对照组比较在第3周呈升高趋势（P<0.01），第5周、第7周呈下降趋势（P<0.01）。 结论 铁过载在各阶段诱导巨噬细胞M1极化增加，在肝纤维化早期可诱导巨噬细胞M2极化增加，而中晚期对M2极化具有负调节的作用。

Abstract

Objective To observe the evolution of intrahepatic macrophage polarization in mice with liver fibrosis induced by iron overload. Methods Thirty-two C57BL/6 mice (6-8 weeks) were randomized into control group (n=8) and liver fibrosis model group (n=24) induced by aidly intraperitoneal injection of iron dextran. At the 3rd, 5th, and 7th weeks of modeling, 8 mice in the model group were sacrificed for observing liver fibrosis using Masson, Sirius Red and immunohistochemical staining and detecting serum levels of ALT, AST and the levels of serum iron, ferritin, liver total Fe and ferrous Fe. iNOS⁺/F4/80⁺ cells and CD206⁺/F4/80⁺ cells were detected by double immunofluorescence assay to observe the proportion and distribution of M1 and M2 macrophages. The hepatic expressions of Arg-1, iNOS, IL-6, IL-10, and TNF‑α proteins were detected using Western blotting or ELISA, and the expression of CD206 mRNA was detected using RT-PCR. Results The mice in the model group showed gradual increase of fibrous tissue hyperplasia in the portal area over time, structural destruction of the hepatic lobules and formation of pseudolobules. With the passage of time during modeling, the rat models showed significantly increased hepatic expressions of α-SMA and COL-1, elevated serum levels of ALT, AST, Fe, ferritin, and increased liver total Fe and ferrous Fe levels. The expressions of M1 polarization markers IL-6, TNF‑α, and iNOS all increased with time and reached their peak levels at the 3rd week; The expressions of M2 polarization markers (IL-10 and Arg-1 proteins and CD206 mRNA) significantly increased in the 3rd week and but decreased in the 5th and 7th weeks. Conclusion Iron overload promotes M1 polarization of macrophages in mice. Liver fibrosis in the early stage promotes M2 polarization of macrophages but negatively regulate M2 polarization at later stages.

Graphical abstract

关键词

铁过载 / 右旋糖酐铁 / 肝纤维化 / 巨噬细胞极化

Key words

iron overload / iron dextran / liver fibrosis / macrophage polarization

肝脏血清铁及铁蛋白的升高提示肝铁过载，而肝脏铁代谢的紊乱直接或间接的导致肝细胞损伤，是肝纤维化及其他临床肝脏疾病发生发展的重要因素之一^［1］。巨噬细胞是参与肝纤维化形成过程的主要炎症细胞之一。在肝脏内，巨噬细胞主要有两种来源，其一是肝脏内固有的巨噬细胞，即库普弗细胞；其二是单核细胞源性的巨噬细胞^［2］。巨噬细胞的细胞功能与表型在不同条件下不尽相同，可活化分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，这一向两个极端活化的过程被称为巨噬细胞极化。其中，M1型巨噬细胞在肝脏损伤与炎症进展等方面起主要作用，而M2型巨噬细胞则在炎症消退、组织修复等方面起主要作用。因此，限制M1型巨噬细胞功能，同时或促进M2型巨噬细胞的极化，维持M1/M2平衡可作为减轻或逆转肝纤维化治疗策略之一。目前研究主要关注M1型巨噬细胞在肝纤维化发展过程中的影响，但对于肝巨噬细胞极化减缓肝纤维化发生发展的分子机制仍需更多研究阐明。过多的铁可直接激活肝脏内巨噬细胞，那么这是否意味着过多的铁是通过调控巨噬细胞的极化方向，打破巨噬细胞M1/M2极化平衡，促使其向促炎促纤维化方向转变？研究发现，在RAW264.7细胞系^{［3， 4］}、骨髓源性巨噬细胞系^［5］和THP-1细胞系^{［6， 7］}中，通过外源性铁补充，如柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、柠檬酸亚铁和纳米氧化铁，可促进M1标志物，如诱导型一氧化碳合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）-1β的表达，同时降低M2标志物如IL-10和甘露糖受体（CD206）的表达。体内实验也证实补充铁可以增强促炎巨噬细胞极化，如C57Bl6小鼠膳食铁过载导致肝脏巨噬细胞M1极化进而诱发肝纤维化^［8］。前期临床试验发现机体内铁蛋白的浓度与血清中IL-6、IL-12的含量有显著的相关性，IL-6与IL-12则是巨噬细胞M1极化的标志物^［2］，这也从临床角度阐明了铁过载与巨噬细胞的M1极化具有一定的相关性。然而，目前关于铁过载诱导巨噬细胞极化的相关机制仍不明确。本研究旨在在体内动物实验层面，深入分析整体情况下给予外源性铁剂所造成的铁过载程度不同对肝脏中巨噬细胞极化水平的影响，并为探索铁过载影响肝纤维化的作用机制提供新的理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

右旋糖酐铁（Sigma），Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），天狼星红染色试剂盒（北京雷根生物技术有限公司），苏木素-伊红染色试剂盒（湖南艾佳生物科技股份有限公司），免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物科技），辣根酶标记山羊抗鼠、兔IgG、β-actin抗体、Arg-1抗体（Cell Signaling Technology），ELISA试剂盒（R&D Systems），超敏ECL化学发光试剂盒（Millipore），RT-PCR试剂盒（TaKaRa），iNOS荧光抗体、I型胶原（COL-1）抗体、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、荧光抗体、F4/80荧光抗体、CD206荧光抗体、铁检测试剂盒（Abcam）。

1.2 实验动物

选用SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，6~8周龄，体质量18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养条件：饲养于上海市中医医院SPF级动物房。适应性饲养1周，保持12 h的昼夜节律，温度20~25 ℃，湿度40%~70%，保持环境安静，小鼠自由进食饮水。本研究所有动物实验均符合中国实验动物的国家标准，并由上海市中医医院动物伦理与福利委员会批准（伦理批号：2021019）。

1.3 模型制备

模型制作方法参照文献［7］进行，每日予腹腔注射50 mg/kg右旋糖酐铁，对照组予腹腔注射同等剂量的生理盐水。在造模第3、5、7周末处死小鼠，取肝组织一部分用4%多聚甲醛固定后用于石蜡切片的制作，一部分放入组织保存液中用于流式细胞术分选肝脏巨噬细胞等实验，一部分置入-80 ℃冰箱长期储存，用于后续实验。腹主动脉所获得的血液于常温3500 r/min离心10 min，取上层血清置于-20 ℃冰箱待检。

1.4 血清ALT、AST、SI、SF检测

收集小鼠血液，离心后吸取上清，将获得的血清样本用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清铁（SI）、血清铁蛋白（SF）水平。

1.5 肝脏病理组织学检测

肝组织以常规方法备制石蜡切片，经HE染色、Masson染色和Sirius Red染色，镜下观察各肝组织切片病理情况及肝纤维化程度，使用ImagePro Plus 软件对染色区域进行半定量分析，整理分析数据。

1.6 免疫组织化学检测α-SMA和COL-1

肝组织备制石蜡切片，脱蜡后加入2%山羊血清封闭30 min，孵育一抗（α-SMA 1∶400，COL-1 1∶500）过夜，孵育二抗2 h（1∶300），显色后复染、镜检。

1.7 免疫荧光双标检测M1/M2型巨噬细胞

蜡片切片进行脱水，山羊血清封闭30 min，孵育第一种一抗（F4/80 1∶500）、第二种一抗（CD206 1∶400或iNOS 1∶200）4 ℃ 过夜，孵育二抗（1∶300）室温避光50 min，DAPI复染、自发荧光淬灭、封片、镜检。

1.8 ELISA检测巨噬细胞M1/M2极化标志物

根据ELISA试剂盒说明书进行操作，倍比稀释标准品，分别加入100 μL/孔样品或不同浓度标准品，室温孵育2 h，洗板。随后孔板内加入100 μL的生物素化抗体，室温孵育1 h，洗板。在孔内加入100 μL的辣根过氧化物酶标记，室温避光孵育20 min，洗板。晾干后孔板内加入显色剂100 μL/孔，避光孵育20 min。然后加入终止液50 μL/孔，酶标仪测量A_{450 nm}值。根据吸光值绘制标准曲线，计算获取最终结果。

1.9 Western blotting检测Arg-1、iNOS表达

各组小鼠称取约100 mg肝组织，加入裂解缓冲液研磨充分裂解。进行BCA蛋白定量，计算待测样品蛋白的浓度，备制蛋白样本。使用雅酶PAGE凝胶快速制备试剂盒配置凝胶，按照说明书操作。随后进行电泳、转膜、5% BSA封闭、一抗（Arg-1、iNOS、β-actin为1∶1000）过夜孵育、二抗1 h（1∶10 000）孵育、显影。使用Image J软件进行条带灰度值分析。

1.10 肝脏总铁及亚铁离子检测

取10 µL铁标准溶液稀释于990 µL双蒸水中，备制标准溶液。依次稀释标准溶液，得到不同浓度标准品。取10 mg肝组织加入990 µL铁含量测定缓冲液，研磨取样。上样10 µL室温孵育30 min。加入铁探针100 µL/孔，避光孵育60 min，检测吸光度A_{593 nm}值，计算数据并得出实验结果。

1.11 RNA提取及RT-PCR检测CD206

10 mg肝组织研磨取上清，提取总RNA。吸取每组2 μL RNA样本，使用Nanodrop2000仪器检测RNA浓度。以20 μL反转录反应体系，反转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR扩增。引物由上海捷瑞生物有限公司设计合成（表1）。根据实验结果的基因的Ct值，采用2^-ΔΔCt的方法计算各目的基因的相对表达量。

1.12 统计学分析

采用SPSS26.0、ImageJ、GraphPad7.0和FlowJo 10.6.2软件对研究结果进行分析和绘图。Ishak评分资料采用ridit检验，其余数据资料进行正态性分布检验，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 右旋糖酐铁诱导的小鼠慢性铁过载肝脏病理组织学改变

2.1.1 Masson及Sirius Red染色

Masson及Sirius Red染色结果显示：对照组未见或见极少量的胶原纤维显色，随着造模时间的延长，胶原纤维的显色逐渐增加，分布区域也从开始的汇管区或小叶中央静脉周围逐渐向外延伸，显色面积逐渐扩大（图1、2）。

2.1.2 α-SMA及COL-1免疫组化染色

免疫组化结果显示：对照组见极少量的α-SMA阳性显色区域，主要分布在血管平滑肌，随着造模时间延长，α-SMA阳性显色区域逐步开始出现在胆管壁、汇管区周围、纤维间隔区，阳性显色面积逐渐增大，染色逐渐加深。COL-1在对照组未见，或仅见极少量的汇管区附近阳性显色，随着造模时间延长，COL-1阳性显色范围明显增加，染色亦逐渐加深，主要分布在汇管区和纤维间隔区域（图3、4）。

2.2 右旋糖酐铁诱导的慢性铁过载小鼠肝功能改变

与对照组比较，各模型组小鼠血清ALT、AST水平升高，差异有统计学意义（P<0.01），以第3周为最高，第5周为最低（图5）。

2.3 右旋糖酐铁诱导的小鼠慢性铁过载血清及肝脏铁相关指标改变

与对照组比较，各模型组小鼠血清铁、铁蛋白、肝脏总铁及亚铁含量均显著升高，且呈时间依赖性，差异有统计学意义（P<0.01，图6、7）。

2.4 右旋糖酐铁诱导的小鼠慢性铁过载肝脏巨噬细胞极化改变

2.4.1 肝脏巨噬细胞极化M1、M2标志物检测

M1极化标志物IL-6、TNF-α、iNOS蛋白表达在各模型组均较对照组升高（P<0.01），以第3周为最高。M2极化标志物如IL-10、Arg-1蛋白及CD206 mRNA表达与对照组比较在第3周呈升高趋势（P<0.01），第5周、第7周呈下降趋势（P<0.01）。在铁过载所致的慢性肝损伤初期，肝内M1、M2型巨噬细胞均升高，随着造模时间进一步延长，M1型巨噬细胞较早期有所下降，但仍高于正常，而M2型巨噬细胞则减少（图8）。

2.4.2 肝脏巨噬细胞极化免疫荧光检测

iNOS⁺/F4/80⁺细胞及CD206⁺/F4/80⁺细胞均主要分布在汇管区周围、肝小叶中央静脉附近及肝窦毛细血管区域。与对照组比较，模型组各组iNOS⁺/F4/80⁺细胞（M1型巨噬细胞）比率均升高，以第3周为最高（P<0.01）；CD206⁺/F4/80⁺细胞（M2型巨噬细胞）比率在造模第3周升高（P<0.01），第5、7周下降（P<0.01，图9~11）。

3 讨论

铁过载起始于Rappaport 1区的肝细胞，主要发生在肝细胞和肝巨噬细胞中。一旦巨噬细胞中同时出现铁过载，则肝纤维化发生不可避免^{［9， 10］}。研究表明，通过对63例血色病患者的相关检测发现，血清铁蛋白、肝铁含量越高或铁过载导致的氧化应激程度越严重，则肝细胞发生衰老的数量越多^［11］。铁过载发展至巨噬细胞后，可诱导其活化并合成释放促炎性细胞因子，对肝纤维化呈正向促进作用。肝脏铁浓度在一般情况下常低于35 μmol/g干重^［12］。而肝脏铁浓度>60 µmol/g被认为是HSC活化失控的阈值，一旦肝脏铁浓度>250 µmol/g，肝硬化的发生率接近100%。研究表明，过量的铁可通过促进HSC中胶原相关基因的表达诱发肝纤维化。同样，铁过载增加了大鼠TGF-β的表达^［13］，也可诱导小鼠肝脏胶原蛋白沉积^［14］，并促进小鼠的肝硬化。有研究发现，铁蛋白可与活化的HSCs细胞表面的增加的H-铁蛋白受体及转铁蛋白受体结合，促使α-SMA及COL-1的表达增加^［15-17］。因此，本研究将肝脏铁浓度作为铁过载程度的重要指标，结果显示，右旋糖酐铁诱导的慢性铁过载模型小鼠的血清铁、铁蛋白、肝脏总铁和亚铁含量含量均升高，且呈时间依赖性，符合其对肝纤维化的正向促进作用，且α-SMA及COL-1的表达也呈时间依赖性显著升高。

在正常条件下，铁是与巨噬细胞中的铁蛋白结合的^［18］。然而，在巨噬细胞极化过程中，铁稳态和铁调节基因的表达发生了显著变化，如在经典活化的M1型巨噬细胞中，编码铁调素和重钛铁蛋白的表达高度上调，而膜铁转运蛋白和铁调节蛋白1/2下调^{［19， 20］}。铁调节基因在极化巨噬细胞中的不同表达表明铁可能与巨噬细胞活化有关，但目前铁过载对肝脏巨噬细胞极化的影响罕见报道，现有研究多集中在细胞实验层面^［20］。因此，开展进一步体内实验来观察铁过载在整体情况在形成或促进肝纤维化过程中对巨噬细胞极化的影响意义重大。

本研究发现，铁过多也会影响巨噬细胞表型。本研究结果显示，在模型第3、5、7周，小鼠肝脏血清铁、铁蛋白、肝脏总铁及亚铁含量呈时间依赖性升高，提示铁过载模型的成功建立，此时，M1型巨噬细胞极化标志物IL-6、TNF-α、iNO等蛋白表达在各模型组均较对照组升高（P<0.01），在造模第3周诱导作用最强，随着炎症逐渐慢性化，M1巨噬细胞比例较第3周有所下降，提示铁过载在造模各阶段均可以诱导巨噬细胞M1极化增多。而M2型巨噬细胞极化标志物IL-10、CD206、Arg-1等蛋白表达与对照组比较在第3周呈升高趋势（P<0.01），第5周、第7周呈下降趋势（P<0.01），提示在铁过载所致的慢性肝损伤中后期，M2型巨噬细胞显著减少。研究表明，给予外源性铁剂，如柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、柠檬酸亚铁和阿魏醇，可促进M1标记物（如iNOS、TNF-α、IL-1β）的表达，同时降低RAW264.7细胞^［4，5］、骨髓衍生巨噬细胞^［6］和THP-1细胞^［9］中M2标记物（如IL-10和CD206）的表达。除体外实验外，一些体内实验也证实补充外源性铁剂可以增强促炎巨噬细胞极化^［8，21］。总体来说，铁过载诱导肝巨噬细胞极化，打破肝脏M1/M2巨噬细胞平衡，促进肝脏炎症反应，进一步推动肝纤维化的发生发展。但铁在调节促炎巨噬细胞中的作用并不总是一致的。在IFN-γ刺激的RAW264.7细胞中，柠檬酸铁铵补充（25 μg/mL，等于0.089 mmol/L Fe³⁺）通过阻断信号转导子和转录激活子-1途径降低M1标记物（如IL-1β、iNOS和TNF-α）的表达^［22］。此外，补充Fe²⁺（FeSO₄，0~1 mmol/L）可减少小鼠和大鼠巨噬细胞中LPS/IFN-γ诱导的NO合成^［20］。本研究认为导致巨噬细胞的最终极化趋势不同的原因可能有以下几点：最终铁（Fe²⁺和/或Fe³⁺）浓度和处理时间不同^［23］；巨噬细胞类型不同（例如RAW264.7细胞、THP-1细胞和骨髓来源巨噬细胞）；巨噬细胞极化的刺激物/诱导物的各种条件不同；在巨噬细胞极化期间同时给予铁剂预处理或干预。

铁稳态也可能与M2型巨噬细胞的功能密切相关，这已在糖尿病^［24］、脊髓损伤^［25］和癌症^［4，5］的模型中得到验证。如肿瘤相关巨噬细胞被定义为促进肿瘤进展并与不良预后相关的M2型巨噬细胞^{［22，26，27］}。在肿瘤负荷BALB/C小鼠中，注射柠檬酸铁（2.5 mg/3 d，共17.5 mg）可促进ROS的产生和肿瘤浸润巨噬细胞CD86的表达，并降低H22肝癌异种移植物的体积和质量^［28］。向小鼠静脉注射多聚糖超顺磁氧化铁注射液（10 mg Fe/kg）可显著抑制M2型巨噬细胞的功能，同时增强肿瘤组织中M1型巨噬细胞的作用^［29］。本研究结果也显示，在造模第3周，过多的铁可以诱导巨噬细胞M2极化增多，而在第5周和第7周铁过载可显著抑制巨噬细胞M2极化，出现这种现象的原因可能是造模早期肝脏自身代偿性诱导增多M2型巨噬细胞以抑制炎症反应，而造模后期这种随着这种代偿作用的逐渐减弱，最终显示出铁过载对巨噬细胞M2极化的抑制作用，这也与前文所述的铁对M2型巨噬细胞存在负调控效应相吻合。这些发现表明铁对巨噬细胞M2极化具有负调节的作用。然而，在某些情况下，铁可能促进巨噬细胞M2极化。例如，外源性补铁（柠檬酸铁铵，0.1 mmol/L）和内源性富含铁的人真皮成纤维细胞细胞外基质都增强了THP-1细胞分化为M2表型^［30］。以上结果表明，铁可能通过影响基于不同模型的不同信号通路来调节巨噬细胞极化。因此，铁诱导巨噬细胞极化的潜在机制值得进一步探索。

综上所述，在肝脏铁过载的情况下，特别是在高铁添加（>0.1 mmol/L Fe³⁺和/或>1 mmol/L Fe²⁺）时，铁通过促进经典活化的巨噬细胞功能而影响巨噬细胞表型，同时降低替代活化的巨噬细胞功能。补铁或铁过载导致的巨噬细胞极化方向的差异也反映了铁形成巨噬细胞极化的细胞信号和/或代谢途径复杂多样，具体机制仍有待探索。

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