DTX2促进奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化

High expression of DTX2 promotes proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition of oxaliplatin-resistant colorectal cancer cells

摘要

目的 探讨DTX2对奥沙利铂耐药的结直肠癌（CRC/OXA）细胞的影响及作用机制。 方法 利用CCK8检测奥沙利铂（OXA）对CRC细胞的抑制率，构建CRC/OXA细胞系，检测CRC/OXA细胞中DTX2的表达水平，利用基因工具干预CRC/OXA细胞，分为未转染组（con）、敲低组（DTX2-shRNA）及共转染组（DTX2-shRNA+ pcDNA-Notch2）。采用平板克隆、划痕和Transwell侵袭实验检测改变DTX2的表达对CRC/OXA细胞增值、迁移侵袭能力的影响，并通过Western blotting检测各组中Notch2、NICD、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平。利用SW620/OXA细胞同样分组行裸鼠移植瘤实验，体内验证对裸鼠成瘤及蛋白的影响。 结果 OXA对CRC细胞有明显抑制作用，SW620和LoVo细胞IC₅₀分别为6.00和8.00 μmol/L，成功构建CRC/OXA细胞系，CRC/OXA细胞中DTX2表达量明显升高（P<0.01）。DTX2-shRNA组中CRC/OXA细胞明显抑制增值、迁移侵袭能力（P<0.05），DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组可逆转增强CRC/OXA细胞增值、迁移侵袭的能力（P<0.05）。Notch2、NICD及Vimentin蛋白平均表达水平，在DTX2-shRNA组中明显降低，而DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组明显升高（P<0.01）；E-cadherin蛋白表达水平在以上两组中的趋势相反且有明显差异（P<0.01）。体内实验显示DTX2可明显促进SW620/OXA细胞移植瘤的生长及对应蛋白的变化（P<0.05）。 结论 DTX2通过Notch2信号通路促进 CRC/OXA细胞增值、迁移侵袭及上皮间质转化，DTX2可能作为提高OXA疗效的分子标志物。

Abstract

Objective To investigate the role of DTX2 in regulating biological behaviors of oxaliplatin-resistant colorectal cancer cells (CRC/OXA cells). Methods CCK8 assay was used to determine the inhibition rate of oxaliplatin-treated CRC cells. A CRC/OXA cell line was constructed, in which DTX2 expression level was detected. The cells were transfected with a DTX2-shRNA plasmid or co-transfected with DTX2-shRNA and pcDNA-Notch2, and the changes in cell proliferation, migration and invasion ability were evaluated using plate cloning assay, scratch assay and Transwell invasion assay. The expression levels of Notch2, NICD and epithelial-mesenchymal transition (EMT) proteins of the transfected cells were detected with Western blotting. In a nude mouse model bearing SW620/OXA cell xenografts, the effects of DTX2 knockdown and Notch2 overexpression in the implanted cells on tumor growth and protein expressions were tested. Results The IC₅₀ of oxaliplatin was 6.00 μmol/L in SW620 cells and 8.00 μmol/L in LoVo cells. CRC/OXA cells showed a significantly increased expression of DTX2. DTX2 knockdown in CRC/OXA cells significantly inhibited cell proliferation, migration and invasion, and these effects were reversed by co-transfection of the cells with pcDNA-Notch2. DTX2 knockdown significantly reduced the expression levels of Notch2, NICD and vimentin proteins and increased E-cadherin expression in CRC/OXA cells, and co-transfection with pcDNA-Notch2 potently attenuated the changes in these proteins. In the tumor-bearing mice, DTX2 overexpression obviously promoted the growth of SW620/OXA cell xenograft, enhanced the protein expressions of Notch2, NICD and vimentin, and lowered the expression of E-cadherin. Conclusion High expression of DTX2 promotes proliferation, migration, invasion and EMT of CRC/OXA cells through the Notch2 signaling pathway, suggesting the potential of DTX2 as a target to improve the efficacy of oxaliplatin.

Graphical abstract

关键词

deltex-2 / 结直肠癌 / Notch2信号通路 / 上皮间质转化 / 奥沙利铂，耐药

Key words

deltex-2 / colorectal cancer / Nohch2 signaling pathway / epithelial-mesenchymal transition / oxaliplatin resistance

我国结直肠癌发病率和死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第２和５位，且发病人群趋于低龄化、发病率和死亡率呈明显逐年升高趋势^{［1， 2］}。手术是治愈结直肠癌（CRC）唯一有效的手段，但对于中晚期患者仅靠手术不能明显改善患者5年生存率^{［3， 4］}。因此，术后需要到肿瘤内科系统治疗，而奥沙利铂（OXA）是晚期肠癌一线化疗方案中不可或缺的药物之一，但仍有近50%以上的CRC患者对OXA联合化疗方案无反应，导致这种问题的主要原因是化疗耐药，因此，寻找有效的化疗疗效预测因子^［5］一直是我们努力的目标。

近几年来，DTX2在促进恶性肿瘤增值、迁移侵袭及免疫治疗中的功能逐渐被关注^［6-10］，既往研究^［11］显示，DTX2在CRC组织中明显高表达，且DTX2与CRC患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关，DTX2可通过Notch2/Akt轴促进CRC细胞迁移和侵袭能力^［12］。但临床上DTX2是否参与CRC患者的化疗，以及DTX2在奥沙利铂结直肠癌（CRC/OXA）耐药中的影响和可能作用机制尚不清楚。因此，我们构建了CRC/OXA细胞系及裸鼠移植瘤模型，进一步探讨DTX2对CRC/OXA细胞的影响，为DTX2参与肠癌患者OXA耐药筛选潜在的分子靶点，进一步提高结直肠癌患者的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料

人结直肠癌细胞SW620、LoVo（上海吉凯基因公司，DTX2和GAPDH引物均由上海生工技术公司合成。DTX2短发夹RNA（sh-DTX2序列：5'-AGGGAAAGA TGGAGGTATT-3'）及阴性对照序列均由广州锐博生物科技有限公司合成，DTX2和Notch2过表达质粒由通用公司完成。

主要试剂：TRizol裂解液、lipofectamine 3000 转染试剂（Invitrogen），反转录试剂盒（Takara），EDTA胰酶（北京索莱宝科技有限公司），Opti-MEM（Thermo），Matrigel基质胶（BD），Transwell小室（Corning），DMEM高糖（Hyclone）胎牛血清（Gibco），OXA（MCE），CCK8（APExBIO），DTX2兔单克隆抗体（Abcam），兔多克隆抗体Notch2、NICD、E-cadherin、N-cadherin、兔单克隆（Vimentin）抗体，鼠多克隆GAPDH抗体（武汉三鹰）。

主要仪器：Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR仪（ABI），Multiskan GO全波长酶标仪（Thermo），水平电泳仪（上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、shRNA和过表达质粒构建与转染

结直肠癌SW620、LoVo 细胞使用DMEM培养基，完全培养基的组成为10%FBS+89% DMEM+1%双抗，所有细胞于5% CO₂、37 ℃的孵育箱内培养。构建pcDNA-Notch2过表达质粒、DTX2-shRNA靶向序列及阴性对照序列，将待转染细胞培养至对数生长期，用转染试剂 Lipofectamine 3000进行DTX2-shRNA、pcDNA-Notch2过表达质粒转染，DTX2-shRNA和pcDNA-Notch2共转染 CRC/OXA细胞，具体步骤严格按照产品说明书执行。

1.2.2 细胞毒性试验

取对数生长的CRC细胞用胰蛋白酶消化，铺于96孔培养板中（2000/孔），培养24 h加入含OXA培养基处理，设置对照组（0.5% DMSO）、空白组（无细胞）及加药组（2、4 μmol/L及逐渐以2的倍数增加至20 μmol/L）。于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养48 h，加入CCK8试剂（10 μL/孔），注意不要有气泡，37 ℃培养箱温育1~4ｈ，于摇床上温柔的混匀，用酶标仪测量吸光度A_{450 nm}值。按公式计算各组细胞相对活性=（A_测量组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）×100%，计算半抑制浓度（IC₅₀）值。

1.2.3 OXA耐药细胞系的构建

取对数期生长状态良好CRC细胞，分别用含（SW620：6.00 μmol/L，LoVo： 8.00 μmol/L）OXA的DMEM培养基接种于培养皿中常规培养，当细胞能维持正常生长且存活率大于50%时，反复诱导，直至细胞能够在含IC₅₀值的OXA和10%胎牛血清的DMEM培养基中正常生长，细胞存活率与正常细胞无显著差异。

1.2.4 平板克隆实验

各组细胞稳定转染后，取生长状态良好细胞制成单细胞悬液，每个培养皿中接种约300个细胞，3~4 d换1次培养基并观察细胞状态，20 d左右形成肉眼可见的50个细胞以上的单克隆集落时终止培养，显微镜下观察细胞菌落数，固定染色，拍照平板克隆计数（大于50个细胞的细胞团）统计分析。

1.2.5 划痕实验

CRC/OXA细胞稳定转染后培养状态佳，胰酶消化制成单细胞悬液，铺板后用无血清培养基培养6~8 h贴壁，次日细胞汇合度达到80%以上。然后用灭菌的200 μL枪头比照培养皿底部预先画好的参考线划出“井”子划痕，保持划痕平行、均匀分布。用预热的PBS清洗，去除划掉的细胞，轻柔操作避免划痕边缘的细胞被吹起，加入含10% FBS的完全培养基，37 ℃、5% CO₂孵箱中培养，分别在0 h及36 h时，用显微镜观察细胞的迁移愈合情况并拍照；4%多聚甲醛固定，GIEMSA染液，PBS洗涤多次、晾干及拍照，统计分析迁移率。细胞迁移率（%）=［（起始时间点划痕区而积－结束时间点划痕区而积）/起始时间点划痕区而积］×100%。

1.2.6 Transwell细胞侵袭实验

CRC/OXA细胞稳定转染后，无血清培养基与Matrigel基质胶的配比为7∶1，Transwell小室上面加100 μL配好的基质胶，培养箱中放置4 h至基质胶凝固，下室加入含20% FBS的培养基，将100 μL含1×10⁵细胞的悬液加入24孔板Transwell上室，孵育箱培养24 h，显微镜下发现下室出现贴壁细胞时中止，棉签将小室上面的细胞擦去，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色后在显微镜下统计侵袭的细胞数量。

1.2.7 Western blotting检测

用强RIPA裂解液加蛋白酶抑制剂提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸5 min使蛋白变性，配制相应SDS-PAGE凝胶分离总蛋白质，按25~30 μg/孔的蛋白样品加样，各泳道等体积用缓冲液配平，用湿转转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上，5% BSA的TBST室温封闭2 h。孵育Notch2（1∶1000）、NICD（1∶1000）、E-cadherin（1∶5000）、N-cadherin（1∶3000）及Vimentin（1∶4000）一抗，4 ℃摇床孵育过夜（16~18 h），TBST洗膜3次，10 min/次，加入1∶8000稀释的二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜3次，10 min/次，ECL化学发光显影并拍照。以GAPDH为内参，用Image J软件对各条带灰度值分析。蛋白平均表达水平=（目的条带光密度值×面积）/（GAPDH条带光密度值×面积）。

1.2.8 模型构建及分析

SW620/OXA细胞干预后共分3组，构建裸鼠移植瘤模型，5只/组，于小鼠前肢背部靠外侧皮下注射100 μL 5×10⁷/mL细胞悬液，7 d/次记录瘤体积。瘤体积的计算公式：V=1/2×L×W2（L代表瘤体的长度，W代表瘤体的宽度）；喂养28 d后移植瘤成功，处死小鼠，大体标本及瘤体拍照，分别称瘤体质量，瘤体组织做Western blotting实验，最后分析数据。

1.3 统计学分析

所有结果均进行3次独立实验，采用SPSS22.0统计软件进行统计学分析，图表绘制采用GraphPad8.0及Excel软件，实验各组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OXA耐药结直肠癌细胞构建及DTX2在耐药细胞系中表达

用含不同OXA浓度的培养基处理CRC细胞，SW620和LoVo细胞中的IC₅₀分别为6.00 μmol/L和8.00 μmol/L（图1）。OXA反复诱导CRC细胞，成功构建对OXA产生稳定的耐药性的CRC细胞，Western blotting及PCR检测提示，耐药细胞系中DTX2蛋白和mRNA的表达水平较亲本细胞均显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01，图2）。

2.2 CRC/OXA细胞转染DTX2-shRNA和DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2后对其增殖能力影响

平板克隆实验显示，与con组及DTX2-shRNA组相比，DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组中CRC/OXA细胞增殖能力最强，DTX2-shRNA组增殖能力最弱，con组增殖能力介于二者间，3组间差异均有统计学意义（P<0.05，图3）。

2.3 CRC/OXA细胞转染DTX2-shRNA和DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2后对其迁移能力影响

划痕实验提示，与con组及DTX2-shRNA组相比，DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组中CRC/OXA细胞迁移能力最强，DTX2-shRNA组迁移能力最低，con组迁移能力介于二者间，3组间差异均有统计学意义（P<0.05，图4）。

2.4 CRC/OXA细胞转染DTX2-shRNA和DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2后对其侵袭能力影响

与con组及DTX2-shRNA组相比，DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2中CRC/OXA细胞侵袭能力最强，DTX2-shRNA组侵袭能力最低，3组间差异均有统计学意义（P<0.05，图5）。

2.5 CRC/OXA细胞共转染DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2后可促进其EMT

蛋白印迹结果显示Notch2、NICD及Vimentin蛋白水平在DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组中表达最高，在DTX2-shRNA组中表达最低，而E-cadherin蛋白水平在DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组中表达最低，在DTX2-shRNA组中表达最高，以上蛋白在3组间差异均有统计学意义（P<0.01，图6A、B）。LoVo细胞各蛋白变化趋势与SW620细胞相似（图6C、D）。而N-cadherin蛋白在3 组间差异无统计学意义（P>0.05）。

2.6 SW620/OXA细胞干预后对裸鼠成瘤及相应蛋白的影响

绘制肿瘤的生长曲线，DTX2-shRNA组移植瘤生长速度缓慢，Con组最快。Con组的体积为1633.41±70.76 mm³，DTX2-shRNA组为882.40±62.36 mm³，DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组为1207.20±72.60 mm³；con组瘤质量为2.42±0.51 g，DTX2-shRNA组为0.93±0.21 g，DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组为1.62±0.38 g，3组间瘤体体积及质量差异均有统计学意义（P<0.05，图7）。

Western blotting结果显示，Notch2、NICD、Vimentin及E-cadherin蛋白平均表达量的变化趋势同细胞实验，且3组间差异有统计学意义（P<0.01，图8）。

3 讨论

目前，对于绝大多数恶性肿瘤的治疗采取以手术为主的综合模式，而中晚期CRC患者，根据病理分期及个体差异需要继续到肿瘤内科全身治疗。近几十年来，铂类作为肠癌系统治疗中的一类重要的辅助化疗药物，其在提高CRC患者生存预后方面发挥了关键性作用^［13-15］，然而有半数以上患者在接受铂类药物治疗的过程中逐渐产生耐药，因此，患者会出现肿瘤复发或远处转移^{［16， 17］}。OXA^［18］作为临床常用的第3代铂类抗肿瘤药，其主要与DNA碱基结合，激活凋亡途径、阻止DNA复制和转录、造成DNA损伤导致细胞死亡，进而抑制肿瘤细胞异常增值、迁移侵袭等恶性生物学行为^［19-21］。研究报道^［22-24］，OXA耐药机制主要包括细胞内药物的低效摄取、抗氧化谷胱甘肽系统的解毒激活、DNA修复的增强、抗凋亡途径的激活以及上皮-间充质转化等。所以，导致肿瘤耐药是多中因素互相作用的结果。根据目前研究统计^{［25， 26］}，恶性肿瘤的患者中，因化疗耐药而死亡的病例人数占总人数的90%以上。因此，迫切需要探索有效的特异性肿瘤耐药分子标志物，为降低肿瘤耐药率、靶向干预治疗肿瘤提供理论依据。本文中，我们探讨DTX2对CRC/OXA细胞增值、迁移侵袭的影响及可能的作用机制，寻找提高OXA疗效相关的分子标志物。

近年来，研究发现^［27-29］泛素-蛋白酶体系统在肿瘤生物学中的作用逐渐被重视，而泛素连接酶在该系统中扮演者重要角色，DTX2为一种E3泛素连接酶，DTX2^{［8， 30］}属于泛素-蛋白酶体系统中关键的酶之一，其功能主要是参与靶蛋白翻译后的泛素化修饰，进而引起生物学功能的变化。目前关于DTX2在肿瘤生物学中的研究^［31-33］较少、机制也尚不清楚。DTX2可促进胶质瘤细胞的增值及迁移能力，提示高表达DTX2的胶质瘤患者预后不良^{［6， 7］}。Liu等^［9］研究显示，DTX2通过抑制铁死亡促进NSCLC细胞增殖，且DTX2与非小细胞肺癌患者的不良预后密切相关。黄小强^［8］利用生信分析DTX2相关基因，得出DTX2在肝癌组织中高表达，且与肝癌患者不良的预后状况有关，然而高表达DTX2的肝癌患者可以在免疫治疗中获得较好的疗效。我们前期报道^［11］也提示，DTX2在CRC患者中异常高表达，且与患者恶性程度正相关，加速肿瘤的进展。进一步行细胞功能实验说明，DTX2通过Notch2/Akt轴促进CRC细胞迁移侵袭的能力^［12］。总之，以上研究均提示DTX2在促进恶性肿瘤的进展中发挥一定作用。

目前，DTX2在恶性肿瘤行OXA化疗中的影响，尚无相关研究。因此，本文仅通过构建CRC/OXA细胞，进一步探讨DTX2对OXA耐药的CRC细胞的影响，为DTX2是否参与CRC患者OXA耐药筛选潜在的分子靶点。我们首先在体外利用CRC细胞进行初步探究，反复诱导成功构建CRC/OXA细胞，检测发现CRC/OXA细胞中DTX2蛋白和mRNA的表达水平较亲本显著升高（P<0.01），提示DTX2可提高CRC细胞OXA耐药性。然后利用基因工具改变DTX2基因的表达进一步探究其对CRC/OXA细胞功能的影响。平板克隆、划痕及Transwell实验提示，与con组相比，DTX2-shRNA组中CRC/OXA细胞平板克隆平均细胞数量、迁移率及平均侵袭细胞数量明显降低（P<0.05），敲低DTX2后可明显抑制CRC/OXA细胞增殖及迁移侵袭能力。然而，CRC/OXA细胞共转染DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2后明显逆转敲低DTX2后CRC/OXA细胞增殖及迁移侵袭能力（P<0.05），以上3组间差异均有统计学意义（P<0.05）。蛋白印记结果显示，CRC/OXA细胞中Notch2、NICD及Vimentin蛋白表达量在DTX2-shRNA组中最低，而在DTX2-shRNA+pcDNA-Notch2组中最高；E-cadherin蛋白表达量在以上两组中相反，以上蛋白在3组间差异均有明显统计学意义（P<0.01）。研究^{［32， 34］}报道，DTX2作为配体与Notch受体结合后参与CSL非依赖途径，从而通过Notch信号通路的调控加速进肿瘤的进展。同样，本实验也提示DTX2通过Notch2信号通路促进CRC/OXA细胞的迁移、侵袭及EMT。最后体内裸鼠成瘤实验，移植瘤体积及重量在DTX2-shRNA组中最低，con组中最高，3组间差异均有统计学意义（P<0.05）。同样裸鼠成瘤组织中蛋白变化检测与CRC/OXA细胞实验变化趋势一致（P<0.01）。因此，DTX2可促进SW620/OXA细胞成瘤的增值能力，提示敲低DTX2后可能提高CRC细胞对OXA的敏感性。

本研究还存在一定的不足，文中未研究DTX2与OXA对CRC患者的影响，今后在临床工作中可收集资料，根据DTX2在CRC患者中的表达量，进一步探讨OXA对CRC患者临床疗效的影响。期望低表达DTX2的CRC患者，能从含有OXA药物的化疗方案中明显获益，进一步提高CRC患者的5年生存率。另外有望为提高恶性肿瘤的治疗提供新的思路。

综上所述，DTX2通过Notch2信号通路促进CRC/OXA细胞增殖、迁移、侵袭及EMT，DTX2高表达提示OXA耐药增强，DTX2可能作为提高OXA疗效的分子标志物提供依据。因此，我们还需要在临床患者中进一步验证，揭示 DTX2作为CRC患者OXA疗效的预测因子，希望为临床解决CRC在OXA耐药的研究中提供理论支持。

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基金资助

大连市生命健康领域指导计划项目(2023005)

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