黑骨藤正丁醇萃取成分治疗大鼠阿尔茨海默病的药效学及作用机制

n-butanol fraction of ethanol extract of Periploca forrestii Schltr.: its active components, targets and pathways for treating Alcheimer's disease in rats

摘要

目的 探讨黑骨藤正丁醇萃取部位对阿尔茨海默病（AD）的药效学研究及潜在作用机制预测。 方法 采用超高效液相-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-MS）技术对黑骨藤正丁醇部位的化学成分进行分析鉴定，建立三氯化铝（AlCl₃）和D-半乳糖（D-gal）联合诱导50只SPF级雄性AD大鼠模型，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、苏木精-伊红染色（HE）和尼氏染色（Nissl）、免疫组化染色（ICH）、Western blotting等实验为基础，通过网络药理学及分子对接技术预测抗AD潜在作用机制。 结果 黑骨藤正丁醇萃取部位鉴定出17个化学成分，主要包括苯丙素类、黄酮类、蒽醌类、三萜类、甾体类以及挥发油类。药效学实验结果显示经过黑骨藤正丁醇萃取部位组处理后，大鼠海马中乙酰胆碱酯酶（AChE）含量降低（P<0.05），而乙酰胆碱（ACh）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量增加（P<0.05），在Western blotting实验中神经细胞凋亡因子B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）表达上升（P<0.05），而Bax蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达下降（P<0.01），氧化应激因子核因子红细胞系2相关因子2（Nrf-2）和血红素氧合酶1（HO-1）蛋白表达水平上调（P<0.01），氧化应激反应转录因子（Keap-1）蛋白表达水平下调（P<0.01），脑源性神经营养因子BDNF表达水平均升高（P<0.01），以及β-淀粉样蛋白Aβ、Tau蛋白表达水平均下调（P<0.01），且表现出一定的剂量依赖性。黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分与AD共获得TNF、AKT1和ESR1等14个关键靶点。 结论 初步阐明了黑骨藤正丁醇萃取成分的药效物质基础，并证实了其具有较好的抗AD效果。预测黑骨藤正丁醇萃取部位可通过多组分、多靶点、多途径和多通路发挥抗AD作用。

Abstract

Objective To investigate the active components and possible mechanisms of n-butanol fraction of Periploca forrestii Schltr. ethanol extract for treating Alzheimer's disease (AD). Methods The active components of n-butanol fraction of Periploca forrestii Schltr. ethanol extract were analyzed using UPLC-QE-MS technique. In a SD rat model of AD induced by treatment with AlCl₃ and D-gal, the therapeutic effects of low, moderate and high doses of the n-butanol fraction, saline, and donepezil hydrochloride were evaluated using ELISA, HE and Nissl staining, immunohistochemistry and Western blotting. The therapeutic mechanisms of the n-butanol fraction were explored using network pharmacology and molecular docking. Results Seventeen active components were identified from the n-butanol fraction of Periploca forrestii Schltr. ethanol extract, including phenylpropanoids, flavonoids, anthraquinones, triterpenoids, steroids, and volatile oils. In the rat models of AD, treatment with the n-butanol fraction significantly lowed AChE content in the hippocampus, increased the contents of ACh, SOD, CAT, and GSH-Px, enhanced the expressions of neuronal apoptotic factors Bcl-2, PI3K, Akt, p-PI3K, and p-Akt, and reduced the expressions of Bax and caspase-3 proteins. The treatment also dose-dependently up-regulated hippocampal expressions of Nrf-2, HO-1 and BDNF and down-regulated Keap-1, Aβ and Tau expressions. Bioinformatics analysis identified 14 key intersected targets (including TNF, AKT1 and ESR1) between the n-butanol fraction and AD. Conclusion The therapeutic effect of n-butanol fraction of Periploca forrestii Schltr. ethanol extract in AD mice is mediated by its multiple active components that regulate multiple targets and pathways.

Graphical abstract

关键词

UPLC-QE-MS / 黑骨藤 / 正丁醇萃取部位 / 化学成分 / 阿尔茨海默病 / 网络药理学

Key words

UPLC-QE-MS / Periploca forrestii Schltr. / n-butanol extract / chemical constituents / Alzheimer's disease / network pharmacology

黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨的干燥根或全株^［1］，主要含有三萜类、黄酮类、甾体类、苯丙素类、挥发油等多种化学成分^［2，3］，具有抗炎、镇痛、抗类风湿性关节炎、神经修复、免疫抑制、抗肿瘤等多种药理作用，被广泛应用于少数民族中，单独使用或配方用于治疗风湿关节痛、跌打损伤及各种神经性疼痛等疾病^［4］。相关研究表明，黑骨藤具有抗氧化和神经修复特性，能够有效减缓神经退化性疾病阿尔茨海默病（AD）的发生^［5，6］。AD的发病机制十分复杂，涉及多个假说，其中包括胆碱能假说、氧化应激假说、炎症免疫假说、淀粉样蛋白假说、基因突变假说等。鉴于AD的起病隐匿，其患病因素异常复杂，因此导致其发病机制至今尚未有确切的定论。

在课题组的前期研究中，通过H₂O₂诱导PC12细胞建立AD氧化损伤模型，初步明确了黑骨藤抗正丁醇部位抗AD的效果，但目前该部位可能是哪些成分发挥作用，对体内AD模型是否同样效果良好，其潜在的作用机制又是哪些并不明确。UPLC-QE-MS是指超高效液相色谱联用四极杆轨道阱质谱仪的组合，具有高分辨率和高灵敏度等特点，已广泛的应用于中药化学成分的识别和分析中^{［7， 8］}。中药的药效常常与其中含有的多种化学成分协同作用有关，对中药进行化学成分研究的目的之一就是为了深入了解中药的药理机制，找出黑骨藤正丁醇萃取部位中起主导作用的活性成分，并阐明这些成分如何相互作用。基于此，本研究利用UPLC-QE-MS技术对黑骨藤正丁醇萃取部位的化学成分进行鉴定，采用AlCl₃与D-gal联合复制建立大鼠AD模型，探索黑骨藤正丁醇萃取部位在体内抗AD活性。在明确其化学组成及药效的基础上，通过网络药理学及分子对接预测抗AD的潜在作用机制，从而进一步明确黑骨藤在治疗AD方面的药效物质基础及作用机制，为后续黑骨藤抗AD的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 仪器

Vanquish超高效液相色谱色谱仪、Orbitrap Exploris 120型高分辨质谱、Xcalibur 2.1工作站（赛默飞）；PS-60AL超声波清洗器（上海标卓科学仪器有限公司）；BSA124S-CW型分析天平（德国赛多利斯公司）；真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；电子分析天平（Mettler-Toledo）；苏木素染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；数字切片扫描仪（ Hungary）；修复仪（Thermo Shandon Limited）；脱色摇床（上海程捷仪器设备有限公司）；漩涡混匀仪（江苏新康医疗器械有限公司）；掌上离心机（SCLOGEX）；酶标仪［帝肯（上海）实验器材有限公司］；自动酶标洗板机（无锡华卫德朗仪器有限公司）；贝克曼全自动生化分析仪［贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司］；电泳仪（上海测博生物科技发展中心）。

1.2 试剂与药材

黑骨藤供试药材采自于贵州省安顺市西秀区双堡镇，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为Periploca forrestii Schltr.的地上部分，阴干，粉碎。D-gal（大连博格林生物科技有限公司）；AlCl₃（天津市致远化学试剂有限公司）；盐酸多奈哌齐片（浙江华海药业股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，默克）；甲酸（色谱纯，赛默飞）；水为超纯水（屈臣氏）；正丁醇，石油醚，乙酸乙酯均为分析纯；伊红染液（合肥博美生物科技有限责任公司）；苏木分化液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；牛血清BSA、一抗Tau兔单克隆抗体、二抗HRP标记山羊抗兔（赛维尔生物）；AchE试剂盒、Ach试剂盒、GSH-PX试剂盒、CAT试剂盒、SOD试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；PVDF膜（京沃卡威生物技术有限公司）；BDNF兔单克隆抗体、NRF2兔单克隆抗体、Keap-1兔单克隆抗体、HO-1兔单克隆抗体（万类生物科技有限公司）；Aβ兔单克隆抗体和Tau兔单克隆抗体（赛维尔）；Akt兔单克隆抗体、PI3K兔单克隆抗体、p-Akt兔单克隆抗体和Caspase-3兔单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；p-PI3K兔多克隆抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司），Bax兔单克隆抗体、Bcl-2兔单克隆抗体、Caspase-9兔单克隆抗体、β-Actin兔单克隆抗体（武汉三鹰生物科技有限公司）；HRP标记山羊抗兔二抗（上海爱必信生物科技有限公司）。

1.3 实验动物

SD大鼠：SPF级，雄性，60只，3月龄，体质量为220±20 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证编号为SCXK（湘）2022-0011。大鼠均饲养在温度为23±1 ℃，相对湿度为42%的环境中，保持12 h的光照循环周期下自由摄食、饮水，适应性饲养1周后开始进行实验。动物实验经贵州中医药大学动物实验伦理审查委员会审查批准（伦理批号：20240712），在动物饲养和实验过程中严格遵循实验动物使用的3R原则，并给予人道关怀。

1.4 实验方法

1.4.1 试药的制备

精密称取黑骨藤药材100.0000 g，以1∶10、1∶8和1∶6料液比，加70%乙醇加热回流提取3次，2 h/次，合并提取液，减压回收溶剂，得到70%乙醇提取物浸膏。加水溶解浸膏，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得正丁醇萃取部位。旋蒸至完全干燥，得正丁醇萃取部位浸膏。取本品浸膏50 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声（功率360 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm滤膜过滤，用于UPLC-QE-MS检测。取正丁醇萃取部位浸膏制备低、中、高剂量用于后续药效学研究。

1.4.2 UPLC-QE-MS检测条件

1.4.2.1　色谱条件

色谱柱：XTerra RP₁₈ column（Waters，2.1×150 mm，3.5 μm）；流速：0.3 mL/min，柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序为0~12 min：A（95%→40%），B（5%→60%）；12~23 min：A（40%→20%），B（60%→80%）；23~36 min：A（20%→5%），B（80%→95%）。

1.4.2.2　质谱条件

本实验采用正、负离子两种离子模式，以获取更加全面的质谱信息。正离子模式的采集条件包括使用热喷雾离子源（HESI），设定喷雾电压为+3800 V；毛细管温度为320 ℃；鞘气流速为40 arb；辅助气流速为10 arb；采集范围为m/z 120~1000。而在负离子模式下，喷雾电压设定为-3000 V，其余条件与正离子模式相同。

1.4.3 大鼠AD模型的制备和黑骨藤正丁醇部位干预

1.4.3.1　AlCl₃溶液和D-gal溶液的配制

AlCl₃溶液：称取2 g的AlCl₃，于1000 mL超纯水中进行溶解并定容，放置4℃储存。D-gal溶液：称取12 g的D-gal样品粉末，将其定容在1000 mL的生理盐水中进行溶解，4 ℃储存。

1.4.3.2　大鼠AD模型建立

AD模型建立：采用腹腔注射D-gal 120 mg/kg联合AlCl₃ 20 mg/kg灌胃，取10只大鼠作为空白组接受相同剂量的生理盐水注射和蒸馏水灌胃，1次/d，连续6周；将造模成功的大鼠随机分为模型组（Normal）、阳性对照组（盐酸多奈哌齐片组，DNPQ），正丁醇部位低（ZDC-L）、中（ZDC-M）、高（ZDC-H）剂量组，10只/组。各组大鼠自第3周开始给药，黑骨藤正丁醇萃取部位得率为10%，给药剂量按照动物与人的等效剂量进行换算，所用的黑骨藤正丁醇萃取部位的给药剂量参考了其临床成人（以60 kg为标准）的通常用量范围为6~9 g。将9 g定为黑骨藤动物给药的低剂量。正丁醇萃取部位低、中、高（94.5、189、378 mg/kg）进行灌胃，以盐酸多奈哌齐片为阳性药，阳性对照组接受5 mg/（kg·d）的阳性药灌胃，空白组和模型组接受生理盐水灌胃；所有组的灌胃体积均为10 mL/kg，1次/d，连续4周；各组在给药的同时继续接受造模，1次/d，以避免自然恢复。

1.4.4 AD大鼠海马区组织病理学改变及Tau的表达

1.4.4.1　大鼠海马组织HE染色

取各组大鼠海马体脱水、透明、包埋、切片、脱蜡，HE法染色，显微镜观察大脑神经细胞形态结构。

1.4.4.2　大鼠海马组织Nissl染色

取各组大鼠海马体经过脱蜡、染色、清洗、分色、脱水透明和封片的处理，光学显微镜观察海马CA1区尼氏染色阳性神经元的细胞形态和数量变化，并采集图像。

1.4.4.3　ICH测定海马组织中Tau蛋白

取各组大鼠海马组织切片、脱蜡至水、灭活、采用微波进行抗原修复、加牛血清封闭液，室温20 min，甩掉封闭液，加PBS（磷酸盐缓冲液）按1∶100配的Tau一抗（兔单克隆抗体），平放置湿盒4℃孵育过夜，然后加HRP标记山羊抗兔二抗（1∶100）孵育，加入新配制二氨基联苯胺显色液，滴到组织上显色，苏木素复染，最后使用中性树胶封片，采集图像，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定高倍图像的光密度和面积，并计算每张图像的平均光密度，苏木素染细胞核为蓝色，DAB显示阳性表达棕黄色。

1.4.5 AD大鼠海马组织相关生化指标检测

大鼠模型建立成功后，取各组大鼠海马组织测定大鼠海马胆碱能系统中AChE含量及ACh含量，同时测定氧化应激相关指标SOD、CAT、GSH-Px的活力。

1.4.6 Western blotting测定海马组织中相关蛋白

取各组大鼠海马组织，配制裂解液裂解，提取总蛋白，上样5 μL、电泳、转模、封闭。使用1×TBST配制的2%脱脂奶粉稀释，一抗：Akt、PI3K、HO-1和Caspase-3稀释比例为1∶1000，Bax、Bcl-2、p-Akt和p-PI3K稀释比例为1∶2000，BDNF、Nrf2和Aβ稀释比例为1∶500，Keap-1稀释比例为1∶1500、Tau稀释比例为1∶800、β-Actin稀释比例为1∶10 000，置于4 ℃孵育过夜，在孵育盒中加入使用HRP标记的二抗：山羊抗兔抗体（1∶5000），将PVDF膜放入干净的玻璃皿中，使用移液枪吸取显影液滴在膜上，确保膜上充分均匀覆盖显影液，使用一抗二抗去除液（强碱性）充分去除之前使用的一抗和二抗，以便重新利用相同的膜进行新的蛋白检测，使用Image J 5.2软件对图像进行灰度值分析，将目的蛋白的灰度值除以内参β-Actin的灰度值，以进行误差校正。根据校正后的灰度值，计算条带标准化体积，即进行进一步的统计学分析所需的数据。

1.4.7 网络药理学分析

基于液质联用技术分析得到的黑骨藤正丁醇萃取部位的化学成分及体内药效学研究，结合网络药理学及分子对接技术，对黑骨藤正丁醇萃取部位的潜在抗AD活性成分和作用机制进行预测。

1.4.7.1　黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分的筛选

在基于液质联用分析获得黑骨藤正丁醇萃取部位的化学成分之后，结合中国知网（CNKI）、万方、Science Direct以及PubMed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）和中药系统药理学数据库（TCMSP，http：//tcm-spw.com/tcmsp.php）等数据库，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为限定条件对黑骨藤正丁醇萃取部位化学成分进行筛选；在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中获取潜在活性成分的SMILES式，将SMILES式导入Swiss Target Prediction（http：swisstarget prediction.ch/）数据库，以Probability>0为筛选条件，预测出与活性成分相关的作用靶点；建立黑骨藤正丁醇萃取部位潜在活性成分的作用靶点库。

1.4.7.2　AD疾病靶点数据库的构建

利用GeneCards（https：//genealacart.genecards.org/）数据库和OMIM（https：// www.omim.org/）数据库，以“Alzheimer's disease”和“AD”为关键词，进行人类基因检索；合并两个数据库疾病靶点，删除重复项，以获取更为全面的疾病靶点信息，最终建立了包含多个数据源的AD疾病靶点。

1.4.7.3　药物-疾病交集靶点的获取

将黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分靶点和AD疾病靶点导入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，获得交集靶点的韦恩图，所得交集靶点即为黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分可能作用于疾病的潜在靶点。

1.4.7.4　“药物-成分-交集靶点”网络的构建

将黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分与AD疾病的交集靶点建立网络文件，并编辑其属性文件。将文件导入Cytoscape3.9.1软件中，构建“药物-成分-交集靶点”的可视化网络。

1.4.7.5　蛋白互作（PPI）网络的构建

将“药物-疾病”的潜在作用靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org），选择“Multiple proteins”，设定物种条件为“Homo sapiens”，修改默认参数，选择中等置信度为“0.400”，即获得PPI网络关系图。

1.4.7.6　基因本体（GO）富集分析和基因组百科全书（KEGG）信号通路分析

通过DAVID：Functional Annotation Result Summary（ncifcrf.gov）数据库，将药物-疾病交集靶点导入数据表中，选择GO/KEGG富集分析模块，获得主要数据；利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）平台，将前10条功能注释目录和前20条信号通路目录，以柱状图和气泡图的形式可视化。其中，GO富集包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。

1.4.7.7　分子对接

从TCMSP数据库（https：//tcmsp-e.com）中下载黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分的mol2结构文件，再从PDB数据库（https：//www.rcsb.org）中下载前5个核心靶点蛋白的PDB结构文件，运用PyMOL软件对受体蛋白进行去水、加氢和移除原始配体等操作。利用Auto Dock Tools 1.5.6软件将黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分与核心靶点进行分子对接，最后以PyMOL软件和Discovery Studio 4.5 Client软件展示分子对接结果。

1.4.8 数据分析

使用Xcalibur 4.1软件，进行准分子离子的质荷比计算，对采集的质谱数据进行保留时间的校正、峰识别和峰提取，通过一级准分子离子峰质荷比获取每个化合物的精确质量数及分子式，进一步结合二级碎片离子信息，借助MSDIAL和MassFrontier软件进行深入分析，同时，参考相关文献报道中关于各类化合物裂解规律的信息，结合实验数据对化合物进行详细分析和鉴定。

1.5 统计学分析

实验结果的统计分析采用SPSS 26.0进行正态性检验和方差齐性检验，在进行检验时，确保各组数据满足正态分布和方差齐性的条件，采用单因素方差分析进行组间比较，并使用Origin 2021进行图表绘制，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑骨藤正丁醇萃取部位的化学成分分析

对采集的正、负离子模式下黑骨藤正丁醇萃取部位高分辨质谱数据进行解析，共鉴定或推导17个化合物，其中包括5个苯丙素类成分，1个酚类成分，1个三萜类成分，4个黄酮类成分，3个蒽醌类成分，2个甾体类成分及1个脂肪酸类成分。正丁醇萃取部位正、负离子模式下的TIC图（图1），具体化合物详细碎片的鉴定信息（表1）。

2.2 主要化合物质谱裂解特征分析

黑骨藤正丁醇萃取部位主要含有苯丙素类、黄酮类、萜类以及脂肪酸类等。以苯丙素类化合物绿原酸（化合物1）^［24］，黄酮类化合物汉黄芩素（化合物14）^［25］为例子，分析其质谱裂解途径。

2.2.1 苯丙素类化合物的鉴定

化合物1在负离子的模式下，得到母离子为m/z 353.08908［M-H］^-的准分子离子峰，经Xcalibar软件拟合后推测其分子式为C₁₆H₁₈O₉，其产生了二级离子碎片信息主要有m/z 191.05542 ［M-H-C₉H₆O₃］^-、179.03445 ［M-H-C₇H₁₀O₅］^-、173.04485 ［M-H-C₉H₆O₃-H₂O］^-、161.02394 ［M-H-C₇H₁₀O₅-H₂O］^-、135.04404 ［M-H-C₇H₁₀O₅-CO₂］^-和93.03344 ［M-H-C₇H₁₀O₅-H₂O-C₃HO₂］^-，根据该化合物的精确相对分子质量、断裂方式，质谱裂解途径分析，并结合相关文献［26］报道，最终鉴定化合物1为绿原酸，其可能质谱裂解过程（图2）。

2.2.2 黄酮类化合物的鉴定

化合物14（C₁₆H₁₂O₅）在负离子模式下的母离子峰为m/z 283.05704 ［M-H］^-。在质谱图中，二级碎片离子明显经历了丢失一分子CH₃、CO，形成的离子碎片分别为m/z 267.04141 ［M-H-CH₃］^-和m/z 239.87805 ［M-H-CH₃-CO］^-，二级碎片离子的质谱特征与文献［21］中报道基本一致，鉴定该化合物为汉黄芩素，其可能质谱裂解过程（图3）。

2.3 AD大鼠海马区组织病理学改变及Tau的表达结果

2.3.1 HE染色结果

HE染色显示，与空白组相比较，模型组脑内神经细胞分层模糊、排列紊乱、胞体皱缩（红）、核固缩（黑）、胞浆着色加深（蓝）、神经元数目减少、形状不规则（绿）；与模型组相比较，阳性组及黑骨藤正丁醇部位低、中、高3个剂量组的神经细胞排列有序，细胞形态结构（黑）得到修复，且该作用随着剂量的增加而增强（图4）。

2.3.2 Nissl染色结果

尼氏染色显示，与空白组相比，模型组海马区神经元结构紊乱，细胞浆内尼氏体含量降低、表达降低，部分细胞核出现褶皱（P<0.01）；与模型组相比，阳性组及黑骨藤正丁醇部位低、中、高3个剂量组大鼠海马CA1区神经细胞的阳性染色数目增多，且排列更整齐，尼氏体数量增多（P<0.05，图5）。

2.3.3 ICH结果

免疫组化结果显示，与空白组相比，模型组显示Tau蛋白表达差异有统计学意义（P<0.01），证实了AD模型的成功复制；与模型组相比，阳性组和黑骨藤正丁醇部位低、中、高3个剂量组中Tau蛋白阳性表达明显降低，平均光密度减小（P<0.01）；Tau蛋白在大鼠CA1区和CA3区呈阳性表达会影响大鼠的记忆形成和储存，这表明黑骨藤正丁醇萃取部位能够减少Tau蛋白在大鼠海马组织中的表达和沉积，表明黑骨藤正丁醇萃取部位具有抗AD的潜在效果（图6）。

2.4 对ACh、AChE、SOD、CAT、GSH-Px的影响

模型组脑内ACh、SOD、CAT和GSH-Px的含量或活力较对照组明显降低（P<0.01），AChE含量明显升高（P<0.01）；与AD大鼠模型组相比，经过黑骨藤正丁醇萃取部位组及阳性药物组给药处理后，AChE含量明显降低，而ACh、SOD、CAT和GSH-Px的含量增加，且呈剂量依赖性（P<0.05，图7）。

2.5 黑骨藤正丁醇萃取部位对AD大鼠中相关蛋白的表达结果

2.5.1 凋亡相关蛋白表达

与空白组比较，模型组中Bcl-2、PI3K、Akt、p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低（P<0.01），Bax和Caspase-3蛋白表达升高（P<0.01）；经黑骨藤正丁醇萃取部位处理后，Caspase-3和Bax蛋白表达均降低，Bcl-2蛋白表达均升高（P<0.01，图8）。

2.5.2 神经营养因子BDNF的表达

与空白组相比，模型组中BDNF蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；而在经过黑骨藤正丁醇部位药物组处理后，BDNF蛋白表达水平均升高（P<0.01，图9）。

2.5.3 氧化应激蛋白Nrf-2、HO-1和Keap-1的表达

与空白组相比，模型组中Nrf-2和HO-1蛋白表达水平降低（P<0.01），而Keap-1蛋白表达水平升高（P<0.01）。然而，在经过黑骨藤正丁醇部位药物组处理后，AD模型大鼠表现出Nrf-2和HO-1蛋白表达水平上调，Keap-1蛋白表达水平下调的改善趋势（图10）。

2.5.4 Aβ、Tau蛋白的表达

与空白组相比，模型组中Aβ和Tau蛋白的表达水平增加（P<0.01）。经过黑骨藤正丁醇处理后，与模型组相比，Aβ和Tau蛋白表达水平均下调（P<0.01，图11）。

2.6 网络药理学分析结果

2.6.1 活性成分及靶点数据库的构建

将黑骨藤正丁醇萃取部位化学成分，通过TCMSP数据库，以OB≥30%和DL≥0.18为限定条件，筛选出潜在活性成分：山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素和汉黄芩素；在Swiss Target Prediction数据库中，以Probability>0筛选得到各活性成分的作用靶点167个。

2.6.2 AD疾病靶点与交集靶点的获取

通过GeneCards数据库和OMIM数据库获取AD疾病靶点，其中GeneCards数据库AD疾病靶点1085个（relevance score≥10），OMIM数据库426个，所有靶点合并剔除重复值后，得到1246个AD疾病靶点。将1246个疾病靶点与167个药物靶点通过Venny2.1.0网站在线分析，即可获得45个交集靶点（图12）。

2.6.3 “药物-成分-交集靶点”网络的构建

选择黑骨藤正丁醇萃取部位的4个活性成分和167个潜在作用靶点导入Cytoscape3.9.1构建“药物-成分-交集靶点”网络（图13）。

2.6.4 PPI网络的构建

将45个交集靶点导入STRING数据库构建PPI网络图，用Cytoscape 3.9.1进行可视化处理。根据中心度（DC）从大到小，自内而外排列，节点的大小和颜色深浅依据DC而设定，即节点越大和颜色越深对应的靶基因DC越大，得到TNF、AKT1、ESR1、PPARG、MAPK3、APP、MMP9和NR3C1等14个关键靶点（图14）。

2.6.5 GO富集分析和KEGG信号通路分析

将45个交集靶点导入DAVID数据库中，分别进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。其中，GO富集分析获取BP、CC和MF相关数据，利用微生信平台绘制3个聚类分析的前10条功能目录的柱状图。KEGG富集分析表明，涉及AD的通路Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Phospholipase D signaling pathway、Endocrine resistance、Melanoma、Alzheimer disease和PI3K-Akt signaling pathway等，利用微生信绘制前20条信号通路的气泡图（图15）。

2.6.6 分子对接分析

黑骨藤正丁醇萃取部位活性成分分别与前5个核心靶点进行分子对接，对接结合能越小，配体-受体结合越稳定，相互作用的机会越大，配体-受体对接结合能Affinity均≤-3.84 kcal/mol。选择与蛋白质具有低结合能的组分用于对接可视化（图16）。

3 讨论

临床观察到AD患者脑中铝（Al）的含量较高，Al是一种慢性蓄积性神经毒素，能诱发老年斑（SP）和神经原纤维缠结形成，伴随学习记忆障碍、认知困难等现象^［27］。本研究选择AlCl₃和D-gal联合使用来制备动物AD模型，并使用黑骨藤正丁醇萃取部位进行干预处理，模型组行动迟缓、毛发粗乱、毛躁等症状经过正丁醇萃取部位的干预处理后均有所改善。因此，初步推断AD模型构建成功，同时黑骨藤正丁醇萃取部位可能具有一定的干预作用。

大鼠海马CA3区在信息的整合和传递过程中发挥关键作用，而CA1区则负责将处理后的信息输出到其他脑区^［28］，本研究对各组大鼠的海马组织进行了HE染色、尼氏染色以及免疫组化染色的观察，发现由AlCl₃与D-gal联合诱导的大鼠海马区神经元细胞发生了明显的神经退行性病变，并且出现了Tau在大鼠海马组织CA1区和CA3区的过表达，通过黑骨藤正丁醇萃取部位进行干预后，这一病变得到了减轻，同时Tau阳性表达显著降低；这表明黑骨藤正丁醇萃取部位可能通过缓解神经纤维缠结达到抗AD效果。AD模型大鼠脑内AChE水平升高，ACh水平降低，引起胆碱能系统功能紊乱、记忆减退、应激反应迟钝、运动能力下降^{［29， 30］}。黑骨藤正丁醇萃取部位能抑制AD大鼠脑中AChE活性、增加ACh含量，并增强抗氧化酶的活力和含量。这表明黑骨藤正丁醇萃取部位在一定程度上能够减轻AD模型大鼠脑部的氧化应激，从而改善其认知与记忆能力。PI3K/Akt信号通路能够调节Bcl-2家族的活性，Bcl-2家族作为凋亡信号通路的开关，Bcl-2可以与Bax相互作用以抑制细胞凋亡^［31］，而Caspase在细胞凋亡机制网络调节方面处于核心地位，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者^［32］。实验结果显示黑骨藤正丁醇萃取部位可通过对Bcl-2基因的调控，激活Caspase-3，诱导细胞发生抗凋亡作用。综上，预测黑骨藤正丁醇萃取部位可能通过调控PI3K/Akt信号通路发挥抗AD作用。

黑骨藤正丁醇萃取部位能够显著改善AD模型大鼠中Nrf-2、Keap-1、HO-1蛋白的异常表达，有研究发现Nrf-2/Keap1信号通路是内源性抗氧化系统的“开关”^［33］，因此推测黑骨藤正丁醇萃取部位也可能通过改善AD大鼠模型的氧化应激反应达到抗AD作用。通过网络药理学预测黑骨藤正丁醇萃取部位抗AD的活性成分、靶点、信号通路，发现黑骨藤正丁醇萃取部位可能是通过抗炎、激活神经营养蛋白信号通路及增加神经营养蛋白因子含量等方面治疗AD。

综上所述，本研究采用了UPLC-QE-MS技术从黑骨藤正丁醇萃取部位鉴定出苯丙素类、黄酮类、蒽醌、三萜类以及脂肪酸类等17个化合物，为后续进行黑骨藤药效学实验奠定了物质基础，同时这些鉴定的化合物为苗药黑骨藤及相关制剂的质量控制与评价提供了重要参考。通过药效学研究表明黑骨藤正丁醇萃取部位能够改善AD模型大鼠中相关指标的异常表达；网络药理学预测出的PI3K和Akt信号通路与药效学实验结果中一致，表明黑骨藤正丁醇部位可能通过PI3K/Akt信号通路发挥抗AD的作用。后续实验将继续验证黑骨藤正丁醇萃取部位对其他信号通路的调控作用。

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