生命早期两歧双歧杆菌BD-1干预可缓解注意缺陷多动障碍雌性大鼠幼年期的多动行为

Early life Bifidobacterium bifidum BD-1 intervention alleviates hyperactivity of juvenile female rats with attention deficit hyperactivity disorder

摘要

目的 研究生命早期两歧双歧杆菌BD-1干预对幼年期注意缺陷多动障碍（ADHD）雌性自发性高血压大鼠（SHR）模型的影响及机制。 方法 对雌性新生Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（空白对照组，n=8）和SHR（模型组，n=6）灌胃生理盐水，同时对雌性新生SHR灌胃BD-1（10⁹ CFU/d，实验组，n=6）。3周龄时停止灌胃并采集粪便，7周龄时进行旷场实验并采集粪便，随后处死大鼠。对肠道菌群进行16S rRNA测序，对纹状体多巴胺转运体和酪氨酸羟化酶、前额皮质活化小胶质细胞进行免疫荧光染色，流式细胞术检测肠系膜淋巴结、脾脏和血液中Treg细胞数量。 结果 SHR在旷场中的运动距离高于WKY（P<0.0001），BD-1干预降低了SHR的运动距离（P<0.01）。SHR纹状体中多巴胺转运体（P<0.05）和酪氨酸羟化酶（P<0.05）表达低于WKY，BD-1干预增加了SHR酪氨酸羟化酶的表达（P<0.05）。BD-1干预减少了SHR前额皮质活化小胶质细胞数（P<0.01）、增加了SHR脾脏中Treg细胞数（P<0.01）。BD-1干预增加了SHR肠道菌群α多样性、降低厚壁菌门/拟杆菌门比值，促进Muribaculaceae生长、抑制Clostridia_UCG-014生长。 结论 生命早期两歧双歧杆菌BD-1干预通过调节肠道菌群、调节外周免疫、抑制神经炎症、改善多巴胺能神经系统功能，从而缓解宿主后期多动行为，为ADHD的早期预防和精神益生菌的开发应用提供科学依据。

Abstract

Objective To investigate the effects of early life intervention with Bifidobacterium bifidum BD-1 (B. bifidum BD-1) on hyperactivity in a female mouse model of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and explore the underlying mechanisms. Methods Eight newborn female Wistar-Kyoto (WKY) rats and 6 spontaneous hypertensive rats (SHRs) were gavaged with saline and another 6 SHRs were gavaged with B. bifidum BD-1 (10⁹ CFU) daily for 3 weeks. Open field test of the rats was conducted at 7 weeks, and fecal samples were collected at weaning (3 weeks) and at 7 weeks for 16S rRNA sequencing. Immunofluorescent staining was used to detect dopamine transporter (DAT) and tyrosine hydroxylase (Th) levels in the striatum and activated microglia in the prefrontal cortex. Treg cells in the mesenteric lymph nodes, spleen and blood were analyzed using flow cytometry. Results The SHRs traveled a significantly greater distance in open fields test than WKY rats, and this behavior was significantly attenuated by B. bifidum BD-1 intervention. The expression of DAT and Th in the striatum was significantly lower in the SHRs than in WKY rats, while B. bifidum BD-1 treatment obviously increased Th levels in the SHRs. B. bifidum BD-1 intervention significantly deceased the number of activated microglia and increased Treg cell counts in the spleen of SHRs. The treatment also enhanced α diversity in gut microbiota of the SHRs and resulted in a decreased Firmicutes/Bacteroidota ratio, more active Muribaculaceae growth, and suppression of Clostridia_UCG-014 proliferation. Conclusion Early life intervention with B. bifidum BD-1 alleviates hyperactivity in female SHRs by modulating the gut microbiota and peripheral immune response, suppressing neuroinflammation and improving dopaminergic system function. These findings provide evidence for early prevention strategies and support the development and application of psychobiotics for ADHD.

Graphical abstract

关键词

注意缺陷多动障碍 / 两歧双歧杆菌BD-1 / 微生物-肠-脑轴 / 生命早期 / 神经炎症

Key words

attention deficit hyperactivity disorder / Bifidobacterium bifidum BD-1 / microbiota-gut-brain axis / early life / neuroinflammation

注意缺陷多动障碍（ADHD）是一种神经发育障碍性疾病，其病因尚不明确。近年来，随着微生物-肠-脑（MGB）轴的提出，有研究表明肠道菌群也参与到ADHD的发生发展中。与正常儿童相比，ADHD儿童肠道菌群呈现α多样性降低，韦荣球菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属等菌群相对丰度降低，以及肠杆菌、气味杆菌、粪拟杆菌等菌群相对丰度增加的特点^{［1， 2］}。一项超过20年的队列研究表明生命早期肠道菌群紊乱会增加宿主后期ADHD、自闭症、语言障碍等风险^［3］。也有研究发现生命早期肠道菌群缺乏双歧杆菌的婴儿在童年期更易发生ADHD或阿斯伯格综合征^［4］。生命早期是肠道菌群构建的关键期^［5］，因此，以生命早期肠道菌群为靶点的干预（如益生菌）有望成为新的ADHD防治方法。

自发性高血压大鼠（SHR）在幼年期表现出典型的注意力不集中、多动和冲动的症状，与ADHD症状一致，且其症状稳定遗传，被认为是较为理想的稳定的ADHD动物模型，因而被广泛用于幼年期ADHD的相关研究^{［6， 7］}。SHR从Wistar Kyoto（WKY）大鼠选育而来，因此WKY通常作为SHR的正常对照。研究发现，SHR大脑中活化小胶质细胞数量和肿瘤坏死因子-α（TNF‑α）水平比WKY更高，表明SHR还具有较高程度的神经炎症^［8］。而神经炎症与ADHD高度相关，被认为是ADHD的发病机制之一^［9］。

既往有研究采用双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis） A6干预雄性SHR，发现该菌株可以改善雄性SHR的空间工作记忆缺陷^［10］，有学者在雄性SHR中发现微量胺相关受体1参与调节其多动和焦虑样行为^［11］。然而，考虑到ADHD具有明显的性别差异，即男性患病率高于女性^［12］，且患有ADHD的男孩比女孩更加冲动^［13］，且肠道菌群组成及其涉及的MGB轴调节机制本身也具有一定的性别差异^［14］。然而，目前在雌性ADHD动物模型中关于生命早期肠道菌群构建对宿主后期ADHD影响的研究尚无报道。因此，本研究拟进一步在ADHD雌性动物模型中研究生命早期以肠道菌群为靶点的干预对ADHD的影响及可能的机制，为ADHD的早期预防和精神益生菌的开发应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂

OFT-100大小鼠旷场实验设备（成都泰盟软件有限公司）；BX53荧光显微镜（奥林巴斯）；Pannoramic SCAN Ⅱ成像系统（3D HISTECH）；cytoflex流式细胞分析仪（贝克曼库尔特有限公司）。

生理盐水（四川科伦药业股份有限公司）；舒泰50（维克）；Gibco磷酸盐缓冲液（PBS，Thermo Scientific）；10%中性多聚甲醛固定液（北京索莱宝科技有限公司）；FITC Anti-Rat CD4抗体、PE Anti-Rat CD25抗体、APC Anti-Rat FOXP3抗体、Fixation/Permeabilization Concentrate、FixFixation/Perm Diluent、Permeabili-zation Buffer ×10（eBioscience）；红细胞裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Alexa Fluor®594 donkey anti-rabbit lgG（H+L）抗体（Life Technologies）；Anti-Dopamine Transporter抗体、Anti-Tyrosine Hydroxylase抗体、Anti-Iba1抗体、羊抗兔 IgG H&L （HRP）抗体（Abcam）。

1.2 实验动物饲养与分组

SPF级10周龄雄性和雌性SHR/Ncrl、WKY/Ncrl大鼠共16只购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于四川大学华西公共卫生学院动物房［许可证号：SYXK（川）2023-0011］屏障环境。温度20~26 ℃，相对湿度40%~70%，洁净度7万级，噪声不高于60 dB（A），昼夜交替为10 h白昼和14 h夜晚。本研究动物实验由四川大学华西第四医院/华西公共卫生学院伦理委员会审批通过（伦理批号：Gwll2022057）。

大鼠适应性喂养1周后，将分别交配所获得的新生雌性SHR和WKY进行实验，新生WKY为空白对照组，新生SHR分为模型组和实验组。0~3周龄期间，对WKY灌胃生理盐水（WKY组，即空白对照组，n=8），对SHR灌胃生理盐水（SHR组，即模型组，n=6）或两歧双歧杆菌BD-1（SHR-BD-1组，即实验组，n=6）。两歧双歧杆菌BD-1（Bifidobacterium bifidum BD-1，菌株保藏号：CGMCC No.24517）为课题组从健康婴儿肠道中筛选得到，具有促进人体肠道菌群构建和免疫系统发育的健康效应^{［15， 16］}。灌胃体积为前1周10 μL/d，第2~3周100 μL/d，BD-1剂量为10⁹ CFU/d。3周龄后停止灌胃，并在7周龄时进行旷场实验。随后使用舒泰50麻醉处死大鼠。

1.3 旷场实验

大鼠旷场实验区域大小为50 cm×50 cm，并被分为9个区域，包括1个中心区、4个边缘区、4个角落区。将大鼠从中心区域放入，并开始时长5 min的实验。记录在此时间内的运动时间和运动距离。每只大鼠测试结束后，采用医用酒精清除大鼠运动轨迹和气味后再进行下一只大鼠的测试。

1.4 肠道菌群测序

在3周龄灌胃结束时和7周龄处死前收集大鼠粪便，3周龄样品每组称取5个100 mg混样粪便，7周龄每个样品称取100 mg粪便。粪便细菌DNA提取及16S rRNA 测序由上海美吉生物技术有限公司完成。主要步骤：提取DNA，对V3-V4区域进行扩增，对扩增产物定量，Illumina建库及测序，获得原始序列并在Qiime2中通过DADA2或Deblur进行降噪处理，最终获得扩增子序列变体（ASV）数据表。基于此ASV表进行肠道菌群多样性及物种组成等分析。在美吉生物云平台进行α和β多样性分析，通过R4.2.2计算门水平和属水平物种相对丰度。

1.5 流式细胞术检测Treg细胞数

大鼠麻醉后取腹主动脉血于EDTA-2Na抗凝采血管中，取出脾脏和肠系膜淋巴结于预冷的PBS中。

血液样本加入3倍体积的红细胞裂解液，室温裂解10 min，用PBS洗涤2次，300 g离心5 min收集细胞沉淀备用。肠系膜淋巴结和脾脏样本用眼科剪剪成小块，用研磨器将组织轻轻研磨，收集细胞悬液用200目细胞筛过滤，300 g离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次，300 g离心5 min，弃上清，加入3倍体积的红细胞裂解液，室温裂解10 min，用PBS洗涤2次，离心收集细胞沉淀备用。

100 μL PBS重悬细胞，每管加入CD4（0.5 μL/例）和CD25（0.625 μL/例），4 ℃避光孵育30 min，300 g离心5 min，弃上清，PBS洗涤后300 g离心5 min，弃上清，每管加入1×Fixation/Permeabilization Concentrate 500 μL，室温孵育50 min，350 g离心5 min，弃上清。每管加入250 mL 1× Permeabilization Buffer 洗涤2次，350 g离心5 min，100 μL 1× Permeabilization Buffer重悬细胞，每管加入FOXP3（5 μL/例），4 ℃孵育过夜，350 g离心5 min，弃上清，每管加入250 μL Permeabilization Buffer洗涤，350 g离心5 min，弃上清，300 μL 1×True Nuclear Perm重悬细胞，上机检测分析。采用CytExpert软件分析CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺细胞数占CD4⁺细胞数比例。

1.6 前额皮质和纹状体免疫荧光染色

大鼠麻醉处死后取出整脑，于10%中性多聚甲醛中浸泡固定24~72 h，石蜡包埋后切片，对前额皮质活化小胶质细胞、纹状体多巴胺转运体（DAT）和酪氨酸羟化酶（Th）进行免疫荧光染色。

前额皮质切片经过脱蜡、抗原修复和封闭后，于4 ℃孵育anti-Iba1抗体（1∶2000）过夜，然后于37 ℃孵育二抗Alexa Fluor®594 donkey anti-rabbit lgG（H+L）（1∶600）45 min。经DAPI染色并封片后镜检。通过CaseViewer软件计数随机6张放大30倍视野下活化小胶质细胞数量。

纹状体切片经过脱蜡、抗原修复和封闭后，于4 ℃孵育anti-Slc6a3抗体（1∶400）过夜，于37 ℃孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP，1∶4000）45 min；然后再于4 ℃孵育anti-Th抗体（1∶1000）过夜，于37 ℃孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG H&L（HRP，1∶4000）45 min。经DAPI染色并封片镜检。通过Image J软件分析并统计随机6张放大40倍视野下DAT和Th的累积光密度值（IOD）。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 9进行统计分析并绘制统计图。对服从正态分布且方差齐的计量资料以均数±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析，采用Tukey检验进行事后比较，方差不齐时采用Dunnett T₃检验进行事后比较；对不服从正态分布的计量资料以中位数（上下四分位数）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，并采用Dunn's检验进行事后比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多动行为

各组大鼠在运动时间上的差异无统计学意义（P>0.05，图1A），而SHR运动距离高于WKY，表现出典型的多动症状（P<0.0001，图1B）。SHR在旷场中的典型轨迹比WKY更为杂乱，SHR在经生命早期BD-1干预后，在旷场中运动距离有所下降（P<0.01，图1C）。

2.2 纹状体DAT和Th的表达

SHR纹状体中DAT和Th的表达低于WKY（P<0.05）。尽管生命早期BD-1干预没有提高SHR纹状体DAT的表达，但其促进了Th的表达（P<0.05，图2）。

2.3 对中枢和外周免疫功能的影响

生命早期BD-1干预降低了SHR前额皮质中活化小胶质细胞数量（P<0.01，图3A）。SHR在肠系膜淋巴结和脾脏中的Treg细胞数量低于WKY（P<0.001），存在外周免疫缺陷，但生命早期BD-1干预增加了SHR脾脏中Treg细胞数量，改善了SHR局部免疫功能（P<0.05，图3B）。

2.4 肠道菌群多样性

3周龄时，3个实验组大鼠肠道菌群丰富度指标Chao1指数（P=0.3508）、多样性指标Shannon指数（P=0.5405）和均匀度指标Pielou_e指数（P=0.8454）差异均无统计学意义，但主坐标分析图显示3个实验组之间肠道菌群β多样性差异有统计学意义（P<0.001）。7周龄时，SHR肠道菌群丰富度（P<0.01）、多样性（P<0.001）和均匀度（P<0.0001）低于WKY，而生命早期BD-1干预能够增加SHR肠道菌群的丰富度（P<0.001）、多样性（P<0.01）和均匀度（P<0.01）。主坐标分析图显示3个实验组之间肠道菌群β多样性的差异有统计学意义（P<0.001，图4）。

2.5 肠道菌群物种组成

肠道菌群门水平相对丰度前5位柱状图显示，3周龄和7周龄时肠道菌群均以Firmicutes和Bacteroidota为主。3周龄时二者在各组中差异不明显，但7周龄时SHR肠道菌群的Firmicutes/Bacteroidota（F/B）值高于WKY，生命早期BD-1干预能够降低SHR肠道菌群的F/B值（图5）。肠道菌群属水平相对丰度前10位柱状图显示，3周龄和7周龄时肠道菌群各组间均具有较大差异（图6）。

3周龄时各组间肠道菌群属水平比较结果显示，SHR肠道菌群中，Bacterroides、Romboutsia相对丰度低于WKY，Clostridia_UCG-014相对丰度高于WKY（P<0.05）。与SHR相比，生命早期BD-1干预增加了Bifidobacterium的相对丰度（P<0.05，图7）。

7周龄时各组间肠道菌群属水平比较结果显示，SHR肠道菌群中，Muribaculaceae、Bacteroides、Blautia相对丰度低于WKY，Lactobacillus、Clostridia_UCG-014、Bacillus相对丰度高于WKY（P<0.05）。与SHR相比，生命早期BD-1干预增加了Muribaculaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcus的相对丰度，降低了Clostridia_UCG-014、Romboutsia的相对丰度（P<0.05，图8）。

3 讨论

本研究对新生雌性ADHD模型大鼠SHR灌胃两歧双歧杆菌BD-1至断乳，发现该菌株能够缓解SHR幼年期的多动行为，同时可促进SHR肠道菌群多样性的发展、并显著改变其群落结构，促进外周免疫功能发育以及抑制中枢神经炎症。

尽管既往有研究采用益生菌对ADHD患者进行干预，但在动物水平上仍缺乏相关的机制研究，尤其是使用雌性ADHD模型的研究。有学者采用Bifidobacterium animalis subsp. lactis A6干预雄性SHR，发现该菌株可以改善雄性SHR的空间工作记忆缺陷，抑制海马神经元丢失^［10］。本研究进一步发现，生命早期BD-1干预能够缓解雌性SHR幼年期多动行为。男性和女性ADHD患者在症状表现上有一定差异，但目前暂无研究表明针对ADHD的防治方法上需要考虑性别差异。尽管肠道菌群本身具有一定的性别差异，但这种差异对益生菌早期干预缓解ADHD效果的影响可能有限^［17］。本研究发现了益生菌干预也对雌性ADHD动物模型具有改善作用。

肠道菌群多样性与ADHD密切相关。有研究表明，与正常对照相比，ADHD患者肠道菌群α和β多样性均有显著下降^{［18， 19］}。此外，F/B值失衡也与多种疾病相关，例如肥胖、结肠炎等^［20］。同样地，本研究也发现雌性SHR在7周龄时肠道菌群的α多样性低于WKY，而生命早期BD-1干预有利于增加雌性SHR幼年期肠道菌群的丰富度、多样性和均匀度，同时降低其F/B值，有利于多动行为的缓解。此外，该ADHD模型在肠道菌群组成上与人群研究结果相似。例如，ADHD患儿肠道菌群中Bacteroides的相对丰度低于正常儿童^［1］，本研究也发现在3周龄和7周龄时雌性SHR的Bacteroides显著低于WKY。Lachnospiraceae以及Ruminococcus gnavus在ADHD患儿肠道菌群中减少^［21］，而生命早期BD-1干预显著增加了雌性SHR在7周龄时Lachnospiraceae以及Ruminococcus的相对丰度，间接提示了BD-1应用于ADHD患儿干预研究中的可能性。

在特定肠道菌群中，双歧杆菌在ADHD患儿肠道中降低^［2］。本研究发现，生命早期两歧双歧杆菌BD-1在3周龄时能够增加雌性SHR的Bifidobacterium相对丰度。尽管这种促进作用并未持续至第7周，但雌性SHR的肠道菌群组成仍有较大且持续的变化。至7周龄时，Muribaculaceae相对丰度在SHR组中显著低于WKY组，但在BD-1干预后增加；Clostridia_UCG-014相对丰度在SHR组中高于WKY组，但在BD-1干预后减少，因此这两种肠道菌群被认为是与ADHD高度相关的关键菌群。研究表明，Muribaculaceae可利用多糖产生短链脂肪酸^［22］，短链脂肪酸可直接调节机体免疫功能^［23］。Clostridia_UCG-014在高脂饮食干预下增长，表明其与脂质代谢异常及其引起的慢性低度炎症相关^［24］。因此，Muribaculaceae和Clostridia_UCG-014可能通影响大脑免疫反应，从而参与ADHD的发生发展过程。生命早期BD-1干预可通过促进Muribaculaceae的生长和抑制Clostridia_UCG-014的生长从而缓解SHR的多动行为。

研究表明，中枢神经炎症与ADHD高度相关^［9］。有研究发现SHR大脑中活化小胶质细胞数量以及TNF-α水平增加^［8］，本研究发现生命早期BD-1干预可减少雌性SHR前额皮质中小胶质细胞的活化，从而缓解雌性SHR的多动行为。但目前在临床中仍缺乏ADHD患者神经炎症相关的研究，仅有一项早期研究发现在ADHD患者脑脊液中存在较高水平的促炎因子TNF-β和较低水平的抗炎因子IL-4^［25］。

此外，ADHD还存在外周炎症反应，如在ADHD儿童血清中发现IL-6和IL-10水平高于正常儿童^{［26，27］}。Treg细胞参与到维持免疫稳态中^［28］，且在抑郁症中具有神经保护作用^［29］。本研究发现雌性SHR肠系膜淋巴结和脾脏中Treg细胞数量低于WKY，表明SHR存在一定的外周免疫缺陷。但生命早期BD-1干预能够增加二者细胞数量，表明BD-1干预可能通过增加Treg细胞数量，从而对幼年期ADHD发挥神经保护作用。

多巴胺能神经系统的失衡是ADHD的病因假说之一^［30］。多巴胺转运体敲除大鼠表现出过度活跃的行为^［31］。Th是催化酪氨酸生成多巴胺的限速酶^［32］，在ADHD模型SHR中表达降低^［33］。本研究发现生命早期BD-1干预能够增加雌性SHR纹状体中Th的表达，这表明其有助于多巴胺能神经系统功能的恢复。有研究表明，多巴胺能神经系统和神经炎症之间还存在一定的相互作用。例如在帕金森病大鼠模型中，多巴胺受体1的激活可抑制小胶质细胞的活化，从而缓解认知障碍^［34］。然而，在ADHD中多巴胺能神经系统和神经炎症的相互作用仍需深入研究。

综上，在生命早期对新生雌性SHR灌胃BD-1后，在幼年期雌性SHR多动行为得到缓解。该菌株干预有利于多巴胺能神经系统的发育，抑制前额皮质小胶质细胞活化，促进外周Treg细胞发育。同时，该菌株有利于促进肠道菌群多样性，并促进Muribaculaceae、抑制Clostridia_UCG-014的生长，从而缓解多动行为。本研究为以肠道菌群为靶点的ADHD早期预防以及两歧双歧杆菌BD-1作为精神益生菌的应用和发展提供了科学依据。

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