正肝方对二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠的抗癌作用及机制：基于激活Hippo/YAP通路

Zheng Gan Decoction inhibits diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma in rats by activating the Hippo/YAP signaling pathway

摘要

目的 探讨正肝方通过调控Hippo/YES-相关蛋白同源癌蛋白（YAP）信号通路对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌大鼠模型的抗癌作用及对肝癌潜在的抑制机制。 方法 将80只SD大鼠随机分为正常对照组（n=10）、造模组（n=70）。造模组通过连续12周腹腔注射DEN（50 mg/kg）建立肝癌模型。建模成功后，随机分为5组：模型对照组、阳性对照组（槐耳颗粒，4 g/kg）、正肝方低、中、高剂量组（2、4、8 g/kg），n=10。各组接受相应药物干预，1次/d，持续17周。正常对照组和模型组仅灌喂等量纯水。观察大鼠生存状况和生存率，并测定体质量、肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数。观测大鼠肝脏组织的形态变化。通过HE染色观察组织病理变化。利用免疫组化技术检测组织中YAP及p-YAP的表达水平。Western blotting检测组织中Hippo/YAP通路中YAP、p-YAP、MST1、LATS1和p-LATS1等相关蛋白表达。 结果 与正常对照组相比，模型对照组大鼠生存状况较差，生存率降低，体质量、肝脏指数、脾脏指数升高（P<0.01），胸腺指数降低（P<0.05）。正肝方治疗后，肝脏指数、脾脏指数降低（P<0.05），胸腺指数升高（P<0.01）。大鼠肝脏组织形态及HE染色结果表明，模型组肝小叶结构受损，肝细胞排列紊乱，正肝方治疗后这些病理变化得到改善。免疫组化结果显示，与模型对照组相比，在正肝方低、中、高剂量组及阳性对照组中，YAP的阳性表达水平逐渐减弱，且与正肝方的剂量呈负相关（P<0.01）；而p-YAP的阳性表达则逐渐增强（P<0.01），且与正肝方的剂量呈正相关（P<0.01）。Western blotting结果显示，与模型对照组相比，在接受正肝方治疗的各剂量组中，随着药物浓度的增加，YAP蛋白表达水平随着药物剂量的增加而降低（P<0.001），p-YAP的阳性表达水平逐渐升高，尤其在高剂量组中这一变化更为明显（P<0.001）；正肝方各剂量组及槐耳颗粒组治疗组的组织中MST1蛋白表达明显升高（P<0.05）。同时，正肝方用药组的组织中，LATS1和p-LATS1蛋白的水平也明显升高，且与正肝方的剂量呈正相关。 结论 正肝方可以通过调节激活Hippo信号通路的关键蛋白，上调MST1蛋白表达，激活LATS1，活化的LATS1进而调控下游靶点YAP表达，将其磷酸化，降低其含量，从而抑制到肝癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡的作用。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of Zheng GanDecoction (ZGF) on tumor progression in a rat model of diethylnitrosamine (DEN)-induced hepatocellular carcinoma (HCC) and explore the possible mechanism. Methods Seventy SD rats were subjected to regular intraperitoneal injections of DEN (50 mg/kg) for 12 weeks to induce HCC tumorigenesis, with another 10 rats receiving saline injections as the normal control. After successful modeling, the rats were randomized into 5 groups (n=10) for daily treatment with distilled water ( model group), Huaier Granules (4 g/kg; positive control group), or ZGF at low, medium, and high doses (2, 4, and 8 g/kg, respectively) via gavage for 17 weeks. Body weight changes of the rats were monitored, and after completion of the treatments, the rats were euthanized for measurement of liver, spleen and thymus indices and morphological and histopathological examinations of the liver tissues using HE staining. The expressions of YAP, p-YAP, MST1, LATS1 and p-LATS1 in the liver tissues were detected using immunohistochemistry and Western blotting. Results Compared with the normal control rats, the rat models with DEN-induced HCC exhibited much poorer general condition with a significantly reduced survival rate, increased body weight and liver and spleen indices, and a lowered thymus index. ZGF treatment obviously reduced liver and spleen indices, increased the thymus index, and improved pathologies of the liver tissues of the rat models. Immunohistochemistry and Western blotting showed a dose-dependent reduction of YAP expression and an increment of p-YAP expression in ZGF-treated rats, which also exhibited significantly upregulated hepatic expressions of MST1, LATS1 and p-LATS1. Conclusion ZGF inhibits DEN-induced HCC in rats by activating the Hippo/YAP pathway via upregulating MST1 and LATS1 expression, which promotes YAP phosphorylation and degradation to suppress proliferation and induce apoptosis of the tumor cells.

Graphical abstract

关键词

正肝方 / 肝癌 / Hippo/YAP通路 / 作用机制 / 二乙基亚硝胺

Key words

Zheng Gan Decoction / hepatocellular carcinoma / Hippo/YAP pathway / therapeutic mechanism / diethylnitrosamine

癌症已成为全球第2大致死原因，其发病率在全球范围内持续上升，给全球公共卫生系统带来了沉重的经济负担，构成了一项全球性的健康威胁^［1］。在我国，根据第3次全国死因回顾性调查显示，肝癌已成为继肺癌后的第2大常见癌症死因，其发病率呈逐年增加趋势^{［2， 3］}。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌 （ICC）和其他罕见肿瘤类型，其中HCC的发病率最高，约占90%^［4］。研究表明，病毒感染、过量饮酒、肥胖和黄曲霉毒素等因素是肝癌的主要致病因素，同时还与个体差异（如年龄、性别和种族）、遗传因素及肝脏自身免疫性疾病等相关^{［5， 6］}。随着医疗技术的发展，肝癌的治疗方法多样化，包括动脉放化疗栓塞、靶向抑制剂、单克隆抗体治疗、免疫疗法、纳米疗法、肝移植等，但肝癌患者面临的高复发率、低生存率和高治疗费用等问题仍待解决^［7-15］。目前，现代医学在防治肝癌仍存在不足，治疗主要以对症治疗为主。然而，越来越多的研究和临床实践表明，中医药在治疗肝癌及预防肝癌进展方面具有独特优势和广阔前景^［16］。中医药以其多成分、多靶点的协同效应而受到关注。近年来，筛选出具有良好疗效、副作用小且能显著治疗肝癌中药复方，如鳖甲煎丸^［17］、益脾养肝方^［18］和抗纤抑癌方^［19］，已成为中医药研究的热点，为肝癌及癌前病变药物的研发带来了新希望。

正肝方是由深圳市名老中医杨大国教授经过近50年的研究和临床验证所创立的一种治疗肝癌的经验方，目前已在北京中医药大学深圳医院（龙岗）及深圳市第三人民医院中西医结合肝病科广泛用于治疗肝炎、中晚期肝硬化和肝癌患者。该方主要由黄芪、女贞子、枸杞子、丹参、川芎、醋鳖甲、三棱、莪术、重楼和白花蛇舌草十味中药组成。长期的临床研究显示^［20］，正肝方在治疗肝硬化伴高甲胎蛋白血症和预防肝癌术后复发方面具有显著疗效。动物实验研究表明^［21］，正肝方能有效抑制黄曲霉素B1诱发的肝癌，通过抑制化学致癌物引起的肝细胞恶性转化和异常增生，从而抗肝损伤和保护肝功能。细胞实验结果显示^［22］，正肝方含药血清能显著下调肝癌细胞甲胎蛋白（AFP）的表达，诱导HepG2细胞凋亡。课题组前期的动物模型研究也证实^［23］，正肝方通过抑制PTEN/PI3K/AKT通路的激活，改善肝功能指标和肝癌病变状况，提高机体免疫力，进一步证实了其在治疗肝癌中的重要作用。生物信息学及动物实验研究表明^［24］，正肝方可能通过CASP3、Bcl-2等核心蛋白靶点，调控Hippo信号通路发挥抗肝癌的作用。然而，正肝方对肝癌治疗的具体影响及其作用机制仍需进一步研究。因此，本研究旨在基于Hippo/YAP信号通路，探讨正肝方对DEN诱导的肝癌大鼠模型的抗癌作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，5周龄，体质量200±20 g，共80只，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2023-0001。动物实验方案经湖北民族大学医学部伦理委员会批准（伦理批号：2023-20），所有实验程序均按照中国国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行。

1.1.2 主要药物

正肝方由黄芪50 g、丹参30 g、白花蛇舌草30 g、枸杞子30 g、醋鳖甲30 g、酒女贞子30 g、醋三棱10 g、醋莪术10 g、重楼10 g和川芎10 g十味中药组成。本实验中正肝方各成分均购自广东一方制药有限公司，由北京中医药大学深圳医院中药房代为购买，药品批号、剂量、规格（表1）。槐耳颗粒购自启东盖天力药业有限公司（批号：Z20000109），药品规格为20 g/袋。

1.1.3 试剂

二乙基亚硝胺（DEN），［分子式（C2H5）2NNO，0.95 g/mL，纯度>99%，sigma］；0.9%NaCl （sigma）。Western封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、Yes相关蛋白（YAP）兔抗、哺乳动物不育系20样激酶1（MST1）鼠抗、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶标记兔二抗（碧云天）。HRP标记的山羊抗鼠lgG抗体、大肿瘤抑制激酶1LATS1）抗体、磷酸化LATS1（p-LATS1）抗体、磷酸化YAP（p-YAP1）抗体（博泰克），免疫组化试剂盒（博士德）。苏木素-伊红染色液（索莱宝），BCA蛋白浓度测定试剂盒（恩晶生物），蛋白酶抑制剂（PMSF）、磷酸酶抑制剂（索莱宝科技），ECL超敏better发光液（艾普诺生物）。

1.1.4 仪器

恒温培养箱（上海博迅实业）；全波长酶标仪、凝胶成像系统Fluor ChemE凝胶成像系统（Thermo Fisher Scientific）；全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；石蜡切片机（Leica Biosystems）；正置光学显微镜（Nikon）；电泳及转膜系统（Bio-Rad），高精度电子天平（北京赛多利斯科学仪器），高速冷冻离心机（Eppendorf），全自动组织匀浆仪（Roche）。

1.2 方法

1.2.1 药物配置

药物剂量按照成人与大鼠体表面积进行换算^［25］，饮片-冲剂剂量换算后，一副正肝方饮片冲剂剂量为90.82 g。90.82÷70×6.3≈8 g/kg，设高量组为成人剂量（8 g/kg），中、低剂量组分别为成人量的1/2倍（4.0 g/kg）和1/4倍（2.0 g/kg），分别用纯水溶解配成0.8、0.4、0.2 g/mL中药冲剂。槐耳颗粒人的每日用量为60 g/d，换算大鼠的等效剂量为60/70×6.3≈5.4 g/kg，加入纯水配制成0.54 g/mL混悬液。

1.2.2 动物造模及分组给药

将80只SD雄性大鼠适应性喂养1周后进行实验分组，随机分为2组，分别为正常对照组（10只）、造模组（70只）。采取DEN诱导法建立肝癌大鼠模型^［24］，造模组大鼠第2~4周，每周2次腹腔注射12%的DEN，第5~12周，1次/周腹腔注射12%的DEN，注射剂量均为50 mL/kg，同时对正常对照组大鼠按同等容积腹腔注射生理盐水。期间观察大鼠各种体征变化。1次/周测量大鼠体质量。12周后，随机取DEN造模组大鼠5只，解剖查看肝脏病变情况。

在成功建立DEN诱导的肝癌大鼠模型后（15只大鼠在造模期间死亡），将50只实验大鼠随机分为5组，即模型对照组、槐耳颗粒组、正肝方低、中和高剂量组，n=10。正常对照组和模型对照组大鼠按照按10 mL/kg灌胃纯水，正肝方低、中和高剂量组分别灌胃2、4和8 g/kg中药水剂。药物干预1次/d，干预4周。测量大鼠体质量1次/周。槐耳颗粒按10 mL/kg剂量灌胃。

1.2.3 样本的采集

取材前1 d晚上禁食不禁水，次日（最后1次干预后>12 h）称重后，10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后收集大鼠血清与肝脏、肾脏、脾脏和胸腺组织。（1）肝脏、肾脏、脾脏和胸腺：放在4 ℃生理盐水中洗净后，除去表面结缔组织，用滤纸吸干后称取质量并拍照；（2）正常对照组取肝脏尾叶于4%多聚甲醛中固定，其余部分液氮速冻后存放于-80 ℃。其余组剥离肝脏上肿瘤后，选取一个典型的肿瘤平均分成2份，一份用4%多聚甲醛固定，另一份液氮速冻后存放于-80 ℃。

1.2.4 观察大鼠的生存状态、生存率

实验期间，参照参考文献［26］每天观测并记录各组大鼠的精神状态、毛发颜色、出血情况、饮食情况、大小便状况、行为学习惯以及腹部膨隆等，并给予评分。评分标准为：精神状态好（+0分）、一般（+1分）、差（+2分）；毛发正常（+0分）、暗淡发黄（+1分）/掉毛（+1分）；无出血（+0分）、尾巴瘀斑淤点/鼻孔出血有轻微出血（+1分）、尾巴瘀斑淤点/鼻孔出血有明显出血（+2分）；饮食正常（+0分）、进食饮水量略有减少（+1分）、进食饮水明显减少（+2分）；二便正常（+0分）、二便减少或增多轻度（+1分）、重度（+2分）；腹部形态正常（+0分）、腹部形态轻度膨隆（+1分）、重度膨隆（+2分）。在成功建立DEN诱导的肝癌大鼠模型后，将实验组大鼠与正常对照组一同纳入后续的药物干预研究。在实验期间，每日对各组大鼠的精神状态、毛发颜色、出血情况、饮食习惯、排便状况、行为表现以及腹部膨胀等进行观察并进行详细记录。

1.2.5 DEN肝癌模型大鼠体质量变化

每周称量各组大鼠体质量，并进行记录，计算各组大鼠平均体质量，并且观察各组大鼠平均体质量变化情况。

1.2.6 脏器指数计算

解剖大鼠后将肝脏、脾脏和胸腺组织取出，放在4 ℃生理盐水中洗净，除去表面结缔组织，用滤纸吸干后称取质量，根据脏器指数计算公式：脏器指数=脏器质量（mg）/体质量（g）进行计算肝脏及免疫器官指数。

肝脏指数（mg/g）=肝脏质量（mg）/体质量（g）

脾脏指数（mg/g）=脾脏质量（mg）/体质量（g）

胸腺指数（mg/g）=胸腺质量（mg）/体质量（g）

1.2.7 DEN肝癌模型大鼠肝组织形态变化

将肝脏组织取出并用生理盐水中洗净后，用滤纸吸干后进行拍照观察其形态变化。

1.2.8 HE染色

肝脏组织经过二甲苯中脱蜡、梯度乙醇浸泡、蒸馏水冲洗，再用苏木素染色、盐酸酒精分化后伊红浸染，然后脱水透明，最后封片、镜下观察并拍照。

1.2.9 免疫组化染色检测

肝脏组织经过二甲苯中脱蜡、系列乙醇复水、热修复抗原、封闭、滴加适当稀释的一抗（YAP、p-YAP），二抗（山羊抗兔IgG），滴加SABC，DAB显色，苏木素复染。脱水，透明，最后用中性树胶封片，详细步骤见^［27］。

1.2.10 Western blotting

将肝脏或肿瘤样本，加入含PMSF的裂解液，加入磷酸酶抑制剂，在匀浆机进行匀浆，匀浆结束后离心4 ℃、12 000 r/min离心3 min，再进行60 Hz超声1 min，取上清液，采用BCA试剂盒定量蛋白浓度后分装，-80 ℃保存。取样本蛋白20 µg进行SDS-PAGE电泳、转膜和封闭后加入相应一抗（1∶1000），于4 ℃冰箱孵育过夜。其中GAPDH抗体（1∶2000）、YAP抗体（1∶2000）、p-YAP抗体（1∶1000）、MST1抗体（1∶1000）、LATS1抗体（1∶500）、p-LATS1抗体（1∶500）。洗膜后加入二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，洗膜后加入ECL化学发光试剂，显影并用显色仪拍照；最后用ImageJ软件对相应蛋白条带进行灰度分析。

1.3 统计学分析

数据分析采用SPSS22.0统计软件，结果以均数±标准差表示。组间差异的比较通过单因素方差分析进行。多组间的比较同样采用单因素方差分析，并在必要时通过最小显著差异（LSD）检验进行两两比较。对于不符合正态分布的数据，采用非参数检验方法。当P<0.05时认为差异具有统计学意义。图形制作使用GraphPad Prism（版本9.0）和Origin（版本2022）。

2 结果

2.1 肝癌模型大鼠的制备

12周后，随机取DEN造模大鼠5只，解剖查看肝脏病变情况，结果显示，5只大鼠肝脏均发生病变，大鼠肝脏体积明显肿大，肉眼可见大小不一的结节，直径大约在3~5 mm，结节数量在4~6个，其中两只大鼠出现血性腹水，肝脏表面凹凸不平，色泽晦暗，呈暗红色或棕褐色，质地变硬，肝脏表面可见多个大小不一的结节或肿块，部分区域可能出现坏死、出血或钙化，说明造模成功（图1）。

2.2 正肝方对各组大鼠生存状态、生存率的影响

基于各组大鼠的精神状态、毛发颜色、出血情况、饮食习惯、排便状况、行为表现以及腹部膨胀等观察指标对大鼠的生存状态进行评分（图2）。

正常对照组的大鼠表现出健康的生理特征，如毛发光泽、精神状态良好、饮食正常、排便功能正常，并且体质量稳步增加。相比之下，模型对照组和接受正肝方低剂量治疗的大鼠出现了明显的健康问题，如毛发变黄、失去光泽，部分出现脱毛；排便稀薄，部分大鼠出现鼻出血和尾部瘀斑，饮食和饮水量减少。与模型对照组相比，接受正肝方中剂量和高剂量治疗的大鼠，以及阳性对照组的大鼠，表现出明显的健康改善，如毛发恢复光泽，精神状态和活动水平正常。药物干预开始后，对大鼠的生存率进行了跟踪记录，从结果中可以看出，实验期间，空白对照组的大鼠未出现死亡情况。相比之下，模型对照组的大鼠生存率逐渐下降并在后期趋于稳定。在接受药物治疗的各组中，肝癌模型大鼠的生存率与药物剂量呈现正相关，其中正肝方高剂量组的生存率最高（P<0.05，图3）。

2.3 正肝方对各组大鼠体质量的影响

正常对照组大鼠的体质量呈现稳定的上升趋势，模型对照组以及正肝方各剂量治疗的大鼠，在造模期间体质量下降。当停止造模并开始药物治疗后，各用药组大鼠的体质量逐渐恢复，尤其是在正肝方中剂量、高剂量组以及阳性对照组中，体质量回升趋势更为明显（P<0.01，图4）。

2.4 正肝方对各组大鼠肝脏指数、脾脏指数和胸腺指数的影响

与正常对照组相比，模型对照组及正肝方低剂量的大鼠在肝脏指数和脾脏指数增高（P<0.01），胸腺指数相对较低（P<0.05）；然而，接受正肝方中剂量和高剂量组的大鼠，以及阳性对照组的大鼠，在肝脏指数方面显示出明显的下降（P<0.05），脾脏指数也有所下降，尤其是在高剂量组中更为明显（ P<0.05）。中剂量组和高剂量组的胸腺指数提高，尤其是中剂量组（P<0.01，表2）。

2.5 正肝方对大鼠肝脏组织形态变化的影响

正常对照组大鼠的肝脏红润且有光泽的外观，质地柔软，边缘清晰锐利。相比之下，模型对照组以及接受正肝方低剂量组的大鼠的肝脏则显示出明显的病理改变，包括暗淡且无光泽的外观，颜色偏黄，表面粗糙且缺乏光滑感，质地较硬，轻微肿大，边缘圆钝并带有皱褶和颗粒状结节。此外，肝脏表面可见白色肿瘤病灶、血痂和大量散在的颗粒状结节。与模型对照组相比，正肝方中剂量组和高剂量组的大鼠在肝脏组织形态上表现出显著的改善。这些改善包括肝脏的色泽和表面粗糙度有所恢复，肝脏肿大程度降低，以及肿瘤病灶和颗粒状结节的数量减少（图5）。

2.6 HE染色法观察正肝方对大鼠肝脏组织病理学变化的影响

在正常对照组中，大鼠的肝小叶结构保持正常，肝细胞大小规则，排列有序。相比之下，模型对照组大鼠的肝小叶结构出现破坏，肝脏组织重构，汇管区形成索状结构，呈现出肝硬化的典型病理特征。此外，观察到大面积坏死区域，肝细胞排列紊乱，细胞间隙不明显，细胞核皱缩，以及大小不一的异型细胞核。在这些区域内，还可见到排列疏松、分化程度较低的肝癌细胞病灶。与模型对照组相比，正肝方各剂量组的大鼠以及阳性对照组在肿瘤组织中坏死面积有所减小。随着正肝方剂量的增加，大鼠肝组织的病变程度呈现出改善，肝细胞排列趋于规则，核型更加均一（图6）。

2.7 免疫组化检测正肝方对大鼠肝脏组织中Hippo通路关键分子YAP、p-YAP表达的影响

正常对照组大鼠的肝脏组织中YAP表达较低，模型对照组中YAP的表达增加，表现为强阳性（P<0.0001， 图7，图9）。在正肝方治疗组中，随着药物剂量的增加，YAP的阳性表达逐渐减弱。在肝癌组织中，YAP主要在细胞核中表达，胞质内也有表达，呈现棕黄色颗粒状，而胞核内则呈棕褐色浓集（图7）。

与YAP的表达趋势相反，p-YAP在正常对照组中主要在胞浆中表达，少量表达于胞核中。与正常对照组相比，模型对照组中p-YAP的阳性表达降低。经过正肝方治疗后，各治疗组肝组织内p-YAP的相对阳性细胞数减少（P<0.01），且随着正肝方剂量的增加，阳性表达逐渐增强（图8、9）。

2.8 Western blotting检测正肝方对大鼠肝脏组织中Hippo通路相关蛋白表达的影响

与正常对照组相比，模型对照组大鼠肝组织中YAP蛋白水平升高（P<0.001）。在接受正肝方和阳性对照药物治疗的大鼠中，YAP蛋白表达水平随着药物剂量的增加而降低，特别是在正肝方高剂量组和槐耳颗粒组中，这种下降更为明显（P<0.001）。与此相反，p-YAP蛋白在正常对照组中的表达水平较高，而在模型对照组和正肝方低剂量组中降低（P<0.001、P<0.01）。随着正肝方剂量的增加，p-YAP蛋白表达水平在治疗组中逐渐升高，尤其是在高剂量组中更为明显（P<0.001）（图10）。

与正常对照组相比，模型组大鼠肝组织中MST1蛋白的水平显著升高（P<0.05），表明肝癌状态下MST1的活性增加。在接受正肝方各剂量治疗的大鼠中，以及槐耳颗粒组治疗的大鼠中，MST1蛋白的表达水平明显高于模型组（P<0.05），尤其是在正肝方高剂量组和槐耳颗粒组中，MST1的表达增强（P<0.01），且这种增强呈现出与药物剂量相关的趋势（P<0.01）。与模型组相比，接受正肝方治疗的大鼠肝癌组织中，LATS1和p-LATS1蛋白的水平提高，且这种提升随着正肝方剂量的增加而增强。特别是在正肝方高剂量组和槐耳颗粒组中，LATS1蛋白的表达水平增加，在正肝方中剂量组中，p-LATS1蛋白的表达水平同样提高（图11、12）。

3 讨论

本研究以Hippo信号通路为切入点，深入探讨正肝方对肝癌的影响及其分子机制。实验采用DEN诱导的肝癌大鼠模型，发现经正肝方治疗后，治疗组大鼠的生存状态更佳，生存率更高，体质量逐渐回升。治疗后的肝脏指数显著下降、脾脏指数有所下降，胸腺指数升高，显示出显著的统计学差异。用药组的肝脏色泽、粗糙度和肿大程度均有所改善，肿瘤组织中坏死面积减小。免疫组化显示，正肝方低、中、高剂量组及阳性对照组中，YAP的阳性表达减弱，经治疗后，各治疗组肝组织内p-YAP的相对阳性细胞数减少。Western blotting显示，用药组的组大鼠肝组织中 MST1 、LATS1、p-LATS1蛋白水平均明显增高，并随着正肝方剂量的增加而增高，YAP蛋白表达水平随着药物剂量的增加而降低。

动物模型是研究原发性肝癌发病机制及药物治疗的重要载体，建模方法包括自发型、诱发型、移植型和基因修饰型等，其中二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌大鼠模型与人类致癌过程相似，可模拟肝损伤－肝炎－肝硬化－肝癌的进展过程，成为肝癌实验研究中的经典模型^［28-30］。YAP在肝癌、食管癌、卵巢癌等多种癌症中维持肿瘤干细胞的特性，其过度激活可能促进肿瘤干细胞的自我更新和分化能力，在一定情况下甚至可以将癌细胞重新编程为肿瘤干细胞，从而促进肿瘤的发生、发展和转移^［31-33］。研究发现，通过免疫组化检测三阴性乳腺癌细胞中YAP的表达情况，对照组中YAP蛋白呈强阳性表达，经穿心莲内酯处理后，与对照组相比YAP蛋白的阳性表达降低，这表明YAP在肿瘤细胞中的强表达与肿瘤的发展密切相关^［34］。此外，通过研究粉防己碱对乳腺癌多重耐药的影响^［35］，发现粉防己碱能够激活Hippo信号通路，上调MST1蛋白表达，激活LATS1，进而减少下游靶点YAP1的表达，并促进YAP1的磷酸化，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和分化，发挥抗肿瘤作用。在研究紫草素对肝脏特异性Nf2基因敲除小鼠肝脏Hippo通路相关蛋白的影响时^［36］，发现上游信号Merlin蛋白的缺失导致下游LATS1和YAP蛋白磷酸化水平下降，细胞中YAP蛋白水平增加。紫草素治疗组则促进了LATS1和YAP蛋白的磷酸化，并抑制了YAP蛋白的表达，表明紫草素可以通过调节Hippo信号通路显著抑制肝脏特异性Nf2基因敲除小鼠肝癌进程中的胆管增生。

Hippo信号通路被癌症基因组图谱定义为与肿瘤密切相关的信号通路之一。Hippo信号转导通路在抑制肿瘤方面发挥着关键作用，主要通过磷酸化依赖的蛋白激酶级联进行调控。它在细胞增殖调节、组织器官生长及细胞生长环境稳定等方面具有重要影响，被认为是维持肝脏稳态和抑制肿瘤形成的重要调节因子^{［37， 38］}。当Hippo通路接收到上游的活化信号时，Mst1/2激酶发生磷酸化，进而激活Lats1/2激酶，并在Sav1的协助下激活Mob1辅助因子。活化的Lats1/2会磷酸化下游效应分子YAP及TAZ，使磷酸化的YAP和TAZ与14-3-3蛋白结合，在细胞质中滞留，失去其转录共激活功能^{［39， 40］}。研究还发现，YAP第381位丝氨酸被Lats1/2磷酸化后，会促使其他位点的丝氨酸被CKδ/ε磷酸化，并最终通过泛素-蛋白酶体途径被降解^［41-44］。相反，若YAP未被磷酸化，则会转移到细胞核内，与转录因子TEAD形成复合物，激活下游靶基因。若靶基因被异常活化，则导致疾病的发生。一系列研究表明^［45］，Hippo信号通路在肝癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、结肠癌等癌症中处于失调状态，表现为与相应的正常组织相比，MST1/2、LATS1/2表达下调，YAP/TAZ呈高表达或活性增加^［46］。在正常肝脏中，Hippo通路上的激酶可以通过抑制肝细胞增殖和维持肝细胞的分化以维持肝脏组织的一般生理功能^［47］。相反，当Hippo信号通路上如Sav1^［48］ 、Mst1/2^［49］、Lats1/2^［50］等激酶活性降低或缺失，则容易刺激肝细胞持续增殖，最终导致肝肿大或肝癌。研究表明^［51］，YAP在胚胎干细胞（ES）分化过程中容易失活，并在细胞的自我更新中起着关键作用。此外，肝脏作为机体最大的代谢器官，参与蛋白质、脂肪、糖类、维生素和激素等代谢，然而YAP / TAZ 可以通过参与代谢调节，例如促进葡萄糖酵解、脂肪酸生成和谷氨酰胺分解等抑制抗氧化应激诱导的细胞死亡，从而导致肿瘤的发生^［52］。

本研究以Hippo信号通路为切入点，深入探讨正肝方对肝癌的影响及其分子机制，正肝方可能通过调节Hippo信号通路的关键蛋白，如MST1和LATS1，进而影响YAP的活性，从而在肝癌的发生和发展中发挥重要作用。未来我们将进一步探索正肝方在调节Hippo信号通路以及其他相关信号通路中的具体作用， 以及其在肝癌治疗中的长期效果和安全性，为肝癌患者提供更有效的治疗选择。

参考文献

[1] 邱海波, 曹素梅, 徐瑞华. 基于2020年全球流行病学数据分析中国癌症发病率、死亡率和负担的时间趋势及与美国和英国数据的比较[J]. 癌症, 2022, 41(4): 165-77.

[2] Cao MM, Li H, Sun DQ, et al. Current cancer burden in China: epidemiology, etiology, and prevention[J]. Cancer Biol Med, 2022, 19(8): 1121-38.

[3] Anwanwan D, Singh SK, Singh S, et al. Challenges in liver cancer and possible treatment approaches[J]. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2020, 1873(1): 188314.

[4] Sia D, Villanueva A, Friedman SL, et al. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis[J]. Gastroenterology, 2017, 152(4): 745-61.

[5] Hernández-Aquino E, Muriel P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms[J]. World J Gastroenterol, 2018, 24(16): 1679-707.

[6] Li YT, Zhang RH, Xu Z, et al. Advances in nanoliposomes for the diagnosis and treatment of liver cancer[J]. Int J Nanomedicine, 2022, 17: 909-25.

[7] Chen WQ, Chiang CL, Dawson LA. Efficacy and safety of radiotherapy for primary liver cancer[J]. Chin Clin Oncol, 2021, 10(1): 9.

[8] Demir T, Lee SS, Kaseb AO. Systemic therapy of liver cancer[J]. Adv Cancer Res, 2021, 149: 257-94.

[9] Han QH, Du LZ, Zhu LL, et al. Review of the application of dual drug delivery nanotheranostic agents in the diagnosis and treatment of liver cancer[J]. Molecules, 2023, 28(20): 7004.

[10] Xiang Z, He CY, Lu D, et al. Editorial: liver transplantation for liver cancer in the era of transplant oncology: accurate diagnosis and treatment[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1276566.

[11] He L, Peng XC, Chen N, et al. Automated treatment planning for liver cancer stereotactic body radiotherapy[J]. Clin Transl Oncol, 2023, 25(11): 3230-40.

[12] Pérez-López A, Martín-Sabroso C, Gómez-Lázaro L, et al. Embolization therapy with microspheres for the treatment of liver cancer: State-of-the-art of clinical translation[J]. Acta Biomater, 2022, 149: 1-15.

[13] Liu XF, Lu Y, Qin SK. Atezolizumab and bevacizumab for hepatocellular carcinoma: mechanism, pharmacokinetics and future treatment strategies[J]. Future Oncol, 2021, 17(17): 2243-56.

[14] Chen JH, Jin HW, Zhou H, et al. Research into the characteristic molecules significantly affecting liver cancer immunotherapy[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1029427.

[15] Johnston MP, Khakoo SI. Immunotherapy for hepatocellular carcinoma: current and future[J]. World J Gastroenterol, 2019, 25(24): 2977-89.

[16] Li K, Sun H, Wu CX. Research progress of compound injection of traditional Chinese medicine in the treatment of liver cancer[J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2022, 30(9): 1007-11.

[17] 钟晓丹, 文 彬, 孙海涛, 等. 鳖甲煎丸通过NF-κB信号通路抑制肝癌细胞上皮间质转化的作用机制[J]. 中国实验方剂学杂志, 2022, 28(1): 24-32.

[18] 左 瑜, 刘永刚, 李京涛, 等. 常占杰教授重剂黄芪"固中焦" 治疗慢性肝病经验[J]. 中西医结合肝病杂志, 2022, 32(11): 1030-2.

[19] 李志国. 抗纤抑癌方治疗肝癌前病变的疗效观察及作用机制研究[D]. 北京: 北京中医药大学, 2020.

[20] 杨大国, 邓 欣, 李知玉, 等. 中药正肝方治疗肝炎后肝硬化伴高甲胎蛋白血症疗效观察[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2007, 15(6): 351-3.

[21] 邓 欣, 杨大国, 吴其恺, 等. 正肝方对黄曲霉毒素B₁诱发的肝癌前病变大鼠肝功能的影响[J]. 中西医结合肝病杂志, 2008, 18(6): 357-9.

[22] 冉 云, 杨大国, 陈文林, 等. 正肝方药物血清对甲胎蛋白刺激的AFPsiRNA HepG2细胞系凋亡的影响[J]. 中西医结合肝病杂志, 2016, 26(3): 169-70.

[23] 孙 童, 胡世平, 杨大国, 等. 正肝方对二乙基亚硝胺诱导的肝癌前病变模型大鼠肝组织PTEN/PI3K/AKT信号通路的影响[J]. 世界中西医结合杂志, 2023, 18(7): 1278-84, 1314.

[24] 宋添力, 王一民, 刘 绪, 等. 运用生物信息学探讨正肝方治疗肝癌的作用机制及实验验证研究[J]. 中国药理学通报, 2024, 40(7): 1383-91.

[25] 黄继汉, 黄晓晖, 陈志扬, 等. 药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2004, 9(9): 1069-72. DOI: 10.3969/j.issn.1009-2501.2004.09.026

[26] 刘见荣, 沈卫星, 程海波, 等. 参白解毒方显著抑制小鼠结直肠腺瘤的形成及癌变: 基于PTEN/PI3K/AKT通路[J]. 南方医科大学学报, 2022, 42(10): 1452-61.

[27] 胡 光, 李 丹, 陈 阳, 等. 二乙基亚硝胺诱导斑马鱼肝癌模型的探索与优化[J]. 重庆理工大学学报: 自然科学, 2022, 36(4): 262-7.

[28] Kurma K, Manches O, Chuffart F, et al. DEN-induced rat model reproduces key features of human hepatocellular carcinoma[J]. Cancers, 2021, 13(19): 4981.

[29] Malečková A, Tonar Z, Mik P, et al. Animal models of liver diseases and their application in experimental surgery[J]. Rozhl Chir, 2019, 98(3): 100-9.

[30] 张舒曼, 王 源, 李淑莲. 间断低剂量二乙基亚硝胺诱导C57BL/6J小鼠肝癌模型[J]. 河南大学学报: 医学版, 2019, 38(2): 110-2.

[31] Piccolo S, Dupont S, Cordenonsi M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond[J]. Physiol Rev, 2014, 94(4): 1287-312.

[32] Sun T, Mao WH, Peng H, et al. YAP promotes sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by upregulating survivin[J]. Cell Oncol, 2021, 44(3): 689-99.

[33] Luo J, Zou HL, Guo YB, et al. The oncogenic roles and clinical implications of YAP/TAZ in breast cancer[J]. Br J Cancer, 2023, 128(9): 1611-24.

[34] 黄翠霞, 张雅倩, 杨爱萍, 等. 基于Hippo/YAP信号通路探讨穿心莲内酯抗三阴性乳腺癌的作用机制[J]. 实用医学杂志, 2023, 39(16): 2050-6. DOI: 10.3969/j.issn.1006-5725.2023.16.007

[35] 辛国松, 王毛毛, 侯妍秀, 等. 基于Hippo/YAP信号通路探究粉防己碱抗乳腺癌耐药机制[J]. 中草药, 2023, 54(18): 5960-7.

[36] 周 铭. 紫草素对肝脏特异性Nf2基因敲除小鼠Hippo信号通路的影响[D]. 南京: 南京师范大学, 2021.

[37] Driskill JH, Pan DJ. The hippo pathway in liver homeostasis and pathophysiology[J]. Annu Rev Pathol, 2021, 16: 299-322.

[38] Russell JO, Camargo FD. Hippo signalling in the liver: role in development, regeneration and disease[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2022, 19(5): 297-312.

[39] Chan EHY, Nousiainen M, Chalamalasetty RB, et al. The Ste20-like kinase Mst2 activates the human large tumor suppressor kinase Lats1[J]. Oncogene, 2005, 24(12): 2076-86.

[40] Zheng AC, Chen QS, Zhang L. The Hippo-YAP pathway in various cardiovascular diseases: Focusing on the inflammatory response[J]. Front Immunol, 2022, 13: 971416.

[41] Liu CY, Zha ZY, Zhou X, et al. The hippo tumor pathway promotes TAZ degradation by phosphorylating a phosphodegron and recruiting the SCF{beta}-TrCP E3 ligase[J]. J Biol Chem, 2010, 285(48): 37159-69.

[42] Zhao B, Li L, Tumaneng K, et al. A coordinated phosphorylation by Lats and CK1 regulates YAP stability through SCF(beta-TRCP)[J]. Genes Dev, 2010, 24(1): 72-85.

[43] Bai HB, Zhang NL, Xu Y, et al. Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation[J]. Hepatology, 2012, 56(3): 1097-107.

[44] Rinschen MM, Grahammer F, Hoppe AK, et al. YAP-mediated mechanotransduction determines the podocyte's response to damage[J]. Sci Signal, 2017, 10(474): eaaf8165.

[45] 彭 乐. 薯蓣皂苷元通过c-Src/Hippo信号通路发挥抗肝细胞癌作用的机制研究[D]. 宜春学院, 2023.

[46] Michalopoulos GK. Hepatostat: Liver regeneration and normal liver tissue maintenance[J]. Hepatology, 2017, 65(4): 1384-92.

[47] Moroishi T, Hayashi T, Pan WW, et al. The hippo pathway kinases LATS1/2 suppress cancer immunity[J]. Cell, 2016, 167(6): 1525-39.e17.

[48] Hong LX, Cai YB, Jiang MT, et al. The Hippo signaling pathway in liver regeneration and tumorigenesis[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2015, 47(1): 46-52.

[49] Li H, Wang SH, Wang GY, et al. Yes-associated protein expression is a predictive marker for recurrence of hepatocellular carcinoma after liver transplantation[J]. Dig Surg, 2014, 31(6): 468-78.

[50] Lian I, Kim J, Okazawa H, et al. The role of YAP transcription coactivator in regulating stem cell self-renewal and differentiation[J]. Genes Dev, 2010, 24(11): 1106-18.

[51] Koo JH, Guan KL. Interplay between YAP/TAZ and metabolism[J]. Cell Metab, 2018, 28(2): 196-206.

[52] Elaimy AL, Mercurio AM. Convergence of VEGF and YAP/TAZ signaling: implications for angiogenesis and cancer biology[J]. Sci Signal, 2018, 11(552): eaau1165.

基金资助

国家自然科学基金地区基金(32160141)

湖北省自然科学基金(2022CFB173)

湖北省教育厅科研项目(B2022101)

深圳市科技计划项目(JCYJ20220530172804010)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021