水晶兰苷通过抑制PI3K/AKT信号通路减少神经元凋亡改善脊髓损伤后小鼠的运动功能

Monotropein improves motor function of mice with spinal cord injury by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway to suppress neuronal apoptosis

摘要

目的 探究水晶兰苷（Mon）对脊髓损伤（SCI）小鼠运动功能的影响及其作用机制。 方法 采用脊髓撞击仪构建脊髓损伤小鼠模型，将小鼠随机分为Sham组、SCI组和SCI+Mon组，15只/组，SCI+Mon组小鼠每日腹腔注射0.2 mL的Mon溶液，其余2组注射等量生理盐水。利用巴索小鼠量表（BMS）运动评分、斜板实验、足迹测试来评估小鼠的运动功能；通过苏木精-伊红、快蓝、尼氏染色观察SCI小鼠脊髓组织的病理学改变和神经元数量；通过GO功能富集和KEGG通路富集分析Mon在SCI中的生物学功能和作用机制；采用免疫荧光同时标记NeuN和cleaved-caspase3、Western blotting检测凋亡蛋白分析Mon对SCI小鼠脊髓中神经元凋亡的影响；培养小鼠海马神经元HT22细胞，利用Tunel染色分析Mon对HT22细胞凋亡的影响；结合体内外样本，采用Western blotting检测Mon对PI3K/AKT信号通路的影响，并增加回复实验检测加入通路激活剂后对神经元的凋亡及SCI小鼠运动恢复的影响。 结果 在体实验发现，相较于SCI组，SCI+Mon组小鼠的BMS评分、斜板实验角度、足迹测试评分均升高（P<0.01），脊髓损伤面积减小、髓鞘保留和神经元数量增加（P<0.01）；生信分析发现Mon在SCI中可能发挥抗凋亡作用且与PI3K/AKT信号通路有关；免疫荧光结果显示，SCI+Mon组比SCI组小鼠神经元凋亡数量减少（P<0.01）；Western blotting数据表明，Mon干预后小鼠脊髓中cleaved-caspase3和Bax的蛋白水平降低，而Bcl-2的表达量升高（P<0.05）；体外实验也发现Mon可改善TNF-α诱导的HT22细胞凋亡（P<0.01）；Mon能够抑制PI3K/AKT信号通路的激活（P<0.01）；加入该通路的激活剂后，HT22细胞凋亡增加（P<0.01），cleaved-caspase3和Bax蛋白表达降低，而Bcl-2的表达量升高（P<0.05），且SCI小鼠的运动功能加剧（P<0.01）。 结论 Mon可通过减少神经元的凋亡促进SCI小鼠运动功能恢复，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of monotropein on motor function recovery of mice with spinal cord injury (SCI) and explore the underlying mechanism. Methods Forty-five adult female C57BL/6 mice were randomized equally into sham operation group, SCI group, and SCI group with daily intraperitoneal monotropein injection. The mice in the former two groups received daily saline injections. Motor function of the mice was evaluated using BMS scores, slant plate test, and footprint analyses. Pathological changes and neuronal counts in the spinal cord were observed using HE, LFB, and Nissl staining. The biological functions of monotropein were explored using GO and KEGG enrichment analyses. NeuN/cleaved caspase-3 immunofluorescence assay and Western blotting were used to detect neuronal apoptosis in the spinal cord of the mice. In cultured HT22 cells, the effect of monotropein on TNF-α-induced cell apoptosis was evaluated using TUNEL staining and Western blotting. In monotropein-treated HT22 cells and SCI mice, the changes in the PI3K/AKT pathway were examined, and the effect of a PI3K/AKT pathway activator (IGF-1) on HT22 cell apoptosis and motor function recovery of SCI mice were observed. Results SCI mice with monotropein treatment showed significantly improved motor functions with reduced SCI areas and increased myelin retention and neuron counts in the spinal cord. Bioinformatics analysis suggested a role of PI3K/AKT signaling pathway in mediating the anti-apoptotic effects of monotropein. In SCI mice, monotropein obviously reduced apoptotic neurons, decreased expressions of cleaved caspase-3 and Bax and increased Bcl-2 expression in the spinal cord. In HT22 cells, monotropein significantly inhibited TNF-α-induced apoptosis and PI3K/AKT pathway activation. Treatment with IGF-1 obviously increased apoptosis of HT22 cells and exacerbated locomotor dysfunction in SCI mice. Conclusion Monotropein promotes motor function recovery in SCI mice by reducing neuronal apoptosis possibly by inhibiting the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

水晶兰苷 / 脊髓损伤 / 神经元 / 凋亡 / PI3K/AKT

Key words

monotropein / spinal cord injury / neurons / apoptosis / PI3K/AKT

脊髓损伤（SCI）是一种常由暴力因素造成的创伤性疾病^［1］，全球每年新增SCI患者约50万人，且发病率仍保持上升趋势^［2］。SCI包括原发性和继发性损伤，原发性损伤为造成脊髓损伤的机械性创伤，随后造成的损伤部位血管通透性增加，免疫细胞激活；炎症反应等称为继发性损伤，最终可导致神经元凋亡和运动功能障碍^［3］。研究显示，改善神经元凋亡是促进SCI后神经功能和运动功能恢复的关键^［4］。目前，甲基强的松龙是唯一应用于临床干预SCI的药物，但其并不能有效促进神经功能的恢复，且大剂量使用会造成消化道出血和呼吸道感染等严重不良反应^［5，6］，故迫切需要开发新的治疗药物。近期研究显示，天然中草药具有丰富的生物学功能，包括神经保护和抗凋亡作用，且具有较高的安全性，在脊髓损伤的治疗中受到广泛关注^{［7， 8］}。水晶兰苷（Mon）是从巴戟天根中提取的环烯醚萜苷^［9］，巴戟天作为我国四大南药之一，具有延缓神经系统衰老、抗抑郁等功效^［10］，并且可降低炎症因子表达，抑制细胞凋亡，进而对大鼠脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用^［11］。Mon作为巴戟天的主要成分之一，可减轻小鼠软骨细胞的凋亡，缓解骨关节炎的进展^［12］。然而，Mon在SCI中的作用尚未见报道。本研究利用小鼠SCI模型，观测Mon促进SCI小鼠运动功能的恢复情况，评估其对神经元凋亡的影响，并结合体内外实验分析可能的作用机制，旨为SCI的治疗提供新的参考和依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂

Mon（上海陶术生物科技有限公司）；HT22细胞（中国科学院细胞库）；NeuN、β-actin、山羊抗小鼠IgG H&L（AlexaFluor®555）和山羊抗兔IgG H&L（FITC，Abcam）；Bcl-2、Bax、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；cleaved-caspase3（CST）；胰岛素样生长因子-1（IGF-1，MedChemExpress）；H&E染色试剂、Tunel染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；甲苯胺蓝染料（上海麦克林生化科技股份有限公司）；快蓝染液（Sigma）；DMEM培养基、胎牛血清（Gibco）；BCA蛋白试剂盒（碧云天）。

1.1.2 实验动物

本研究选用65只C57BL/6野生型雌性小鼠（6~8周龄，18~22 g），购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司［SCXK（苏）2023-0009］，所有小鼠均在SPF环境中饲养，控制温度、湿度、光照和空气洁净度，保持无菌环境，并定期更换营养饲料和垫料。本研究经蚌埠医科大学动物研究伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2020］第044号）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组造模和取材

将45只小鼠随机分为3组：假手术组（Sham组）、模型组（SCI组）、治疗组（SCI+Mon组），15只/组。在回复实验中，将20只小鼠随机分为4组：Sham组、Sham+IGF-1组、SCI+Mon组、SCI+Mon+IGF-1组，5只/组。SCI造模方法^［13］：通过腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液（0.2 mL/10 g）对小鼠进行麻醉，无菌条件下在T9~T10处进行椎板切除术以暴露脊髓。使用直径为1.3 mm的撞针以50 kdynes的力垂直撞击小鼠第9胸椎，当小鼠尾巴出现痉挛抽搐，术后后肢运动功能丧失，证明中度SCI模型造模成功。造模成功后缝合小鼠皮肤，每日给予抗生素治疗，并人工辅助排空膀胱直至主动排尿功能恢复。Sham组小鼠只剔除相同部位的椎板，直接缝合皮肤。SCI+Mon组每日腹腔注射0.2 mL的Mon溶液（20 mg/kg）^［14］，其余每组每日给予等量的生理盐水，连续治疗28 d。

小鼠脊髓取材方法：于术后第7天，每组随机抽取10只小鼠，采用心脏灌注PBS取材，取材部位均以脊髓损伤中心为中点前后各0.5 cm，组织放于液氮中保存，用于后续分子生物学检测。于术后第28天，每组其余的5只小鼠，先用PBS心脏灌注清洗，后用4%多聚甲醛溶液（PFA）灌注取材，取材部位均以脊髓损伤中心为中点前后各0.5 cm，组织浸泡于4% PFA中过夜，用于组织学评估。

1.2.2 细胞培养

HT22细胞培养在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM完全培养基中，培养环境为37℃、5% CO₂、湿度饱和。每2天更换1次培养基，当细胞密度达到80%时进行传代，细胞传代次数不超过10次。当细胞处于对数增长期时，将其接种于6孔板中，分为3组：Control组、TNF-α组、Mon组，待细胞密度增长到70%~80%时，对细胞进行处理。Control组细胞正常培养24 h，TNF-α组加入TNF-α重组蛋白（30 ng/mL）培养24 h^［15］，Mon组用TNF-α（30 ng/mL）和Mon（20 μmol/L）同时培养24 h。回复实验中分为Control组、Control+IGF-1组、Mon组、Mon+IGF-1 4组，PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1使用剂量100 ng/mL^［16］，干预时间为24 h。

1.2.3 巴索小鼠评分量表评分（BMS）

术前和术后第1、3、7、14、21、28天采用BMS评分评估小鼠后肢运动功能恢复情况，将小鼠置于开阔场地自由行走4 min。采用双盲法，观察小鼠后肢的活动情况，采用0~9分评分系统进行评分^［17］。

1.2.4 斜板实验

在术前和术后第1、3、7、14、21、28天对每组小鼠进行斜板实验。将小鼠放置于平板上，平板上有1个指示平面倾斜度的指示器，记录小鼠能保持5 s的最大倾斜角度，每只小鼠重复3次，记录平均值为最终角度^［18］。

1.2.5 足迹分析

于第28天对各组小鼠进行足迹分析评估。具体方法为：将小鼠前脚涂上红色染料，后脚涂上蓝色染料，置于铺有白纸的狭长跑道上，观察小鼠足迹，并记录每只小鼠足迹评分。评分标准如下：0分，连续跛行或后腿拖拽，不能留下可见的脚印；1分，至少有3个或3个以上足趾印；2分，足印显示向内或向外旋转超过正常角度的2倍；3分，无明显拖曳，仅外旋或内旋；4分，无内、外旋^{［19，20］}。

1.2.6 苏木精-伊红（HE）染色

脊髓标本经过梯度蔗糖脱水后，OCT包埋组织，利用冰冻切片机连续切片（切片厚度8 μm），取损伤中心处的切片进行HE染色。蒸馏水洗去切片上多余的OCT，苏木素染色细胞核，经过分化、返蓝后，使用伊红染色胞质，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶固封。通过ImageJ软件分析脊髓组织的相对损伤面积，相对损伤面积（%）=（损伤面积/脊髓面积）×100%。

1.2.7 快蓝（LFB）染色

将切片在75%、95%的乙醇中各浸泡2 min，于37 ℃恒温条件下，用0.1% LFB染液中浸泡2 h，冷却后用蒸馏水冲去多余的染液，用0.05%碳酸锂水溶液分化5 s，随后在蒸馏水中浸泡1 min终止分化，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树胶固封，于显微镜下观察髓鞘保留情况，利用ImageJ计算相对髓鞘化面积，相对髓鞘化面积（%）=（髓鞘化面积/脊髓面积）×100%。

1.2.8 尼氏（Nissl）染色

用蒸馏水洗去切片上多余的OCT，放入0.05%甲苯胺蓝水溶液中浸泡5 min，随后用90%乙醇溶液分化3~10 s，经过无水乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片，于显微镜下观察尼氏小体保留情况。

1.2.9 网络药理学

从Pubchem数据库中获得Mon的结构式，利用Superpred、PharmMapper和Swiss Target Prediction数据库获得Mon的药物靶点并进行汇总。先通过OMIM了解SCI的遗传背景和相关基因，然后通过Genecards或TTD筛选与SCI相关的靶点，再结合Drugbank和PharmGKB分析靶点的药物反应和基因组学信息，将每个网站获得的靶点进行汇总。利用Venny在线网站获得SCI靶点与Mon靶点的交集，绘制韦恩图，将交集靶点导入到DAVID数据库，进行GO功能学富集和KEGG信号通路富集分析。

1.2.10 免疫荧光检测

将8 μm的小鼠脊髓冰冻切片经过固定通透后，用5% BSA进行封闭30 min，随后滴加一抗NeuN（1∶100）和cleaved-caspase3（1∶100）4 ℃过夜。次日，PBS浸洗3次，5 min/次，随后滴加二抗山羊抗小鼠IgG H&L（AlexaFluor® 555）（1∶1000）和山羊抗兔IgG H&L（FITC）（1∶1000），室温孵育1 h，经DAPI复染细胞核后，用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察图像。

1.2.11 Tunel染色

将HT22细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定20 min，用0.2% TritonX-100通透10 min，在PBS浸洗3次，5 min/次。按照Tunel染色试剂盒说明书（武汉赛维尔生物科技有限公司）对爬片进行Tunel（红色）和DAPI（蓝色）染色。此后，使用荧光显微镜观察Tunel阳性细胞数，通过计数细胞核总数和Tunel染色阳性的细胞数来计算凋亡细胞的百分比。

1.2.12 Western blotting检测

将第7天取材的小鼠脊髓组织和HT22细胞放于RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂）中提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后转移到PVDF膜上，转膜结束后将其放置于5%脱脂牛奶中封闭1 h。将膜与适当的一抗在4 ℃下孵育过夜，所用一抗包括Bcl-2（1∶1000）、cleaved-caspase3（1∶500）、Bax（1∶2000）、PI3K（1∶1000）、AKT（1∶5000）、p-PI3K（1∶5000）、p-AKT（1∶2000）、β-actin（1∶1000），然后与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的IgG二抗在室温下孵育2 h，最后将膜在曝光仪中进行显影。

1.3 统计学分析

采用SPSS27.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示，采用独立样本t检验判断两组之间的差异，采用单因素方差分析来评估多组间的差异，并采用Tukey进行多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Mon促进SCI小鼠运动功能的恢复

SCI组小鼠BMS评分和斜板实验角度值均明显降低（P<0.05，图1A、B），且后肢拖拽减少，足迹得分降低（P<0.01，图1C、D）。

2.2 Mon减轻SCI小鼠的病理性损伤

HE染色结果显示，在脊髓损伤平面，与SCI组小鼠相比，SCI+Mon组小鼠脊髓损伤面积降低（P<0.01，图2A、B）；LFB染色结果显示，SCI+Mon组小鼠脊髓的髓鞘化面积高于SCI组（P<0.01，图2C、D）；Nissl染色结果表明，相较于SCI组，SCI+Mon组神经元数量增加（P<0.01，图2E、F）。

2.3 GO功能富集和KEGG通路富集预测Mon的功能和作用机制

韦恩图显示Mon与SCI存在263个交集靶点（图3A），取相关性最高的前5个靶点进行GO富集分析发现，Mon在SCI中的功能学途径可能与抗凋亡过程有关（图3B）；选取相关性最强的前20个信号通路进行KEGG富集分析发现，Mon可能通过PI3K/AKT信号通路发挥生物学功能（图3C）。

2.4 Mon抑制SCI小鼠神经元的凋亡

利用免疫荧光染色标记NeuN和cleaved-caspase3，结果发现，相较于SCI组，SCI+Mon组NeuN⁺cleaved-caspase3⁺细胞数减少（P<0.01，图4A、B）。Western blotting检测结果显示，SCI后促凋亡蛋白cleaved-caspase3和Bax的表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，Mon降低了cleaved-caspase3和Bax的表达水平，增加了Bcl-2的蛋白表达（P<0.05，图4C~F）。

2.5 Mon改善由TNF-α诱导的HT22细胞凋亡

通过TNF-α诱导HT22细胞建立体外凋亡模型，Tunel染色发现，相较于TNF-α组，Mon组细胞凋亡比率降低（P<0.01，图5A、B）；Western blotting结果显示，与TNF-α组相比，Mon治疗可减少cleaved-caspase3和Bax的表达量，并促进Bcl-2的表达（P<0.05，图5C~F）。

2.6 Mon降低p-PI3K和p-AKT蛋白水平

Western blotting结果显示，与SCI组相比，SCI+Mon组小鼠脊髓组织中p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低（P<0.01，图6A~C）；体外培养HT22细胞发现，TNF-α诱导后p-PI3K和p-AKT的表达量增加，加入Mon后其表达量降低（P<0.01，图6D~F）。

2.7 Mon通过抑制PI3K/AKT信号通路减少HT22细胞凋亡

Western blotting结果显示，与Control组相比，加入IGF-1后增加了p-PI3K和p-AKT蛋白的表达；相较于Mon组，Mon+IGF-1组p-PI3K和p-AKT蛋白的表达水平升高（P<0.01，图7A~C）。Tunel染色结果显示，与Mon组相比，Mon+IGF-1组凋亡细胞比率增多（P<0.01，图7D、E）。IGF-1的干预逆转了Mon组cleaved-caspase3和Bax表达量的降低与Bcl-2表达量的增加（P<0.05，图7F~I）。

2.8 Mon通过抑制PI3K/AKT信号通路促进SCI小鼠运动功能的恢复

加入PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1后，结果显示，在SCI后第14天后，SCI+Mon+IGF-1组小鼠的BMS评分和斜板实验测试值低于SCI+Mon组（P<0.01，图8A、B）。足迹分析结果显示，相较于SCI+Mon组，SCI+Mon+IGF-1组小鼠后肢的拖拽增加，且足迹评分降低（P<0.01，图8C、D）。

3 讨论

本研究发现，Mon治疗可以促进SCI小鼠运动功能的恢复，减轻脊髓组织的病理损伤。此外，Mon干预后可以缓解神经元的凋亡，同时激活抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并抑制促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3的表达。机制研究显示，Mon能够抑制脊髓组织中PI3K/AKT信号通路的激活，这可能与其对SCI的神经保护功能相关。

传统中草药在长期的临床实践中得到了广泛应用，并以其强大的生物活性和轻微的副作用成为各种潜在治疗药物的来源^［21］。Mon提取自巴戟天或鹿蹄草中，其中巴戟天的提取物已被报道具有治疗抑郁症、骨质疏松症、类风湿性关节炎和阿尔兹海默症的潜力^{［22， 23］}。Mon作为巴戟天根中含量最丰富的环烯醚萜苷类成分，已有研究表明其具有神经保护功能^［24］，但其在SCI中是否具有保护作用尚未可知。本研究通过建立小鼠SCI模型，并采用BMS评分和斜板实验分析小鼠后肢运动功能的变化。结果显示在第14、21、28天，SCI+Mon组小鼠的BMS评分和斜板实验测试角度值高于SCI组；通过足迹分析直观地观察小鼠的步态情况进一步分析小鼠后肢的运动功能，结果显示相较于SCI组，SCI+Mon组小鼠的后腿拖拽现象减轻，足迹评分升高，表明Mon可以改善SCI小鼠的运动功能。既往报道显示，在脊髓原发性损伤之后，会发生损伤区域愈合困难、脱髓鞘现象加剧、神经元凋亡异常增多等一系列继发性损伤，这严重阻碍了患者的运动功能恢复^{［25， 26］}。利用组织病理学染色（HE、LFB、Nissl）发现，Mon干预后SCI组小鼠脊髓的损伤面积减少、髓鞘化面积增大且神经元数量增多，表明Mon可促进SCI后脊髓组织病理学损伤的恢复。

既往报道发现，Mon可通过抑制软骨细胞的凋亡治疗小鼠的骨关节炎^［27］；且Mon可抑制成骨细胞的凋亡对骨质疏松的治疗具有较好的应用前景^［28］；在急性肾损伤中，Mon通过抑制氧化损伤和炎症反应进而缓解细胞凋亡^［14］。但其在SCI中的作用途径尚未见报道。本研究通过GO富集分析发现，Mon在SCI中可能与负向调控凋亡有关。在SCI中神经元凋亡是造成神经功能缺损的主要原因之一，通过改善神经元凋亡可以促进SCI小鼠运动功能的恢复^［29］。本研究利用神经元标记物NeuN和促凋亡蛋白cleaved-caspase3标记脊髓中凋亡的神经元发现，相较于SCI组，SCI+Mon组凋亡的神经元减少；通过体外培养HT22细胞，构建TNF-α诱导细胞凋亡模型，采用Tunel染色标记凋亡细胞，结果同样显示，在Mon干预后，凋亡细胞比率减少。既往研究显示，Bcl-2家族成员在调控线粒体相关的凋亡途径发挥着重要作用^［30］，其主要分为两类：促进细胞凋亡的Bak和Bax，以及抑制细胞凋亡的Bcl-2和Bcl-xL^［31］。本研究利用Western blotting实验检测凋亡蛋白发现，与SCI组相比，SCI+Mon组cleaved-caspase3和Bax的表达量明显降低，而Bcl-2的表达量升高；体外实验也表现出相同的结果。以上研究表明，Mon可抑制SCI后神经元凋亡。

为进一步探究Mon调节SCI神经元凋亡的作用机制，利用KEGG富集分析发现，Mon可能通过PI3K/AKT信号通路发挥作用。PI3K/AKT信号级联反应在维持SCI后受损神经元的可塑性方面发挥着关键作用^［32］，其能够参与SCI后诱导的炎症反应、细胞凋亡以及胶质瘢痕的形成过程^［33］。研究表明，通过调节PI3K/AKT信号通路可有效缓解SCI后神经元的凋亡^{［7， 16］}。基于此，本研究首次探究了Mon在SCI中是否调控PI3K/AKT信号通路。通过体内外Western blotting实验发现，Mon干预后p-PI3K和p-AKT蛋白表达量下降，证明Mon能够抑制PI3K/AKT信号通路。IGF-1是PI3K/AKT信号通路常用的激活剂^{［34， 35］}，本研究利用体内外回复实验进一步证明Mon部分抑制PI3K/AKT信号通路进而减少神经元凋亡促进SCI小鼠运动功能的恢复。Tunel染色结果显示，加入IGF-1后，神经元凋亡比率增加；Western blotting实验发现，IGF-1增加了cleaved-caspase3和Bax的蛋白表达量，同时减少了Bcl-2的表达，且相较于SCI+Mon组，SCI+Mon+IGF-1组小鼠的BMS评分、斜板实验测量值和足迹分析得分均显著降低。表明IGF-1逆转了Mon在SCI中抑制PI3K/AKT信号通路的作用。

本研究通过体内外实验证明Mon在SCI中发挥抗神经元凋亡作用，并揭示了其可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关，为丰富Mon的生物学功能提供了新的思路。同时也证明了Mon能够促进SCI后小鼠运动功能和组织损伤的修复，为SCI临床药物治疗提供了新的参考依据。但因雄性小鼠造模后护理困难，死亡率较高，本研究仅选用了雌性小鼠模型进行分析；本研究仅探讨了Mon对SCI神经元凋亡的影响，其也可能通过其他途径促进SCI的恢复；本研究证明了Mon可能通过调控PI3K/AKT信号通路改善神经元的凋亡，但其是否涉及其他机制尚需要进一步探索。

综上所述，Mon能够通过抗神经元凋亡促进SCI小鼠运动功能和病理学损伤的恢复其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。

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