抵当汤含药血清通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增强高糖诱导的大鼠肾小球内皮细胞自噬

Didang Decoction-medicated serum enhances autophagy in high glucose-induced rat glomerular endothelial cells via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

摘要

目的 观察抵当汤含药血清通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR信号通路对高糖诱导的大鼠肾小球内皮细胞（RGECs）自噬的影响，以期为糖尿病肾病（DN）的治疗提供新的思路。 方法 连续过筛法结合胶原酶法提取与培养原代RGECs，使用第Ⅷ因子免疫荧光法对其鉴定。通过高糖培养基诱导RGECs模拟糖尿病环境下的细胞状态。将细胞分为5组：空白组（正常培养的RGECs）、高糖模型组（使用高糖培养基诱导的RGECs）、抵当汤组（在高糖诱导基础上加入抵当汤含药血清进行干预的RGECs）、3-MA组（在高糖诱导基础上加入自噬抑制剂3-MA进行干预的RGECs）和抵当汤+3-MA干预组（在高糖诱导基础上同时加入抵当汤含药血清和自噬抑制剂3-MA进行干预的RGECs）。CCK-8法筛选最佳造模条件和含药血清干预浓度，利用单丹磺酰卡巴胺（MDC）法观察自噬囊泡荧光强度，RT-qPCR法检测Beclin-1、p62mRNA表达，Western blotting法检测p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3B蛋白表达水平。 结果 与正常组比较，高糖模型组RGECs自噬荧光信号减少，荧光强度降低，Beclin-1 mRNA表达减少，p62 mRNA表达升高，Beclin-1蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ水平下降，P62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达上升（P<0.01）；与高糖模型组比较，抵当汤组RGECs自噬荧光面积与强度明显升高，Beclin-1 mRNA表达上升，p62 mRNA表达下降，Beclin-1蛋白表达上升，p62、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达下降（P<0.01）。 结论 抵当汤含药血清可通过部分调节 PI3K/Akt/mTOR信号通路，增强 RGECs 的自噬，为糖尿病肾病的治疗提供新策略。

Abstract

Objective To investigate the effect of Didang Decoction-medicated serum on autophagy in high glucose (HG)-induced rat glomerular endothelial cells (RGECs) and explore the pathway that mediates its effect. Methods Primary RGECs were isolated and cultured using sequential sieving combined with collagenase digestion, followed by identification using immunofluorescence assay for factor VIII. High glucose medium was used to induce RGECs to simulate a diabetic environment, and the effects of Didang Decoction-medicated serum and 3-MA (an autophagy inhibitor), either alone or in combination, on autophagy of HG-exposed cells were evaluated by observing autophagic vacuoles using monodansylcadaverine (MDC) staining. RT-qPCR and Western blotting were employed to measure mRNA and protein expression levels of Beclin-1, p62, LC3B, p-PI3K, p-Akt, and p-mTOR. Results Compared with the control cells, the HG-exposed RGECs showed significantly reduced autophagic fluorescence intensity, decreased Beclin-1 mRNA expression, increased p62 mRNA expression, downregulated Beclin-1 protein and LC3-II/I ratio, and upregulated p62, p-PI3K, p-Akt, and p-mTOR protein levels. Didang Decoction-medicated serum significantly enhanced autophagic fluorescence intensity in HG-exposed cells, increased Beclin-1 mRNA expression, decreased p62 mRNA expression, upregulated Beclin-1 protein, and downregulated p62, p-PI3K, p-Akt, and p-mTOR protein levels. Conclusion Didang Decoction-medicated serum enhances autophagy in HG-exposed RGECs by regulating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which sheds light on a new therapeutic strategy for diabetic nephropathy.

Graphical abstract

关键词

糖尿病肾病 / 抵当汤 / 自噬 / PI3K/Akt/mTOR信号通路 / 肾小球内皮细胞

Key words

diabetic nephropathy / Didang decoction / autophagy / PI3K/Akt/mTOR signaling pathway / glomerular endothelial cells

糖尿病肾病（DN）作为糖尿病（DM）最为常见且严重的慢性微血管并发症之一，是终末期肾衰（ESRD）的主要诱因^［1］。肾小球内皮细胞（GECs）对维持肾小球滤过屏障（GFB）功能至关重要^［2］。DN病理状态下，GECs受到损伤，导致其开窗结构发生改变，进而影响肾小球滤过屏障的功能^［3］。自噬在维持细胞稳态中起关键作用^［4］，高血糖状态下，存在肾固有细胞的自噬障碍，加速DN疾病进展。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在细胞生长、代谢及自噬调控中发挥着重要的作用^［5］。

DN病理特征为肾小球硬化，符合中医“肾络瘀阻”病机。瘀血存在于DN的始终，既是DN发生的致病因素，又是DN发生发展过程中的一个重要病理产物，影响整个病程的转归^［6］。抵当汤出自《伤寒论》，由桃仁、大黄、水蛭、虻虫组成，具有化瘀通络的功效。既往研究表明，抵当汤能多途径、多靶点有效改善糖尿病大鼠心肌病变^［7-12］和肾脏病变^{［13， 14］}，但关于其通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进大鼠肾小球内皮细胞（RGECs）自噬，进而延缓DN进程的具体机制尚未有相关报道。本研究旨在通过实验验证抵当汤对RGECs自噬的影响，并探讨其可能的信号通路机制。因此，课题组采用抵当汤含药血清干预高糖诱导的RGECs，检测自噬相关蛋白的表达水平，以期揭示抵当汤调节RGECs自噬活性的作用，为糖尿病肾病的治疗提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

雄性清洁级SD大鼠12只，鼠龄7~8 d，购买于安徽医科大学实验动物中心［许可证编号：SCXK（浙）2019-0004］。雄性清洁级SD大鼠20只，体质量200±20 g，鼠龄约为12周龄，购买于安徽医科大学实验动物中心［许可证编号：SCXK（皖）2020-001］。本实验经过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批（伦理批号：No.AHUCM-rats-2024199）。

1.1.2 药物

抵当汤：酒大黄10 g，桃仁15 g，水蛭10 g，虻虫10 g。中药饮片购自安徽中医药大学国医堂门诊部，经安徽中医药大学药学院金传山教授鉴定，品质符合2020年版《中华人民共和国药典》^［15］相关规定。中药方剂配制方法：以纯净水浸泡饮片2 h以上，大火烧开煮1 h，滤过渣质，仅留下药汁，加入纯净水进行第2次煎煮并过滤，将两次得到的滤液混合，浓缩至溶液中生药含量为1 g/mL，置于4 ℃冰箱储存备用。

1.1.3 试剂

0.25%胰酶、3-甲基腺嘌呤（3-MA，Glpbio）；ECM内皮培养基（ScienCell）；特级胎牛血清（Clark）；IV型胶原酶（北京金克隆生物技术有限公司）；Factor Ⅷ Rabbit pAb、山羊抗兔IgG（FITC）（北京博奥森生物技术有限公司）；DAPI染色液（北京兰杰柯科技有限公司）；细胞自噬MDC检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；预染蛋白Marker、ECL超敏发光试剂盒（Thermo）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、GAPDH（北京中杉金桥生物技术有限公司）；LC3B、p-mTOR（CST）；P62（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.1.4 仪器

CCL-170B-8型细胞培养箱（Esco）；BBS-DDC型超净工作台（Biobase）；CKX31倒置相差显微镜（Olympus）；DMi8倒置荧光显微镜（Leica）；SpectraMax iD3多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；EPS300电泳仪、VE-180电泳槽、VE-186转膜仪（上海天能科技有限公司）；JS-1070P自动曝光仪（上海培清科技有限公司）；K960普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）；PIKOREAL 96荧光定量PCR仪、PIKO Plate Illuminator（Thermo）；OD1000+超微量分光光度计（南京五义科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组

对数生长期的RGECs消化、离心，重悬并调整浓度至1×10⁵/mL，接种于6孔板。将接种好的胞分为5组，空白组：正常培养的RGECs；高糖诱导模型组：使用高糖培养基（10%胎牛血清，1% ECGS，30 mmol/L葡萄糖）对RGECs进行诱导，以模拟糖尿病环境下的细胞状态；抵当汤组：在高糖诱导的基础上，加入抵当汤含药血清（10%）进行干预；3-Ma干预组：在高糖诱导的基础上，加入自噬抑制剂3-Ma（0.1 mmol/L）进行干预；抵当汤血清+3-Ma干预组：在高糖诱导的基础上，同时加入抵当汤含药血清和自噬抑制剂3-Ma干预。

1.2.2 抵当汤含药血清与空白血清制备

经3 d适应性饲养，将20只SD大鼠随机分成抵当汤组和空白组，10只/组。抵当汤组按照成人每日剂量的14倍计算每只大鼠的给药量，即10.5 g/kg，2次/d，每次灌胃量10 mL/kg。空白组给予等量蒸馏水灌胃。末次给药1 h后，使用戊巴比妥钠进行麻醉，经腹主动脉取血。血样静置2 h，4 ℃、3000 r/min离心20 min，分离血清，标记，加热灭活补体，过滤除菌，冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.3 原代RGECs分离与培养

大鼠肾小球微血管团分离与接种：取3只7~8 d龄SD幼鼠，无菌摘取双肾，分离肾皮质并剪碎成大小约1 mm³的肉泥，依次经70 μm、40 μm尼龙细胞筛网研磨过滤，收集40 μm细胞筛网上的组织，加入5 mL 0.1% Ⅳ型胶原酶，37 ℃消化20 min，离心弃上清液，添加2 mL ECM完全培养基（含10%胎牛血清，1% ECGS，1% P/S），轻柔吹打，接种于0.1%明胶包被的60 mm的培养皿，37 ℃、5% CO₂条件培养。完全静置3 d，全量更换培养液，其后每48 h半量换液。大鼠肾小球内皮细胞分离与培养：肾小球微组织接种7~8 d后，经0.25%胰酶消化，使用40 μm尼龙筛网过滤，去除肾小球微血管团，收集筛网下大鼠肾小球内皮细胞悬液，离心弃上清液，加入ECM完全培养基，接种到培养瓶中，37 ℃、5% CO₂条件下培养。观察并记录细胞的生长情况，当细胞密度达到80%~90%时传代，使用第3代细胞进行实验。

1.2.4 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法鉴定大鼠肾小球内皮细胞

将分离出的肾小球内皮细胞接种于细胞爬片上；待细胞生长融合度达到85%，吸弃原培养基，经固定、透膜、封闭，滴入一抗兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原抗体（1∶400），4 ℃恒温摇床孵育过夜，吸弃一抗并漂洗，滴加二抗FITC标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶200），37 ℃避光孵育30 min，漂洗，加入DAPI染色剂（1∶100），37 ℃避光孵育10 min，漂洗，封片。在荧光显微镜下观察阳性率，拍照记录。

1.2.5 CCK-8法筛选葡萄糖造模条件

将细胞接种于96孔板，5000/孔，培养24 h待细胞贴壁，吸弃培养基，分别用含10、20、30、40、50 mmol/L葡萄糖的培养基处理，置正常对照组（5.6 mmol/L葡萄糖）和空白调零组（无细胞），6个复孔/组。培养1、12、36、48 h后，吸弃原培养基，每孔加入100 μL 正常培养基和10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h，检测A₄₅₀值，计算细胞相对活性。重复实验3次。细胞相对活性计算公式如下：

细胞相对活性（%）=\frac{A_{\mathrm{加药}}-A_{\mathrm{空白}}}{A_{\mathrm{加药}}-A_{\mathrm{空白}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.6 CCK-8法检测含药血清干预浓度

将细胞接种于96孔板，5000/孔，培养24 h待细胞贴壁，吸弃培养基，分别加入100 μL含0%、5%、10%、20%、30%抵当汤含药血清同时含有30 mmol/L葡萄糖的培养基，每组4个复孔。另设置正常对照组，干预36 h。按照2.5中的方法进行检测与计算。

1.2.7 单丹磺酰卡巴胺（MDC）法检测自噬荧光

将细胞接种于96孔板，使用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养1、12、36、48 h；将细胞接种于6孔板和96孔板，按照分组设计进行干预36 h。干预完成后，吸弃培养基，用PBS洗涤1次，加入MDC染色液，37 ℃避光孵育20~30 min。6孔板与96孔板每孔加入MDC染色液体积分别为1000 μL与100 μL。吸弃MDC染色液，使用Assay Buffer洗涤3次。使用多功能酶标仪对96孔板进行荧光强度检测，激发波长为335 nm，发射波长为512 nm。在荧光显微镜下观察6孔板绿色荧光。

1.2.8 RT-qPCR法检测Beclin-1、p62 mRNA的表达

干预完成后，提取总RNA，进行逆转录反应。逆转录条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。以cDNA为模板进行扩增，扩增条件为：95 ℃预变性1 min，1个循环；95 ℃变性20 s，40个循环；60 ℃退火延伸1 min，40个循环。采用2-^△△Ct法计算mRNA的表达量。引物序列由安徽通用生物股份有限公司设计合成（表1）。

1.2.9 蛋白免疫印迹法检测p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、p62、LC3B蛋白的表达

干预完成后，提取总蛋白，加入蛋白上样缓冲液，沸水浴15 min，使蛋白充分变性。经制胶、上样、电泳、转膜、封闭，加入p-PI3K（1∶1000）、p-Akt（1∶2000）、p-mTOR（1∶1000）、Beclin-1（1∶2000）、p62（1∶1000）、LC3B（1∶1000）兔抗大鼠一抗，4 ℃摇床孵育过夜，洗涤去除一抗，滴加辣根过氧化酶标记的二抗（1∶20 000），室温孵育1.2 h。

1.3 统计学分析

计量资料用均数±标准差表示，应用SPSS27.0和GraphPad Prism 9.0进行统计学分析。在数据符合正态分布、方差齐时，对两组间比较采用独立样本t检验；对多个样本间进行比较则需先进行单因素方差分析，再利用最小显著差异检验（LSD-t）做进一步的多重比较。若数据不满足正态分布，则采用克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验（K-W）方式；而方差不齐的情况，则选用Tamhane's T₂多重比较方法（Tamhane's T₂）进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义，所有实验都独立重复3次。

2 结果

2.1 原代大鼠肾小球内皮细胞形态与鉴定结果

结果显示消化后的肾小球微血管团已去除外层包曼氏囊，呈不规则球形，毛细血管袢结构清晰（图1）。肾小球微血管团接种3 d后，周围爬出短缩形细胞，聚集成“岛屿状”；4~5 d后，细胞集落逐渐扩大融合，细胞形态成长为梭状；6~7 d后，细胞逐渐铺满培养皿，呈现单层、铺路石样镶嵌式排列，形态饱满，肾小球微血管团接种密集区域出现细胞接触抑制（图2）。培养的RGECs第Ⅷ因子抗原免疫荧光染色结果显示，在荧光显微下，RGECs的胞浆内呈现出明显的绿色荧光反应，尤其在核周区域更为显著（图3）。

2.2 葡萄糖浓度与干预时间对RGECs细胞活性的影响

随着葡萄糖浓度增加及干预时间延长，RGECs的活力出现不同程度的减弱（图4）。使用10、20 mmol/L葡萄糖干预时，细胞相对活性降低趋势较为平缓，相对活性在75% 以上；使用40、50 mmol/L葡萄糖干预时，细胞相对活性降低趋势较为急骤，干预12 h后即降低至40% 以下；使用30 mmol/L葡萄糖干预时，细胞活性明显降低的同时趋势也较为平缓，干预时间36与48 h时细胞相对活性约为50%。因此，认为最佳造模条件为30 mmol/L葡萄糖干预RGECs 36 h。

2.3 抵当汤含药血清浓度对RGECs细胞活性的影响

随着含药血清体积分数的增加，RGECs细胞活性先上升后下降（图5）。与0%含药血清组相比，10%、20%和30%的含药血清都能显著提高RGECs的细胞活性（P<0.01）。抵当汤含药血清体积分数在5%~20% 时，随着含药血清体积分数的增加，细胞活性呈上升趋势；当含药血清体积分数超过30% 以上时，细胞相对活性又随含药血清体积分数的增加出现下降趋势。在10%和20%的含药血清浓度之间，细胞活性的差异并不显著（P>0.05）。因此选用10%抵当汤含药血清进行后续干预实验。

2.4 抵当汤含药血清对RGECs自噬囊泡荧光强度的影响

实验结果与正常组相比，高糖模型组绿色荧光面积、亮度明显降低，自噬荧光强度下降（P<0.01）。与高糖模型组相比，抵当汤组RGECs的自噬荧光强度上升（P<0.01）；而3-Ma组的自噬荧光强度与模型组差异无统计学意义（P>0.05，图6、7）。

2.5 抵当汤含药血清对RGECs Beclin-1、p62 mRNA表达的影响

与正常对照组相比，高糖模型组Beclin-1 mRNA相对表达量降低（P<0.01），p62 mRNA相对表达量升高（P<0.01），高糖组存在自噬抑制。与高糖模型组相比，抵当汤组Beclin-1 mRNA表达量上升（P<0.01），p62 mRNA表达量下降（P<0.01），抵当汤含药血清可以促进RGECs自噬的发生。与抵当汤+3-Ma组相比，抵当汤组Beclin-1 mRNA表达量上升（P<0.01），p62 mRNA表达量下降（P<0.01）；3-Ma组Beclin-1 mRNA表达量下降（P<0.01），p62 mRNA表达量上升（P<0.01，图8）。

2.6 抵当汤含药血清对RGECs Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白表达的影响

与正常对照组相比，高糖模型组Beclin-1蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白条带变细、灰度变浅，蛋白表达降低（P<0.01），p62蛋白条带变宽、灰度变深，表达升高（P<0.01）。与高糖模型组相比，抵当汤组Beclin-1蛋白上升（P<0.01），p62蛋白表达下降（P<0.01），抵当汤含药血清可以促进RGECs自噬的发生。与高糖模型组相比，3-Ma组Beclin-1表达下降，p62蛋白表达上升。与抵当汤+3-Ma组相比，抵当汤组Beclin-1蛋白表达上升（P<0.01），LC3Ⅱ/Ⅰ有上升趋势但差异无统计学意义（P>0.05），p62蛋白表达下降（P<0.05，图9、10）。

2.7 抵当汤含药血清对RGECs p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达的影响

与正常对照组相比，高糖模型组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达上升（P<0.01）。与高糖模型组相比，抵当汤组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平下降（P<0.01）。与抵当汤+3-Ma组相比，抵当汤组p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平下降（P<0.05，图11、12）。

3 讨论

DN可归属于中医“消渴”继发的水肿、尿浊、关格、肾消等病症范畴^［16］。《金匮要略》阐述：“病人如热状，烦满……口干燥而渴……是瘀血也” ^［17］，《血证论》云：“瘀血发渴者，以津液之生，其根出于肾水”^［18］，指出了消渴瘀血病机的存在。现代中医对DN的认识更加深入。吴以岭^［19］等结合肾小球微血管解剖及功能特点提出“肾络”概念，认为肾小球毛细血管网在结构上与络脉“支横别出、细窄迂曲”的特点相似，DN当从络病论治，肾络瘀阻是DN肾脏病理改变的重要基础。仝小林^［20］等认为，瘀、虚、毒是DN的基本病机，其中瘀为核心，治疗应着重化瘀通络，使旧血得去，新血得生，络脉通畅；吕仁和^［21］等提出了“微型癥瘕”的病机学说，强调了DN发病中存在痰、瘀、湿、热胶阻络脉，形成微型癥瘕，肾络闭阻，精气难以流畅，外溢下泄而见蛋白尿。纵观古今对DN的认识，其主要病机是瘀血停聚进而阻滞肾络，使气血运行失度，逐渐损伤人体正气，肾体受损，最终加速DN的发生与发展。抵当汤具有逐瘀通络、破积泄热之功效，与DN病机相符，可用于DN的防治。本实验结果证实，抵当汤含药血清通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路，增强RGECs的自噬，对DN发挥了较好的干预效果。

GECs是肾小球滤过屏障的关键组成部分，位于肾小球毛细血管腔内层，与循环血液直接接触，更容易受到血糖水平的影响而受损或发生功能障碍^［22］。研究表明，GECs功能障碍是DN发病的关键决定因素，其功能损伤与尿白蛋白排泄增加的密切相关^［23］。然而目前GECs永生化细胞株稀缺，因此本研究从培养原代RGECs入手，使用连续过筛法和胶原酶法结合的方式，实现了大鼠肾小球微血管团的分离与培养^［24-26］。综合考虑生长状况、组织连接紧密程度、肾组织体积与肾皮质分离难度，最终选择7~8 d龄的SD乳鼠为取材对象。为降低污染风险，使用两步过筛法分离肾小球，将肾皮质依次经过70、40 μm尼龙细胞筛，并利用注射器内芯研磨。为保证肾小球微组织活性，使用含更多盐类成分Hanks缓冲液不断进行冲洗，以更好地模拟体液环境。为促进肾小球微血管团的贴壁，使用Ⅳ型胶原酶消化破除肾小囊，并将其接种于明胶包被的培养皿中，每60 mm培养皿只加入2 mL培养基，且在接种后的前3 d避免移动。内皮细胞的生长依赖内皮细胞生长添加剂，本研究选用添加了ECGS的ECM专用培养基进行培养。经过3 d的培养，肾小球微血管团已较为牢固地贴壁，并可见少量短缩形、铺路石样细胞从其周围爬出，呈现“岛屿状”。肾小球微血管团接种7 d后，培养出的细胞集落扩大融合并逐渐铺满培养皿，呈现单层、铺路石样镶嵌式排列，形态饱满，与以往文献报道相符^［24］。为验证所培养细胞的纯度，本研究使用第Ⅷ因子免疫细胞荧光染色进行鉴定，结果显示细胞阳性率接近100%，表明所培养的RGECs纯度较高。此外，还可以使用足细胞特异标记物如Nephrin、Podocin与系膜细胞特异标志物α-SMA对细胞进行荧光染色，以排除足细胞与系膜细胞，该验证将在后续实验中实施。

自噬在GECs中发挥着重要作用，自噬流的正常存在保障着GECs的内稳态与细胞功能^［27］。自噬起始阶段，Beclin-l与Atg6结合形成复合体，响应应激信号并控制囊泡的形成。Beclin-1作为自噬激活的关键因子，其表达水平可以反应自噬的诱导状态^［28］。自噬囊泡逐渐扩展并包围目标物质，形成自噬体。在此过程中，LC3发生脂质化形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/Ⅰ可作为评估自噬囊泡形成的重要指标。自噬体与溶酶融合形成自噬溶酶体，其中p62能够结合泛素化的蛋白质并引导其降解，p62水平的下降通常意味着自噬活性的增强。本研究发现，高糖环境下RGECs的自噬活性受到抑制，表现为自噬相关蛋白Beclin-1表达下降，LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低，以及p62蛋白表达升高。经抵当汤含药血清处理后，显著促进了RGECs的自噬活性，表现为自噬荧光强度增加、Beclin-1表达上升和p62表达下降，表明抵当汤能够有效逆转高糖对RGECs自噬的抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在细胞生长、代谢及自噬调控中发挥着重要的作用^［5］。PI3K被激活后催化磷脂酰肌醇（PI）发生磷酸化生成PI-3-磷酸（PI3P）。在PI3K的作用下，生成的PI3P能够结合并激活Akt发生磷酸化，并调节其下游包括mTOR在内的多种底物^［29］。mTORC1作为mTOR在细胞内的主要存在形式，对自噬的启动具有直接的调控作用。在正常情况下，mTORC1通过磷酸化并抑制ULK1复合体，从而抑制自噬的启动^［30］。在DN的病理过程中，存在PI3K/Akt/mTOR的激活现象，这种激活可能通过多种机制导致自噬的抑制，进而加速DN的进展^［31］。本研究中，RGECs经过36 h高糖干预后，PI3K/Akt/mTOR信号通路过度激活，而抵当汤含药血清可以抑制该通路的过度激活，表明抵当汤含药血清对RGECs自噬的干预作用可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。需要注意的是，尽管3-Ma一定程度上减轻了抵当汤含药血清对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制作用，但抵当汤+3-Ma组与高糖组、3-Ma组之间存在差异，3-Ma并不能完全抑制抵当汤含药血清的干预效果，这提示抵当汤可能还通过其他途径影响PI3K/Akt/mTOR信号通路与自噬的发生。

综上所述，抵当汤含药血清可以增强高糖诱导的RGECs自噬的发生，其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。然而，PI3K/Akt/mTOR通路在细胞内的调控网络极为复杂，涉及到多个信号分子和交互作用，因此，在针对该通路进行药物干预时，需要充分考虑其可能带来的副作用和不良影响。中医药具有多靶点、多途径调节的特点，有望为糖尿病肾病的治疗提供更加全面、有效的方案。

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