Akkermansia muciniphila改善gp120转基因小鼠的肠-脑相互作用障碍

Akkermansia muciniphila gavage improves gut-brain interaction disorders in gp120 transgenic mice

摘要

目的 探究Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）灌胃对HIV-1的包膜病毒蛋白gp120诱导HIV相关神经认知功能障碍（HAND）动物模型中肠道菌群紊乱及肠-脑相互作用障碍（DGBIs）的改善作用。 方法 用16S rRNA基因测序技术检测6、9、12月龄野生型（WT型）小鼠与gp120转基因（gp120tg）小鼠肠道微生物组。将12月龄小鼠分为WT+PBS组、WT+A. muciniphila组、gp120+PBS组、gp120+A. muciniphila组，持续6周用A. mucinophila（2×10⁸ CFU/小鼠）灌胃WT+A. muciniphila组及gp120+A. muciniphila组小鼠，1次/d。使用电子天平称量小鼠体质量。免疫组化法观察各组小鼠结肠内糖基化黏蛋白表达水平、嗜酸性粒细胞浸润情况、嗜酸性粒细胞激活标志物主要碱性蛋白（MBP）表达水平。ELISA法检测12月龄小鼠血清内脂多糖表达情况及结肠内IL-1β表达水平。qPCR法检测各组小鼠结肠内Occludin、ZO-1、IL-10、TNF-α、INF-γ表达水平。通过Morris水迷宫试验探究各组小鼠学习及空间记忆能力，通过免疫荧光法观察各组小鼠脑神经元损伤情况。 结果 与WT型小鼠相比，gp120tg小鼠肠道菌群辛普森多样性降低（P<0.001），其中12月龄gp120tg小鼠Akkermansia属丰富度下降（P<0.05）；与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠血清内脂多糖含量明显升高（P<0.01），小鼠结肠内糖基化黏蛋白表达明显下调（P<0.01），灌胃减小结肠内糖基化黏蛋白的差异且灌胃前后各组小鼠体质量差异无统计学意义（P>0.05）；12月龄gp120tg小鼠结肠内紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平降低（P<0.001），并于灌胃后增加（P<0.001）；12月龄gp120tg小鼠结肠内嗜酸性粒细胞存在明显的浸润激活及促炎细胞因子TNF-α（P<0.001）、INF-y（P<0.001）、IL-1β（P<0.05）表达水平的上调，而抑炎细胞因子IL-10表达水平降低（P<0.001），灌胃可减小其差异；12月龄gp120tg小鼠存在明显的认知损伤且海马及皮层中神经元数量减少（P<0.05），灌胃后小鼠认知损伤得到明显改善且海马及皮层中神经元数量增加（P<0.05）。 结论 gp120tg小鼠菌群丰富度及多样性显著低于WT型小鼠，12月龄gp120tg小鼠Akkermansia属丰度明显低于WT型小鼠，二者DGBIs相关指标表达情况存在明显差异。A. muciniphila灌胃显著减少12月龄gp120tg小鼠肠屏障损伤、降低结肠炎症反应及嗜酸性粒细胞激活水平、减少小鼠认知损伤及脑神经元损伤。

Abstract

Objective To explore the effect of A. muciniphila gavage on intestinal microbiota and gut-brain interaction disorders (DGBIs) in gp120tg transgenic mouse models of HIV-associated neurocognitive disorder (HAND). Methods Intestinal microbiota was detected by 16S rRNA gene sequencing in 6-, 9-, and 12-month-old wild-type (WT) mice and gp120tg transgenic mice. The 12-month-old WT and transgenic mice were divided into 2 groups for daily treatment with PBS or A.muciniphila gavage (2×10⁸ CFU/mouse) for 6 weeks. After the treatment, immunohistochemistry, ELISA and qPCR were used to detect changes in colonic expression levels of glycosylated mucins, MBP and IL-1β, eosinophil infiltration, serum lipopolysaccharide (LPS) levels, and colonic expressions of occludin, ZO-1, IL-10, TNF-α and INF-γ mRNA. Morris water maze test and immunofluorescence assay were used to assess learning and spatial memory abilities and neuronal damage of the mice. Results Compared with WT mice, the transgenic mice exhibited significantly lowered Simpson's diversity of the intestinal microbiota with reduced abundance of Akkermansia genus, increased serum LPS levels and decreased colonic expression of glycosylated mucin. A.muciniphila gavage obviously ameliorated the reduction of glycosylated mucin in the transgenic mice without causing significant changes in body weight. The 12-month-old gp120tg mice had significantly decreased cdonic expressions of Occludin and ZO-1 with increased eosinophil infiltration and TNF-β, INF-γ and IL-1β levels and obviously lowered IL-10 level; all these changes were significantly mitigated by A.muciniphila gavage, which also improved cognitive impairment and neuronal loss in the hippocampus and cortex of the transgenic mice. Conclusion The gp120tg mice have lower intestinal microbiota richness and diversity than WT mice. The 12-month-old gp120tg mice have significantly reduced Akkermansia abundance with distinct DGBIs-related indexes, and A. muciniphila gavage can reduce intestinal barrier injury, colonic inflammation and eosinophil activation, cognitive impairment and brain neuron injury in these mice.

Graphical abstract

关键词

gp120 / 肠道菌群 / 肠-脑相互作用障碍 / 嗜酸性粒细胞 / 神经认知功能损伤 / Akkermansia muciniphila

Key words

gp120 / gut microbiota / gut-brain interaction disorders / eosinophils / neurocognitive impairment / Akkermansia muciniphila

神经退行性疾病HIV相关神经认知功能障碍（HAND）是HIV患者的并发症之一，大多数患者表现为轻度认知功能障碍，焦虑和抑郁是其常见合并症^{［1， 2］}。HIV-1的包膜病毒蛋白gp120存在于病毒的外层，其与人类T细胞受体CD4⁺结合的过程是 HIV-1 进入CD4⁺宿主细胞的第一步，gp120是病毒感染过程中的重要组成部分^［3］。HAND致病性的一个可能解释是gp120产生的持续免疫激活和细胞毒性作用导致中枢神经系统神经元损伤^［4-6］。本研究中使用的gp120转基因（gp120tg）小鼠是目前广泛应用于gp120相关HAND研究的动物模型。gp120tg小鼠能表现出与人类艾滋病大脑相似的神经病理学，例如突触和树突密度降低，活化小胶质细胞数量增加及星形胶质细胞数量显著增多。此外，gp120tg小鼠与神经认知损伤的HIV感染者大脑还存在大量相同的差异调节基因^{［7， 8］}。

肠道微生物群在神经退行性疾病发生发展中起重要作用，肠道微生物群改变在阿尔兹海默病及帕金森等神经系统疾病中已被证实，目前研究将Akkermansia属、Faecalibacterium属及Prevotella属定义为阿尔兹海默病及帕金森等神经退行性疾病肠道微生物群改变最常涉及的微生物群^［9］。有证据表明，肠道通透性参与这些神经系统疾病的发病机制^［10］。尽管有研究指出HIV患者常伴随肠道菌群紊乱^［11］、肠通透性增加^［12］，但HIV患者并发症HAND涉及的肠道微生物群改变仍未被广泛研究，肠-脑轴在gp120诱导神经认知功能损伤中的作用尚不明确。

肠-脑相互作用障碍（DGBIs），又名功能性胃肠道疾病，是指在没有结构异常的情况下出现的腹部症状，如肠易激综合征和功能性消化不良。包括焦虑和抑郁在内的心理障碍是DGBIs患者最普遍的精神合并症^［13］。DGBIs患者常伴随肠道炎症反应增加、肠道微生物群紊乱及肠道通透性增加等肠道症状^［14］。目前对于gp120诱导 HAND动物模型中肠道菌群紊乱及DGBIs指标改变尚无报道，因此本研究首先通过16S rRNA检测了gp120tg小鼠与野生型（WT型）小鼠肠道微生物组，基于前期16S rRNA测序结果检测回补A. muciniphila后gp120tg小鼠DGBIs相关指标的改善情况，从而探究gp120诱导 HAND动物模型中肠道菌群紊乱及DGBIs改变。

1 材料和方法

1.1 材料

动物实验方案由南方医科大学医学伦理委员会批准（伦理批号：D2022089），gp120tg小鼠由美国南加州大学洛杉矶儿童医院Saban研究所友情馈赠，在南方医科大学实验动物中心繁殖并鉴定。相同遗传背景的WT型C57BL/6小鼠购买于南方医科大学实验动物中心，作为正常对照组。实验组为gp120转基因小鼠（gp120tg小鼠，6、9、12月龄，n=20，雄性）；C57BL/6J 黑色小鼠（WT型小鼠，6、9、12月龄，n=14，雄性）用作野生型对照。DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），NanoDrop微量分光光度计、Qubit荧光计（赛默飞世尔科技），TruSeq DNA文库制备试剂盒（因美纳公司），TRIzol试剂、逆转录试剂盒、qPCR SYBR Green Master Mix（北京宝日医生物技术有限公司），脂多糖（LPS）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），白细胞介素 1β（IL-1β）试剂盒（江苏苏酶科生物有限公司），高碘酸-雪弗染色试剂盒和苏木素及铬变素（武汉赛维尔生物科技有限公司），神经元核NeuN抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），抗淬灭密封剂（赛默飞世尔科技），荧光显微镜（日本尼康公司），粘蛋白（上海源叶生物科技有限公司），脑心浸出液肉汤（广东环凯微生物科技有限公司），一抗（1∶200）、二抗（1∶500）（赛默飞世尔科技公司），NeuN（1∶200）、荧光二抗（1∶500）（武汉三鹰生物技术有限公司），水迷宫装置。

1.2 方法

1.2.1 肠道菌群16S rRNA测序

根据DNA提取试剂盒说明书，收集粪便用于DNA提取。使用NanoDrop微量分光光度计测定总DNA浓度。用引物V4 F（5'-G TGTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和V4 R（5'-CCG GACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16 S rRNA的可变区4（V4）进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，再72 ℃延伸10 min），最后4 ℃冷却并保存。根据制造商的建议，使用TruSeq DNA文库制备试剂盒产生测序文库，并添加索引代码。使用Qubit荧光计和Agilent2100生物分析仪系统对文库质量进行评估。最后，在Illumina HiSeq 2500平台上对文库进行测序。

1.2.2 A.mucinophila培养及灌胃

A.mucinophila标准菌株（ATCC BAA-835）购自广东省微生物菌种保藏中心。A.mucinophila在37 °C厌氧条件下，于含有0.2%来自猪胃的粘蛋白的脑心浸出液肉汤中生长。进一步将12月龄WT型小鼠随机分为WT+PBS组（WT型小鼠，灌胃PBS，n=6）、WT+A. muciniphila组（WT型小鼠，灌胃A. muciniphila，n=6），将12月龄gp120tg小鼠随机分为gp120+PBS组（gp120tg小鼠，灌胃PBS，n=6）、gp120+A. muciniphila组（gp120tg小鼠，灌胃A. muciniphila，n=6），在后续动物实验中，用A.mucinophila（2×10⁸ CFU/小鼠）灌胃WT+A.mucinophila组及gp120+A.mucinophila组小鼠，无菌PBS（200 μL/小鼠）灌胃WT+PBS组及gp120+PBS组小鼠，1次/d，持续6周。于每次灌胃实验开展前使用电子天平称量小鼠体质量并记录数据。

1.2.3 小鼠血清、结肠、脑组织取材

于取材前停止实验小鼠的水及粮食供给12 h，对小鼠实施腹腔麻醉。待小鼠进入深麻醉状态即可进行取材，于右心室取血，置于不含抗凝剂的无酶EP管，于4 ℃保存1 h，待血液凝固后，使用低温高速离心机离心，离心后收集上层的淡黄色血清。使用注射器取300 mL生理盐水对小鼠进行缓慢灌注至小鼠肝脏和肺部逐渐变为白色即可，随后断头，将脑组织置于无菌EP管中，向EP管中加入4%多聚甲醛，于4 ℃固定48 h以保持组织形态并防止其降解。取出结肠组织后使用无菌PBS洗涤小鼠结肠组织中的粪便残留物并将新鲜结肠组织置于无酶EP管中，部分使用4%多聚甲醛固定，部分置于-80 ℃保存备用。

1.2.4 RNA提取及qPCR

使用qPCR法检测小鼠结肠Occludin、ZO-1、TNF-α、INF-γ、IL-10表达水平。用TRIzol试剂提取小鼠结肠（0.1 g）总RNA后用逆转录试剂盒将提取的RNA转化为cDNA。使用qPCR SYBR Green Master Mix和7500实时荧光定量PCR系统测定基因表达。靶基因表达水平的相对定量通过2^-ΔΔCT方法测定，使用GAPDH和16 S进行归一化。本研究使用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.5 ELISA实验

按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠结肠组织内IL-1β及血清中LPS表达水平。在处死小鼠前收集小鼠血清及结肠组织。在4 ℃环境下，将100 mg新鲜结肠置于1.5 mL离心管内，向其中加入1 mL PBS液，用组织匀浆机破碎匀浆后，12 000 r/min离心10 min，取20 μL上清液。

1.2.6 免疫组织化学及特殊染色

使用免疫组化法观察小鼠结肠杯状细胞、嗜酸性粒细胞及嗜酸性粒细胞激活标志物MBP。首先，收集小鼠结肠组织样品并在4%多聚甲醛中4 ℃固定48 h以保持组织形态并防止降解。固定后，用PBS冲洗组织以去除过量的固定剂。固定的组织通过酒精脱水并包埋，使用切片机切割制备成石蜡切片。切片脱蜡至水，抗原修复后使用3%的双氧水处理切片，使用免疫组化油笔围绕组织画圈并使用血清进行封闭，一抗（1：200）4 ℃过夜孵育后二抗（1：500）室温孵育，加DAB显色液后使用苏木素染液复染，染色结束后进一步对组织进行脱水、透明，封片后使用显微镜观察MBP阳性嗜酸性粒细胞并采集图片。特殊染色切片则分别用过碘酸希夫（PAS）染色以分析杯状细胞，苏木素和铬变素染色组织块以分析嗜酸性粒细胞。使用光学显微镜在低倍镜（×10）下分析组织切片中的嗜酸性粒细胞及杯状细胞，并转换为更高放大倍镜（×40）进行单个细胞计数及观察特征。

1.2.7 免疫荧光检测

使用免疫荧光法检测小鼠海马及皮层组织神经元标志物NeuN表达情况。根据Abcam标准实验步骤对小鼠半脑样品进行固定、包埋和切片。用 1% BSA 封闭脑组织切片，并与用1% BSA稀释的一抗兔抗NeuN（1∶200）孵育过夜。洗涤切片后，将它们与荧光二抗（1∶500）在室温下孵育1 h。通过TBST洗涤后用DAPI 重新染色5 min，DAPI染色后添加抗淬灭密封剂覆盖切片。最后，通过荧光显微镜进行拍照并观察切片。

1.2.8 Morris水迷宫试验

实验分为两个部分：隐蔽站台试验、空间探索试验。实验开展前对4组小鼠进行平台可见期试验，此期间需暴露平台，并强制小鼠于平台上休息。隐蔽站台试验为期5 d，需隐藏平台。隐蔽站台试验结束的第2天进行空间探索试验。在该实验中，需移除水下隐藏的平台，随机将小鼠面朝池壁放入水池内。使用TSE VideoMot2视频跟踪小鼠，记录小鼠在60 s内穿越原平台的次数、小鼠在原平台所在象限停留时间等及小鼠游泳轨迹。

1.3 统计学分析

使用SPSS25.0进行统计分析，通过GraphPad Prism 9软件（版本9.5.0）生成图。多组比较采用单因素方差分析，Tukey法对数据进行事后多重检验，P<0.05为差异具有统计学意义。ImageJ软件用于分析组织样品的组织学图像。

2 结果

2.1 12月龄gp120tg小鼠Akkermansia属丰度降低

与WT型小鼠相比，gp120tg小鼠肠道微生物群辛普森多样性指数降低（P<0.001，图1A）。主坐标分析（PCoA）揭示了两组样本之间的明显分离（图1B）。12月龄小鼠属水平上的肠道菌群差异热图显示gp120tg小鼠Akkermansia属、Prevotella属等的丰度显著低于WT型小鼠（图1C）。Akkermansia属丰度随着gp120tg小鼠年龄增加而持续下降，其中12月龄gp120tg小鼠与12月龄WT型小鼠Akkermansia属丰度存在显著差异（P<0.05，图1D）。

2.2 12月龄gp120tg小鼠肠屏障受损

与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠结肠内杯状细胞PAS阳性细胞明显减少（P<0.01，图2A、B），血清内LPS含量增加（P<0.001，图2C）。qPCR结果显示，与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠结肠IFN-γ表达水平升高（P<0.001，图2D），结肠紧密连接蛋白Occludin及ZO-1表达水平降低（P<0.001，图2E、F）。

2.3 12月龄gp120tg小鼠肠道炎症反应及免疫应答增加

与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠结肠嗜酸性粒细胞存在明显浸润（P<0.05，图3A、C）。免疫组化结果显示，12月龄gp120tg小鼠结肠MBP阳性细胞增加，嗜酸性粒细胞激活水平升高（P<0.05，图3B、D）。与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠结肠内抗炎细胞因子IL-10表达水平下调（P<0.001，图3E），促炎细胞因子TNF-α表达水平上调（P<0.001，图3F）。ELISA结果显示，gp120tg小鼠IL-1β表达量高于WT型小鼠（P<0.05，图3G）。

2.4 A.muciniphila灌胃改善12月龄gp120tg小鼠肠屏障损伤

与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg小鼠杯状细胞PAS阳性细胞减少（P<0.01），A.muciniphila灌胃显著缩小其差异（图4 A、B），同时下调12月龄gp120tg小鼠结肠内INF-γ表达水平，上调12月龄gp120tg小鼠结肠紧密连接蛋白Occludin及ZO-1表达水平（P<0.001，图4C~E），改善了12月龄gp120tg小鼠结肠紧密连接完整性。检测灌胃A.muciniphila前后小鼠体质量变化，结果显示12月龄WT型小鼠及gp120tg小鼠体质量均无发生显著改变（P>0.05，图4F）。

2.5 A.muciniphila灌胃降低12月龄gp120tg小鼠结肠炎症反应及免疫应答水平

免疫组化结果显示，gp120+PBS组结肠内嗜酸性粒细胞浸润水平高于WT+PBS组（P<0.05），A.muciniphila灌胃缩小其差异（图5A、C），并下调了gp120tg小鼠结肠内MBP表达水平（P<0.05，图5B、D）。与gp120+PBS组相比，灌胃增加了12月龄gp120tg小鼠结肠内IL-10表达量（P<0.01，图5E），减小了12月龄gp120tg小鼠结肠内TNF-α表达量（P<0.01，图5F）。ELISA检测结果显示，与gp120+PBS组相比，gp120+A.muciniphila组小鼠结肠内IL-1β表达水平上调（P<0.05），灌胃显著缩小其差异（图5G）。

2.6 A.muciniphila灌胃改善12月龄gp120tg小鼠认知损伤

在空间探索试验中，各组小鼠游动轨迹图显示，gp120+PBS组小鼠的搜索轨迹集中性较低（图6A）。gp120+PBS组小鼠在目标象限花费的时间及路程明显低于WT+PBS组小鼠（P<0.05），灌胃显著缩小了其差距（图6B、C）。同时，gp120+PBS组小鼠穿越平台次数低于WT+PBS组（P<0.01，图6D），A.muciniphila灌胃显著减小了其差距（图6D）。各组小鼠的游动速度及总游动距离差异均无统计学意义（P>0.05，图6E、F）。

2.7 A.muciniphila灌胃改善12月龄gp120tg小鼠脑神经元损伤

通过NeuN（绿色）免疫荧光定量12月龄gp120tg小鼠脑神经元损伤程度。gp120+PBS组海马（P<0.01）及皮层（P<0.05）中神经元数量低于WT+PBS组。gp120+A.muciniphila组相较gp120+PBS组，小鼠海马（P<0.01）及皮层（P<0.05）中神经元数量增多（图7）。

3 讨论

HIV-1相关神经认知功能障碍（HAND）背后的致病机制仍未被充分解释，HAND致病性一个可能解释是gp120产生的持续免疫激活和细胞毒性作用导致中枢神经系统神经元损伤^［4-6］。本研究探究了gp120诱导HAND动物模型中肠道菌群紊乱及肠-脑相互作用障碍（DGBIs）指标改变。结果显示，gp120转基因（gp120tg）小鼠相较野生型（WT型）小鼠，其肠道菌群辛普森多样性指数显著降低，菌群丰富度及多样性显著下降。其中，Akkermansia属丰度在gp120tg小鼠中呈年龄相关性下降，12月龄gp120小鼠Akkermansia属丰度显著低于WT型小鼠，这与已报道的在HIV患者中的发现存在一致性^［15-17］。近期研究表明，Akkermansia属能增加抗炎细胞因子释放^［18］。Akkermansia属通过保护粘液层在肠道健康中起重要作用，其失调与肠屏障功能损伤相关^{［19， 20］}。我们进一步检测12月龄小鼠肠屏障相关指标并使用“肠道炎症动物模型组织病理学评价的类别和一般标准”对PAS染色结果进行评分^［21］。结果发现，与12月龄WT型小鼠相比，12月龄gp120tg杯状细胞丰度明显减少、血清LPS含量明显增加、肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1表达水平显著下调，而gp120+A.muciniphila组肠屏障指标明显得到改善。这表明12月龄gp120tg小鼠肠屏障存在明显的损伤，A.muciniphila能减小12月龄gp120tg小鼠肠屏障损伤程度。肠屏障功能障碍是DGBIs基本病理特征之一^{［22， 23］}。2016年，罗马IV诊断指南中将 “功能性胃肠障碍”重命名为“肠-脑相互作用障碍（DGBIs）”^［24］，强调了肠道和大脑之间的异常相互作用是该疾病的核心机制。为探究肠-脑轴机制疾病DGBIs指标在gp120诱导的肠道菌群紊乱与神经认知损伤中的潜在作用，我们进一步检测了DGBIs相关指标。

肠上皮屏障具有分隔肠腔内物质及维持肠内稳态的重要作用，当肠道菌群失调、肠屏障被破坏时，微生物代谢产物及其他外来有害物质就可以通过受损的肠屏障进入体内，从而导致机体免疫系统激活，急性或慢性炎症发生。目前许多证据表明，肠道炎症与肠屏障功能障碍有关^［25］。在DGBIs患者肠道中，促炎细胞因子如INF-γ、IL-1β、TNF-α表达显著上调^［26］。本研究中，12月龄gp120tg小鼠结肠INF-γ表达水平显著高于12月龄WT型小鼠，灌胃显著缩小了这种差异。已有研究表明， IFN-γ在调节紧密连接蛋白表达和肠屏障功能方面起着至关重要的作用^{［27， 28］}。同时，IFN-γ 是目前许多研究中测量肠道炎症严重程度的替代指标^［29］。这提示肠屏障受损的12月龄gp120tg小鼠肠道内可能存在较高的炎症反应。在此基础上，我们进一步检测了12月龄小鼠结肠内炎症细胞因子的表达情况，研究结果观察到，与WT型小鼠相比，肠屏障功能明显损伤的gp120tg小鼠结肠内促炎细胞因子IL-1β及TNF-α表达水平明显上调、抑炎细胞因子IL-10表达水平明显下调，灌胃显著缩小了这种差异。12月龄gp120tg小鼠结肠炎症反应增加可能与肠屏障损伤有关。

持续不断的炎症会引起机体免疫系统激活。最近研究提出了DGBIs患者肠粘膜内免疫细胞如肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润的证据，这一证据还表明，免疫细胞和肠上皮细胞释放的伤害性介质增加在DGBIs中起关键作用^［30］。在本研究中，12月龄gp120tg小鼠相较12月龄WT型小鼠，其结肠组织嗜酸性粒细胞存在明显的浸润。在此基础上，我们通过MBP染色评估MBP沉积并观察嗜酸性粒细胞以评估gp120tg小鼠结肠组织中嗜酸性粒细胞激活情况，阳性MBP可以指示嗜酸性粒细胞的活化。实验结果观察到gp120+PBS组与WT+PBS组相比具有较高数量的MBP阳性嗜酸性粒细胞。gp120+A.muciniphila组与WT+A.muciniphila组则无明显差异，灌胃显著降低了12月龄gp120tg小鼠结肠嗜酸性粒细胞浸润激活水平。12月龄gp120tg小鼠嗜酸性粒细胞数量增加及MBP阳性嗜酸性粒细胞的存在表明嗜酸性粒细胞积极参与了其结肠组织内的免疫应答，这可能是对炎症刺激的应答。已有研究表明，嗜酸性粒细胞可以通过从其颗粒释放的包括MBP在内的各种细胞因子及蛋白质增强其他炎症细胞的增殖和活力^［31］。MBP还具有破坏细胞膜脂质双层的细胞毒性作用，最终可导致肠紧密连接损伤并可导致细胞死亡^［32］。嗜酸性粒细胞释放的生物活性介质，如阳离子蛋白及神经营养因子，能导致包括神经生长、神经损伤、神经肽合成和释放及激活和敏化在内的多种神经元效应，导致病理条件下的高反应性和异常神经肽释放^［31］。同时，抑郁和认知损伤往往伴随明显的脑神经元损伤^{［33， 34］}。而近期研究表明，帕金森模型小鼠肠道中Akkermansia属丰度显著降低^［35］，A.muciniphila灌胃可以减少帕金森小鼠海马体的神经炎症^［36］，A.muciniphila补充在神经退行性疾病治疗中发挥重要潜在作用。本研究进一步检测了A.muciniphila灌胃前后12月龄gp120tg小鼠学习能力、空间记忆能力及脑神经元数量变化，结果表明A.muciniphila灌胃明显改善12月龄gp120tg小鼠认知损伤及脑神经元损伤。然而，本研究并未深入探讨嗜酸性粒细胞释放的生物活性介质对神经元产生的影响，拟作为下一个研究重点进行探讨。

本研究通过16S rRNA测序分析发现12月龄WT型小鼠与gp120tg小鼠Akkermansia属丰度存在显著差异，在此基础上探究了A.muciniphila灌胃前后DGBIs相关指标的改变，发现A.muciniphila可改善gp120诱导的神经认知功能损伤。综上所述，本研究初步证实了gp120诱导的肠道菌群紊乱与神经认知功能损伤相关，本研究中A.muciniphila灌胃处理后gp120tg小鼠DGBIs相关指标的改善提示了恢复gp120诱导的微生物群紊乱可改善gp120诱导的神经认知功能损伤。这一研究结果将为gp120诱导的HIV患者神经认知功能损伤提供新型治疗思路。

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