槲皮素通过调控L型钙通道改善糖尿病大鼠心肌损伤

Quercetin ameliorates myocardial injury in diabetic rats by regulating L-type calcium channels

摘要

目的 探讨槲皮素对糖尿病大鼠心肌铜死亡与心肌L型钙电流的影响。 方法 动物实验：对40只SD大鼠进行对照（Con）和糖尿病模型构建，后者通过高糖高脂饲料且用STZ诱导，糖尿病模型进一步分为模型组（DM）、槲皮素组（DM+Que）和恩格列净组（DM+Empa），n=10。每2周测量大鼠血糖和体质量，通过超声心动图评估心脏功能，通过HE染色、天狼猩红染色和WGA染色观察心肌组织形态学变化，并检测血清铜离子水平和FDX1的表达情况。体外细胞（大鼠H9c2心肌细胞）实验：分别设置低糖组（Con）、高糖组（HG）、槲皮素组（HG+Que）、伊利司莫组（HG+ES）和伊利司莫+槲皮素组（HG+ES+Que），通过CK-MB和LDH评估心肌损伤，检测FDX1蛋白表达。膜片钳技术检测心肌细胞L钙电流变化。 结果 与Con组相比，DM组大鼠血糖增加（P<0.05），体质量下降（P<0.05），左心功能下降，血清铜水平和FDX1表达增加（P<0.01），心肌L钙电流减小（P<0.01），动作电位时程延长（P<0.01）。与DM组相比，药物组血糖水平降低（P<0.05）、体质量增加（P<0.05）、左心功能改善。与DM+Empa组相比，槲皮素组铜离子水平、FDX1表达减少（P<0.01），心肌L钙电流增加（P<0.05）。在体外实验中，HG组的FDX1表达水平和心肌损伤均增加，槲皮素干预后，FDX1表达降低和心肌损伤改善。HG+ES组的FDX1、CK-MB和LDH均升高（P<0.05），加入槲皮素后，这些指标与HG+ES组相比差异没有统计学意义（P>0.05）。 结论 槲皮素可以改善糖尿病大鼠心肌损伤，可能与抑制铜死亡信号通路从而恢复心肌L型钙电流有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of quercetin on cuproptosis and L-type calcium currents in the myocardium of diabetic rats. Methods Forty SD rats were randomized into control group and diabetic model groups. The rat models of diabetes mellitus (DM) induced by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin (STZ) injection were further divided into DM model group, quercetin treatment group, and empagliflozin treatment group (n=10). Blood glucose and body weight were measured every other week, and cardiac function of the rats was evaluated using echocardiography. HE staining, Sirius red staining, and wheat germ agglutinin (WGA) analysis were used to observe the changes in myocardial histomorphology, and serum copper levels and myocardial FDX1 expression were detected. In cultured rat cardiomyocyte H9c2 cells with high-glucose exposure, the effects of quercetin and elesclomol, alone or in combination, on intracellular CK-MB and LDH levels and FDX1 expression were assessed, and the changes in L-type calcium currents were analyzed using patch-clamp technique. Results The diabetic rats exhibited elevated blood glucose, reduced body weight, impaired left ventricular function, increased serum copper levels and myocardial FDX1 expression, decreased L-type calcium currents, and prolonged action potential duration. Quercetin and empagliflozin treatment significantly lowered blood glucose, improved body weight, and restored cardiac function of the diabetic rats, and compared with empagliflozin, quercetin more effectively reduced serum copper levels, downregulated FDX1 expression, and enhanced myocardial L-type calcium currents in diabetic rats. In H9c2 cells, high glucose exposure significantly increased myocardial expressions of FDX1, CK-MB and LDH, which were effectively lowered by quercetin treatment; Elesclomol further elevated FDX1, CK-MB and LDH levels in the exposed cells, and these changes were not significantly affected by the application of quercetin. Conclusion Quercetin ameliorates myocardial injury in diabetic rats possibly by suppressing myocardial cuproptosis signaling and restoring L-type calcium channel activity.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / 糖尿病心肌病 / L-型钙电流 / 铜死亡

Key words

quercetin / diabetic cardiomyopathy / L-type calcium currents / cuproptosis

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病患者中最常见的并发症之一，随着病情的进展，心脏舒张和收缩功能同时受损，导致心力衰竭^［1-4］。心功能障碍与多种因素有关，包括心脏能量代谢改变、线粒体功能障碍、氧化应激增加以及钙离子平衡失调^［5］。心功能下降，部分是由于线粒体对钙的处理异常以及游离钙水平降低所引起^［6］，多项研究指出，糖尿病大鼠的心肌肌浆网Ca²⁺-ATP酶活性降低，心肌细胞L-型钙电流密度降低，导致糖尿病大鼠心脏功能受损^［7-10］；提高心肌肌浆网Ca²⁺-ATP酶的表达可以改善糖尿病心脏收缩功能障碍^［11］，表明心肌功能与细胞内Ca²⁺平衡密切相关。

在DCM的病理生理过程中，铜离子代谢失衡被认为是一个关键因素。铜离子稳态失衡可能导致氧化应激增加，干扰蛋白降解机制，并触发铜离子的还原反应，加速心血管疾病的病变过程^［12］。铜离子缺乏引起心肌肥厚并加剧心肌病发展^［13］，铜离子过量则通过诱导多种形式的细胞死亡而对心肌产生毒性作用^［14-16］，铜离子缺乏或过量均有可能对心脏造成损害^［17］。研究显示，铜离子平衡的破坏参与心脏重塑过程并且直接调控心脏兴奋性，改变动作电位的传导过程，增加心律失常的风险^［18-21］。并且铜离子具有氧化还原活性，可以激活PI3K/AKT等信号通路，此通路激活可能间接影响到L型钙通道的功能^［22-24］。尽管如此，目前尚未有报道通过调节铜离子稳态来影响心肌L-型钙电流的有效药物。

槲皮素（Que）作为一种重要的黄酮类化合物，已被证实具有多种生物活性，包括降血压^［25］、抗高脂血症^［26］、抗高血糖^{［27， 28］}、抗氧化^［29］、抗肿瘤^［30］、抗炎^［31］、神经保护和心脏保护等作用^［32］。研究显示，槲皮素不仅可以降低糖尿病大鼠血糖水平，也是一种有效的强心剂，槲皮素及其代谢物增强了心肌细胞的收缩和钙离子瞬变，从而对心肌细胞具有直接的正性肌力作用^［33］。前期我们课题组也有相关研究证明槲皮素能够改善糖尿病大鼠心肌收缩舒张功能，对DCM具有保护作用^［34］。本研究与以往研究相比，不仅关注了槲皮素对心脏功能的直接影响，还特别关注了其对铜离子稳态和钙离子平衡的调节作用，这可能为DCM的治疗提供新的视角。

1 材料和方法

1.1 动物及细胞

选取雄性SD大鼠，体质量160~180 g，由江苏青龙山生物科技有限公司提供，实验动物使用许可证号为SCXK（苏）2024-0001。充足饮水，实验环境为室温，相对湿度为45%~55%，本研究已获得蚌埠医科大学伦理委员会的审查和批准（伦理批号：2019-074），在动物的饲养和实验操作过程中，严格遵循《实验动物管理条例》的规定。大鼠H9c2心肌细胞系购于武汉普诺赛生命科技有限公司（CL-0089）。

1.2 主要试剂与设备

槲皮素（Que）、STZ、胶原酶Ⅱ、蛋白酶E、小牛血清蛋白（BSA）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、乙二醇双四乙酸（EGTA）、氯化铯（CsCl）、三磷酸腺苷二钠（Na₂ATP）（Sigma）；恩格列净（Empa，麦克林）；异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司）；戊巴比妥钠（北京普博斯生物有限公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养基（Gibco）；兔抗大鼠FDX1抗体、兔抗a-tublin抗体（HUABIO）；Goat anti-rabbit IgG（Biosharp）；BCA、HE、DAPI、天狼猩红、小麦胚芽凝集素染色试剂盒（碧云天）；CK-MB（Solarbio）、LDH（南京建成生物工程研究所），肝素钠注射液（江苏万邦生化医药股份有限公司）；小动物超声机（Visual Sonics）；化学发光成像系统（Fluor ChemM），Multiclamp200B膜片钳放大器、DigiData1440A型数/模转换器、pClamp10.2脉冲发放和数据采集软件均为Axon，微电极拉制仪P-1000（Sutter Instrument），倒置荧光显微镜（Olympus），Langendorff离体心脏灌流装置（AD Instruments）。

1.3 主要方法

1.3.1 糖尿病模型建立及实验分组

在体水平：将40只SD雄性大鼠利用Excel随机数字法分为对照组（Con，n=10）、模型组（n=30）。全部大鼠先给予常规饲料适应性喂养7 d，模型组高糖高脂饲料喂养，随后模型组大鼠腹腔注STZ（30 mg/kg）^［34］建立DM模型，以血糖≥16.7 mmol/L选入模型组。模型组随机分为DM组、DM+Que组和DM+Empa组，各10只，根据课题组前期研究及相关文献支持，我们选择予以槲皮素（50 mg·kg^-1·d^-1）^［34］灌胃，Empa （10 mg·kg^-1·d^-1）^［35］腹腔注射，每2周测定空腹血糖和体质量，第16周测量其他相关指标。

体外水平：H9C2细胞培养至80%~90%后进行传代，将细胞分为对照组（Con组）、高糖组（HG组）、高糖+槲皮素组（HG+Que组）、高糖+伊利司莫（铜离子载体）组（HG+ES组）及高糖+伊利司莫+槲皮素组（HG+ES+Que组）。其中Con组培养在低糖（5.5 mmol/L） DMEM培养基中，HG组培养在高糖（30 mmol/L）培养基中^［36］。Con组予以DMSO作为对照，HG+Que组、HG+ES分别予以槲皮素50 μmol/L^［34］，ES 40 nmol/L^［37］，HG+ES+Que组同时予以ES和槲皮素，于37 ℃细胞培养箱中培养48 h^［36］后进行后续实验。

1.3.2 超声心动图检查

依次将各组大鼠放入小动物麻醉箱内，使用异氟烷进行麻醉诱导，将气体流量设置为3 L/min，直至大鼠出现肌肉松弛且失去翻正反射后将其固定在实验板上，低流量维持麻醉状态，大鼠四肢涂抹导电胶，胸部涂抹超声耦合剂，用MS-250型号的超声探头进行心脏超声检查。通过M模式超声图像，在左心室长轴切面测量以下心脏功能参数：左室射血分数（LVEF%）、左室缩短分数（LVFS%）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）、心输出量（CO）以及心率（HR），来评估大鼠的心脏功能。

1.3.3 血清铜离子检测

大鼠麻醉后剖腹，腹主静脉取血，存放于不含EDTA的抗凝管中静置30 min后3000 r/min，离心15 min后取上清。采用铜比色试剂盒测定血清中铜含量，具体步骤按试剂盒说明书操作，最后使用酶标仪测量各孔吸光度A_{580 nm}，并根据试剂盒提供的标准品，得出标准曲线，计算各组大鼠血清Cu水平。

1.3.4 各组心肌组织病理学检测

1.3.4.1　HE染色

将大鼠脱颈处死，快速解剖并取出心脏，洗涤、固定、石蜡包埋、切片。将组织切片依次放入苏木素-伊红染液试剂盒的各个染色步骤中。首先，在试剂一核染液染缸内进行染色，持续3~5 min，随后用水冲洗30~60 s。接着，将切片浸入试剂二分色液I中约20 s，然后再次用水冲洗。之后，将切片浸入试剂三分色液II中约40 s，水洗后，最后将切片置于试剂四浆染液中染色2 min。染色完成后，使用试剂五增色液去除多余的染液，用滤纸吸干后封片。在普通光学显微镜下观察各组心脏组织的形态。

1.3.4.2　天狼猩红染色

从1.3.4.1节中选取大鼠心肌组织切片，按照标准程序进行脱蜡和水合处理。接着，使用二甲苯分两次浸泡切片，5 min/次。依次将切片在无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min，并用自来水清洗3次。将0.1 g天狼猩红溶解在100 mL苦味酸饱和溶液中，制备成苦味酸天狼猩红工作液。将切片放入苦味酸天狼猩红染液中染色2 h，然后用自来水轻轻冲洗，晾干后用中性树胶封片。在偏振光显微镜下观察心肌组织中胶原蛋白的沉积情况。用lmage-J软件计算大鼠心肌组织中肌胶原容积分数（CVF）水平，CVF=胶原纤维面积/视野面积×100%。

1.3.4.3　小麦胚芽凝集素（WGA）染色

取1.3.4.1中大鼠心肌组织切片，将心肌组织石蜡切片脱蜡、修复、麦胚凝集素进行染色、DAPI复染核、封片，在荧光显微镜下观察拍照，存留图像，用ImageJ软件分析各组心肌细胞大小差异。

1.3.5 免疫组化检测心肌铁氧还蛋白1（FDX1）表达

从1.3.4.1节中选取大鼠心肌组织切片，并按照常规步骤进行脱蜡和水合处理。将切片分两次使用二甲苯浸泡，5 min/次。然后，依次在无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡切片，5 min/次，并使用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗切片3次。将切片放入含有抗原修复缓冲液的染色盒中，用微波炉加热10 min，取出后冷却并用PBS清洗3次。在每张切片上滴加2滴3% H₂O₂甲醇溶液，在室温（15~25 ℃）下封闭10 min。接着，滴加1%牛血清白蛋白（BSA）50~100 μL，并在室温下孵育20 min。然后滴加FDX1（华安生物）稀释至1∶200的比例，4℃下孵育过夜。之后加入山羊抗兔IgG，稀释至1∶200，并使用DAB试剂盒进行显色。在显微镜下观察棕黄色颗粒的沉积，以此作为阳性信号的指标。使用ImageJ软件进行半定量分析，计算出平均光密度值（MOD）。

1.3.6 Western blotting

获取大鼠新鲜心肌组织和细胞总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，定量后用12.5%分离胶通过SDS-PAGE分离不同相对分子质量大小的蛋白，转移至PVDF膜上，封闭，加入一抗FDX1（1∶500）过夜，敷二抗，ECL化学发光检测，以a-tublin（1∶1000）为参照，采用ImageJ软件处理图像。

1.3.7 细胞免疫荧光检测各组FDX1表达水平

将适量H9C2细胞均匀种入共聚焦玻璃皿中，贴壁后按照分组干预48 h。干预结束后按照固定、通透、封闭，孵育FDX1一抗（1∶200），孵育FITC标记的二抗（1∶500），DAPI染核等步骤进行操作，最后用倒置荧光显微镜进行拍摄。

1.3.8 ELISA法检测心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）含量。

各组细胞培养结束后，按试剂盒说明书收集细胞培养上清检测，采用酶标仪测定各孔的吸光度A_{450 nm}，根据标准曲线计算血清中心肌损伤标志物CK-MB和LDH含量。

1.3.9 细胞膜片钳L型钙离子电流检测

1.3.9.1 心肌细胞分离

各组大鼠称量体质量后，通过腹腔注射肝素钠（3125 U/kg），20 min后，再注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）进行麻醉。随后进行解剖，迅速取出心脏，并将其放入含有预先冷却的无Ca²⁺台式液（成分为mmol/L：135 NaCl、1.0 MgCl₂、5.4 KCl、0.3 NaH₂PO₄、10 HEPES和10 Glucose，用NaOH溶液调节pH至7.4）的培养皿中。轻轻捏压心脏以定位主动脉，小心地将主动脉套在套管底部，并用手术缝线固定，然后彻底清洗心室、心房和冠脉，去除残留的血液。接下来，使用无Ca²⁺台式液灌注心脏约min，然后改用含有II型蛋白胶原酶（206 U/mL）和BSA（1 mg/mL）的无Ca²⁺台式液继续灌注约16 min，直至酶解完成。之后，立即将灌注液更换为KB溶液（成分为mmol/L：70 KOH，40 KCl，20 KH₂PO₄，3.0 MgSO₄， 20 Taurine，50 Glutamic acid， 0.5 EGTA，10 Glucose和10 HEPES；pH值用KOH调节至7.4），并用剪刀将左心室剪成小块，轻轻吹打，通过200目筛网过滤，将滤液转移到离心管中，以500 r/min的速度离心30 s。弃去上清液，保留沉淀物在KB液中。在这一过程中，所有使用的灌注液都需用95%O₂和5%CO₂饱和，并保持温度在37 ℃左右。使用滴管将1~2 mL心室肌细胞悬液滴入倒置显微镜载物台的灌流槽内，待心室肌细胞沉底并贴壁后，选择那些横纹清晰、边缘锐利、状态良好的心室肌细胞进行实验。

1.3.9.2 全细胞膜片钳记录

在不同的钳制电压条件下，对心室肌细胞的L型钙电流（I_Ca-L）的动力学特性进行测量，每组记录12个细胞。细胞外液浴液的组成为（mmol/L：5.4 CsCl，135 NaCl，21.0 MgCl，0.33 NaH₂PO₄，0.3 BaCl₂，10 Glucose，10 HEPES，1.8 CaCl₂，用KOH调整pH至7.4）。玻璃电极内液的组成为（mmol/L：5.0 Na₂ATP，5.0 MgCl₂，1.0 CaCl₂，10 TEA-Cl，10 EGTA，10 HEPES，120 CsCl，用KOH调整pH至7.3）。记录I_Ca-L的方法是：设定指令电压从-60 mV~+60 mV，以10 mV为一个步进，每个步进的钳制时间为400 ms。选择电流幅值稳定的区间，记录各组心室肌细胞I_Ca-L的动力学变化。在电流钳位模式下，使用4na的刺激电流持续1ms以诱发动作电位，并记录动作电位复极至50%时的持续时间（APD50）、复极至90%时的持续时间（APD90）以及动作电位振幅（APA）。

通道电流密度为电流强度与细胞膜电容比值（pA/pF），这样可以消除由于不同细胞表面积导致的电流误差，膜电容可以直接在放大器上读取，通过这种方法，可以观察不同组别心室肌细胞I_Ca-L的变化情况。

1.3.10 统计学分析

采用GraphPadPrism9软件进行数据统计处理，计量资料采用均数±标准差表示，3组及以上之间的差异采用方差分析。以P<0.05为有差异有统计学意义。所有实验结果重复3次以上。

2 结果

2.1 槲皮素对糖尿病大鼠血糖、体质量的影响

与Con相比，DM组大鼠血糖升高（P<0.01，图1A），体质量降低（P<0.01，图1B）；与DM组相比，药物组大鼠血糖降低（P<0.01，图1A），体质量增加（P<0.01，图1B）。

2.2 槲皮素对糖尿病大鼠心功能的影响

与Con组相比，DM组LVEF、LVFS、CO、HR降低（P<0.01，图2B、C、F、G），LVEDD、LVESD升高（P<0.01，图2D、E）；与DM组相比，药物组LVEF、LVFS、CO、HR升高（P<0.01，图2B、C、F、G），LVEDD、LVESD降低（P<0.01，图2D、E）。

2.3 槲皮素对糖尿病大鼠心肌组织病理结构的影响

HE染色结果显示：与Con组相比，DM组走行紊乱，可见断裂的心肌纤维（图3A）；与DM组相比，药物组细胞形态大体完整，心肌纤维断裂减轻（图3A）。天狼猩红染色结果显示：与Con组相比，DM组心肌间质内胶原纤维增粗（P<0.01，图3A、B）；与DM组相比，药物组心肌组胶原纤维减少（P<0.01，图3A、B）。WGA染色结果显示：与Con组相比，DM组心肌细胞横截面积增加（P<0.01，图3A、C）；与DM组比较，药物组心肌细胞横截面积降低（P<0.05，图3A、C）。

2.4 槲皮素对糖尿病大鼠心肌细胞铜死亡的影响

血清铜离子检测结果显示：与Con组对比，DM组血清铜离子升高（P<0.01，图4C）；与DM组对比，槲皮素组血清铜离子浓度降低（图4C）；与DM+Empa组对比，槲皮素组血清铜离子浓度降低（P<0.01，图4C）。心肌组织化学染色结果显示：与Con组对比，DM组大鼠心肌组织中平均光密度值升高（P<0.01，图4A、B）；与DM组对比，槲皮素组心肌中FDX1平均光密度值减少（P<0.01，图4A、B）；与DM+Empa组对比，槲皮素组心肌中FDX1平均光密度值减少（P<0.01，图4AB）；Western blotting结果显示：与Con组相比，DM组大鼠心肌组织中FDX1蛋白表达量明显升高（P<0.01，图4D、E），与DM组对比，槲皮素组心肌中FDX1蛋白的表达量减少（P<0.01，图4D、E），与DM+Empa组对比，槲皮素组心肌中FDX1蛋白的表达量减少（P<0.01，图4D、E）。

2.5 体外验证槲皮素通过影响铜死亡通路对高糖诱导的心肌细胞损伤的保护作用

Western blotting与免疫荧光结果显示：与Con组相比，HG组FDX1表达升高（P<0.01，图5A~D）；与HG组对比，HG+Que组FDX1表达降低（P<0.05），HG+ES组FDX1表达升高（P<0.05，图5A~D），与HG+ES组对比，HG+ES+Que组FDX1表达无差异（图5A~D）。心肌损伤标志物结果显示：与Con组相比，HG组CK-MB和LDH水平升高（P<0.01）；与HG组对比，HG+Que组CK-MB和LDH水平降低（P<0.05），HG+ES组CK-MB和LDH水平升高（P<0.01）；与HG+ES组对比，HG+ES+Que组CK-MB和LDH水平无差异（图5E、F）。

2.6 槲皮素对糖尿病大鼠心肌L钙电流和动作电位（AP）的影响

电流结果显示：与Con组对比，DM组在各钳制电压下，电流密度明显减小（P<0.01，图6A），I-V曲线发生上移（图6B）；与DM组相比，药物组在各钳制电压下，电流密度增加，I-V曲线发生下移（P<0.01，图6A、B）；与DM+Empa组对比，槲皮素组在各钳制电压下，电流密度增加，I-V曲线发生下移（P<0.05，图6A、B）。动作电位（AP）结果显示：与Con组相比，DM组APD50和APD90延长（P<0.01，图6D），APA降低（P<0.05，图6E）；与DM组相比，药物组APD50和APD90缩短（P<0.01，图6D），APA无明显变化（图6E）。

3 讨论

DCM是一种严重的并发症，其特点是心肌细胞代谢紊乱和心脏微血管病变，导致心脏收缩和舒张功能障碍^［2］。L型钙离子通道在心肌细胞的兴奋-收缩耦联中发挥关键作用，调控钙离子通道，可以影响心肌收缩和舒张功能。糖尿病状态下，氧化应激和代谢途径变化会抑制L型钙离子通道功能，导致心肌细胞内钙离子电流密度减小，从而影响心肌收缩舒张功能，此外，糖尿病导致肌浆网钙离子储存减少，进一步导致细胞内钙超载，从而导致心功能障碍^{［6， 38］}。铜离子在生物体内具有重要的生理功能，包括作为多种酶的辅助因子参与细胞代谢。有研究指出，DCM中过量的晚期糖基化终产物通过扰乱铜稳态促进铜离子积累加剧铜死亡进展^［39］，铜离子螯合剂可以恢复糖尿病大鼠的心脏功能和Ca²⁺稳态^［40］。因此，维持心肌铜离子与钙离子平衡是治疗DCM的策略之一。

槲皮素是一种广泛存在于自然界中的黄酮类化合物，先前研究发现其具有降血糖作用^［28］，可能通过减少氧化应激和保持胰腺β细胞完整性从而改善胰岛素抵抗和增强胰岛素信号传导来发挥作用^［41］。此外，很多研究发现槲皮素可通过其抗氧化和抗纤维化的特性改善心功能^［42］，在心功能障碍中，槲皮素也可以促进钙离子的流入，增强心肌收缩力^［33］，这可能与槲皮素的抗氧化性质和对线粒体功能的保护作用有关，槲皮素能促进内源性能量的生成，改善心肌缺血后线粒体功能从而有效减轻心肌缺氧损伤^［43］。尽管有研究结果显示，在心律失常及心肌缺血再灌注疾病中，槲皮素通过抑制L型钙通道的活性来发挥作用^{［44， 45］}，这种相反的作用可能是因为L型钙通道在心肌细胞的动作电位平台期和收缩性中起着重要作用，在心肌缺血再灌注损伤中，钙超载会导致心律失常，槲皮素通过抑制L型钙通道功能，减少钙离子的流入，从而降低心肌细胞的兴奋性和收缩性，有助于减少心律失常的发生。这种相反作用反映了槲皮素复杂的药理特性和在心血管疾病治疗中的潜在应用价值。有研究表明槲皮素可以调节 15 个铜死亡靶标的表达，并且可以降低FDX1 mRNA的表达^［46］。FDX1是一种含有Fe-S簇的蛋白质，它在细胞内扮演着电子供体的角色，参与多种代谢过程^［47］。敲除FDX1基因后，细胞在铜离子处理后仍能存活，表明FDX1是铜离子诱导细胞死亡的关键调节基因^［12］。本研究深入探讨了槲皮素对糖尿病大鼠心肌的保护作用，特别关注其是否通过调控铜死亡途径影响心肌L型钙电流，为此，我们将恩格列净（Empa）作为阳性对照组，Empa是选择性SGLT2抑制剂，近年来因其在糖尿病心肌病治疗中的潜在心肌保护作用备受关注。多项研究已证实，Empa能够通过利尿和降低血糖水平来减轻心脏负荷并改善心脏功能^{［48， 49］}。与使用Empa的阳性对照组相比，槲皮素不仅能降低糖尿病大鼠的血糖水平，还能减少血清中的铜离子含量，更为重要的是，槲皮素通过下调FDX1蛋白的表达，改善了心肌重构情况。在体外，我们也评估了槲皮素对高糖环境诱导的心肌细胞损伤的保护作用，并探讨其机制是否与铜死亡通路相关，结果表明，槲皮素通过下调FDX1表达和减少心肌细胞损伤部分逆转高糖环境导致的细胞损伤效应，而予以铜死亡诱导剂后，能够抵抗槲皮素对心肌细胞的保护作用，提示其作用机制与铜死亡信号通路的调节相关。

通过膜片钳技术，我们得出与阳性对照组相比，槲皮素有助于恢复心肌细胞的L型钙电流和缩短动作电位时程。L型钙电流的恢复对于维持正常的心脏节律至关重要，而动作电位时程的缩短有助于提高心脏的收缩效率^［50］，这一点与我们测得糖尿病大鼠的心率和心输出量的结果保持一致，其可能通过调节心肌细胞的兴奋-收缩耦联来改善心肌的收缩舒张功能。虽然有研究表明，在糖尿病心肌病中，L型钙通道的活性降低可能并不直接导致动作电位时程的延长^［51］，是因为动作电位时程的改变是一个多因素的结果，包括钠离子、钾离子通道的改变、氧化应激、代谢紊乱等，这些因素共同参与了糖尿病心肌病中心肌细胞电生理特性的改变，本研究中槲皮素能够缩短动作电位时程，可能与心肌细胞内钙离子的稳态和兴奋-收缩耦联机制有关。本研究中槲皮素对动作电位振幅无明显影响，一方面因为动作电位振幅主要与钠离子有关，0期的去极化过程涉及快钠通道的激活，导致钠离子快速内流，使膜电位迅速上升；另一方面也可能与槲皮素浓度有关，在低浓度下，槲皮素可能主要发挥抗氧化和抗炎作用，而在高浓度下，可能会影响离子通道的功能^{［52， 53］}。这些结果表明，槲皮素在糖尿病引起的心肌病变中有着独特而多方面的作用机制。

综上所述，本研究结果表明槲皮素能够减轻糖尿病心肌病大鼠心肌细胞的损伤，降低心肌组织间的胶原沉积，恢复心肌细胞L型钙电流，改善大鼠心脏功能障碍，这可能与抑制铜死亡信号通路有关。这些发现为未来糖尿病心肌病的治疗策略提供了新的治疗靶点。

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