CEACAM6通过调控上皮间质转化抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移

CEACAM6 inhibits proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells by suppressing epithelial-mesenchymal transition

摘要

目的 明确CEACAM6在鼻咽癌中的表达，探索CEACAM6对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响以及潜在的作用机制。 方法 通过GEO数据库分析CEACAM6在鼻咽癌中表达情况。TCGA数据库分析CEACAM6在头颈部癌中表达情况以及与生存预期的关系。免疫组织化学技术检测CEACAM6在鼻咽癌组织中的表达情况。构建CEACAM6过表达细胞模型，分为control组（空载）和Lv-CEACAM6组（过表达）；CEACAM6敲低细胞模型，分为control组（空载）、sh#1组（敲低）和sh#2组（敲低）。通过CCK-8和Edu染色检测CEACAM6对鼻咽癌细胞增殖的影响。伤口愈合和Transwell检测CEACAM6对鼻咽癌细胞侵袭迁移的影响。鬼笔环肽染色检测CEACAM6对鼻咽癌细胞骨架排列的影响。Western blotting检测CEACAM6对鼻咽癌细胞中FN1、ITGA5、ITGB1、N-cad、Vim和E-cad的蛋白表达影响以及FN1过表达对CEACAM6过表达的鼻咽癌细胞中ITGA5和ITGB1蛋白表达的影响。 结果 GEO数据库分析表明CEACAM6在鼻咽癌中低表达，TCGA数据库分析表明CEACAM6在头颈部癌中低表达，CEACAM6低表达与预后不良有关。免疫组织化学技术检测结果显示CEACAM6在鼻咽癌组织中低表达。CCK-8和Edu检测结果显示CEACAM6可抑制鼻咽癌细胞的增殖能力（P<0.05）。伤口愈合和Transwell检测结果显示CEACAM6可抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力（P<0.05）。鬼笔环肽染色结果显示上调CEACAM6表达后肌动蛋白荧光表达降低。Westen blotting检测结果表明上调CEACAM6表达后FN1、ITGA5、ITGB1下调，E-cad上调，N-cad和Vim下调（P<0.05），FN1过表达可缓解CEACAM6对ITGA5和ITGB1表达的抑制作用（P<0.05）。 结论 CEACAM6可能通过调控FN1、ITGA5、ITGB1蛋白表达影响上皮间质转化从而抑制鼻咽癌的侵袭和迁移。

Abstract

Objective To investigate CEACAM6 expression in nasopharyngeal carcinoma (NPC) and its regulatory effects on tumor cell proliferation, migration, and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Methods CEACAM6 expression in NPC was analyzed using GEO datasets and validated by immunohistochemistry in NPC tissues and by Western blotting and RT-qPCR in NPC cell lines (HNE1, C666-1, HK1, 5-8F and CNE2Z) and normal nasopharyngeal epithelial NP69 cells. In the NPC cell lines, the effects of lentivirus-mediated CEACAM6 overexpression and knockdown on cell proliferation, migration, invasion and cytoskeletal structures were evaluated using CCK-8 assay, Edu staining, wound healing assay, Transwell assay, and phalloidin staining. Western blotting was performed to determine the expressions of EMT-related proteins (FN1, ITGA5, ITGB1, E-cadherin, N-cadherin and vimentin) in the NPC cells and the effect of FN1 overexpression on ITGA5 and ITGB1 protein expressions. Results Analysis of the data from the GEO datasets suggested that CEACAM6 was significantly downregulated in NPC, which was associated with poor patient prognosis. Immunohistochemistry also showed low expressions of CEACAM6 in clinical NPC tissues (P<0.05). In NPC cells, CEACAM6 overexpression significantly suppressed cell proliferation, migration and invasion and reduced the fluorescence intensity of actin. CEACAM6 overexpression also resulted in significant downregulation of FN1, ITGA5, ITGB1, N-cadherin and vimentin expressions and upregulation of E-cadherin expression, and FN1 overexpression obviously attenuated the inhibitory effect of CEACAM6 overexpression on ITGA5 and ITGB1 expressions. Conclusion CEACAM6 inhibits NPC cell migration and invasion by inhibiting EMT via regulating FN1, ITGA5 and ITGB1 expressions.

Graphical abstract

关键词

CEACAM6 / 鼻咽癌 / 迁移 / 上皮间质转化

Key words

CEACAM6 / nasopharyngeal carcinoma / migration / epithelial-mesenchymal transition

鼻咽癌（NPC）是鼻咽部恶性肿瘤，在东南亚国家和中国发病率最高^{［1， 2］}。鼻咽癌患者确诊时通常为局部晚期，复发和远处转移是导致鼻咽癌患者死亡的常见原因^［3］。放射治疗是鼻咽癌患者的主要治疗手段，可提高局部晚期鼻咽癌患者的生存率，但仍有30%的患者会出现复发/转移^{［4， 5］}。据统计，中国鼻咽癌患者5年净生存率约47%^［6］。因此，探索与鼻咽癌发展相关的潜在机制对鼻咽癌患者制定新的治疗策略至关重要。

人类癌胚抗原相关细胞粘附分子（CEACAM）家族是一个由12个独立基因编码的蛋白质家族，位于染色体19q13.1-13.2上^［7］。癌胚抗原相关细胞粘附分子6（CEACAM6，CD66c，非特异性交叉反应抗原，NCA，或NCA-50/90）是一种糖基磷脂酰肌醇（GPI）连接的细胞表面蛋白，属于CEACAM家族的免疫球蛋白（Ig）表观基因^［8］。CEACAM蛋白亚家族参与调控细胞间粘附、存活和增殖、肿瘤抑制、侵袭和转移^［9］。研究发现，CEACAM6在喉癌、喉咽癌和口咽癌组织中表达下调，在膀胱癌中CEACAM6可调控smad2/3-基质金属蛋白酶2（MMP2）信号的激活^{［10， 11］}。CEACAM6可通过调控整合素信号通路在肺腺癌中发挥作用^［12］。然而，CEACAM6在鼻咽癌中的作用和潜在机制尚不清楚。

本研究通过GEO数据库和免疫组织化学技术检测分析CEACAM6在鼻咽癌组织中的表达情况。细胞学实验分析CEACAM6对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响以及对FN1、ITGA5、ITGB1和EMT相关生物标志蛋白表达的影响，以期为鼻咽癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

慢病毒载体LV5-NC、LV5-CEACAM6、LV3-NC、LV3-sh#1和LV3-sh#2（上海吉玛）；HiScript® IIQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）试剂盒和AceQ®qPCRSYBRGreenMasterMix试剂盒（诺维赞）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、BeyoClickTMEdu-594细胞增殖检测试剂盒（碧云天）；TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽（索莱宝）；anti-CEACAM6（Affinity，1∶2000）；anti-FN1（1∶10000）、anti-ITGA5（1∶3000）、anti-ITGB1（1∶4000）、anti-E-cadherin（1∶5000）、anti-N-cadherin（1∶20000）、anti-Vimentin（1∶50000）和HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse/Anti-Rabbit IgG（H+L）（1：3000）（武汉山鹰）；β-actin（ABclonal，1∶3000）；引物序列（上海生工）。

1.2 免疫组织化学技术

从我院病理科调取鼻咽癌患者癌组织和癌旁组织，切片3 μm厚度，进行脱蜡、水化、抗原修复、阻断和封闭，anti-CEACAM6（1：200）孵育过夜，酶标山羊抗兔孵育1 h，DAB显色后复染细胞核，最后脱水、透明和封片。倒置显微镜下观察和拍照。本研究通过我院伦理委员会审查（伦理批号：伦科批字［2022］第170号）。

1.3 细胞培养和转染

人永生化正常鼻咽上皮细胞（NP69）和鼻咽癌细胞（HNE1，C666-1，HK1，5-8F，CNE2Z）购自IMMOCELL公司，所有细胞均在细胞培养箱中培养，培养液为RPMI 1640、1%青霉素-链霉素混合物和10%胎牛血清，温度为37 ℃，二氧化碳浓度为5%。构建CEACAM6过表达细胞模型，分为Control组（空载）和Lv-CEACAM6组（过表达）；CEACAM6敲低细胞模型，分为Control组（空载）、sh#1组（敲低）和sh#2组（敲低）。

1.4 实时荧光定量PCR

Trziol提取总RNA，HiScript®IIQRTSuper MixforqPCR（+gDNAwiper）试剂盒反转录RNA为cDNA，AceQ®qPCRSYBRGreenMasterMix试剂盒扩增，设置参数：95 ℃， 10 s；56 ℃， 30 s；72 ℃， 30 s。40个循环。以GADPH为内参，用2^-ΔΔct计算相对定量。引物序列如下：

CEACAM6-F：ACCCACCCACCACTGCCAAG， R：TGCCATCCACTCTTTCGCCTTTG；

GAPDH-F：TGACATCAAGAAGGTGGTGAAG CAG， R：GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG.

1.5 Western blotting

从RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合液中提取总蛋白，用BCA蛋白浓缩试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS-PAGE蛋白取样缓冲液高温变性。用5%脱脂奶粉封膜，一抗［anti-CEACAM6；anti-FN1、anti-ITGA5、anti-ITGB1、anti-E-cadherin、anti-N-cadherin和anti-Vimentin；β-actin］4 ℃孵育过夜，二抗［HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse/Anti-Rabbit IgG（H+L）］孵育2 h，用MKUltraSensitive ECL Luminol（BIOMIKY）显色。用ImageJ进行灰度值分析。

1.6 CCK-8实验

将细胞计数并均匀接种到96孔板中，分别在细胞培养箱中培养24、48、72 h，然后加入CCK-8溶液，在37 ℃培养箱中培养2.5 h后，使用酶标记物检测吸光度值A_{450 nm}。

1.7 Edu细胞增殖实验

细胞计数后接种到6孔板中，然后在细胞培养箱中培养，加入Edu工作液，在细胞培养箱中继续培养2 h，4%多聚甲醛固定，0.3% TritonX-100通透15 min，每孔加入500 μL反应混合物，避光培养30 min，用DAPI染色细胞核15 min，然后在荧光显微镜下拍照。

1.8 伤口愈合实验

将细胞接种到6孔板中培养，当细胞接近长满时，用枪头垂直划伤单层细胞伤口，换上新鲜的无血清培养基，在细胞培养箱中继续培养48 h后取出，在显微镜下拍照，ImageJ计算伤口愈合面积。

1.9 Transwell实验

用无血清培养液重悬细胞，计数后将细胞均匀接种到细胞室中（在侵袭实验中将一层基质凝胶铺在细胞室的上层），在下层细胞室中加入10% FBS完全培养液，在细胞培养箱中培养24 h后取出，用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色15 min，用棉签擦拭上层细胞室的细胞，在显微镜下拍照。

1.10 鬼笔环肽染色

将细胞接种到细胞爬片上，待细胞密度接近50%时终止培养，用4%多聚甲醛固定，用0.5% TritonX-100通透5 min，用TRITC标记的鬼笔环肽工作液避光孵育30 min，用DAPI染色细胞核15 min，用抗荧光淬灭剂封片，在共聚焦显微镜下拍照。

1.11 数据来源和数据分析

鼻咽癌数据（数据集GSE12452）来自GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），设置差异基因筛选标准差异表达倍数的对数绝对值大于1且P<0.05。使用R（4.3.2版）软件绘制差异基因热图和聚类图；通过GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）获得TCGA数据库中CEACAM6在HNSC中的差异表达和总生存分析；通过VENNY（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线绘制Venn图；利用STRING（https：//cn.string-db.org/）和Cytoscape（3.9.1版）绘制蛋白质相互作用（PPI）网络图；通过Wei Sheng Xin（https：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制CEACAM6，FN1和ITGB1基因表达小提琴图和相关性图。

1.12 统计学分析

计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS 26.0进行统计分析，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEACAM6在鼻咽癌组织和细胞中低表达

GEO数据库分析得到差异基因热图，WGCNA分析得到基因聚类树和模块热图（图1A~C）。将GEO-diff和GEO-green模块基因进行Venn分析，共得到107个交叉基因（图1D）。通过在线STRING数据库对这107个基因进行PPI网络构建，发现CEACAM6基因是鼻咽癌的潜在核心基因，在肿瘤中低表达（图1A~E）。TCGA数据库分析表明，CEACAM6在头颈部肿瘤中低表达， CEACAM6低表达与预后不良有关（图1F、G）。免疫组织化学技术检测结果显示CEACAM6在鼻咽癌组织中低表达（图2A）。Western blotting和荧光定量PCR检测结果显示与NP69相比，CEACAM6在鼻咽癌细胞中表达较低（图2B、C，P<0.05，P<0.01）。

2.2 CEACAM6高表达抑制鼻咽癌细胞的增殖

CCK-8检测结果显示CEACAM6表达上调可抑制细胞活力，下调CEACAM6表达可促进细胞活力（图3A，P<0.01）。Edu检测结果显示上调CEACAM6表达可抑制细胞增殖，下调CEACAM6表达可促进细胞增殖（图3B、C，P<0.05，P<0.01）。

2.3 CEACAM6高表达抑制鼻咽癌细胞迁移

伤口愈合实验检测结果显示上调CEACAM6表达细胞伤口愈合能力减弱，下调CEACAM6表达细胞伤口愈合能力增强（图4A、B，P<0.01）。Transwell检测结果表明上调CEACAM6表达可抑制细胞侵袭和迁移能力，下调CEACAM6表达可促进细胞侵袭和迁移能力（图4C~E，P<0.01）。

2.4 CEACAM6可调控FN1/ITGA5/ITGB1表达

GSEA富集分析表明CEACAM6与VEGF通路有关，经Genecard获取VEGF通路相关蛋白，构建PPI蛋白相互作用网络，结果显示CEACAM6的表达与FN1、ITGA5和ITGB1蛋白互作（图5A~C）。GEO数据库分析表明，CEACAM6在鼻咽癌中表达较低，FN1和ITGB1在鼻咽癌中表达较高，CEACAM6与FN1和ITGB1呈负相关（图5D、E）。Western blotting检测结果显示上调CEACAM6表达可抑制FN1、ITGA5和ITGB1表达，FN1过表达可缓解CEACAM6对ITGA5和ITGB1表达的抑制作用；下调CEACAM6表达可促进FN1、ITGA5和ITGB1表达（图5F~H，P<0.05，P<0.01）。

2.5 FN1过表达可逆转CEACAM6对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

CCK-8和Edu检测结果显示FN1过表达可缓解CEACAM6过表达对HNE1细胞增殖的抑制作用（图6A、B，P<0.05，P<0.01）。伤口愈合和Transwell检测结果显示FN1过表达可改善CEACAM6过表达对HNE1细胞侵袭迁移能力的抑制作用（图6C~F，P<0.01）。

2.6 CEACAM6通过调控EMT通路抑制迁移

鬼笔环肽染色检测结果显示上调CEACAM6表达后细胞质中的肌动蛋白荧光减弱；下调CEACAM6表达后细胞质中肌动蛋白的荧光增强（图7A）。Western blotting检测结果表明上调CEACAM6表达后E-cad表达上调，N-cad和Vim表达下调；下调CEACAM6表达后E-cad表达下调，N-cad和Vim表达上调（图7B、C，P<0.05，P<0.01）。

3 讨论

本研究明确了CEACAM6在鼻咽癌中的表达情况，并进一步分析CEACAM6对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用以及潜在的作用机制。研究结果显示CEACAM6在鼻咽癌组织和细胞中均低表达；上调CEACAM6表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移；CEACAM6可能是通过调控EMT信号抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力。

既往未见CEACAM6参与鼻咽癌进展报道，但有研究表明CEACAM6在喉癌、喉咽癌和口咽癌等肿瘤中表达下调，并于癌症进展有关^{［10， 13， 14］}。这与本研究结论相似。本研究通过GEO数据库分析发现CEACAM6在鼻咽癌中表达下调。TCGA数据库分析发现CEACAM6在HNSC中表达下调，并与癌症患者预后有关。进一步通过免疫组织化学技术检测证实了CEACAM6在鼻咽癌组织中低表达，Western blotting和荧光定量PCR检测结果显示CEACAM6在鼻咽癌细胞中蛋白水平和mRNA水平均较低。既往研究表明CEACAM6参与肿瘤细胞的增殖和迁移^{［14， 15］}，这与本研究结果一致。本研究通过构建CEACAM6表达上调或下调细胞株进行功能学研究，结果发现下调CEACAM6表达可促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移；上调CEACAM6表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移。这些结果说明了CEACAM6在鼻咽癌中低表达并参与鼻咽癌细胞的增殖和侵袭迁移，但其对鼻咽癌的功能机制需要进一步研究。

本研究通过GSEA富集分析发现CEACAM6与VEGF信号通路相关，进一步通过Genecard在线分析获取VEGF信号通路相关蛋白，利用PPI在线分析CEACAM6与VEGF信号关键蛋白的互作关系。结果显示，CEACAM6与关键蛋白（FN1/ITGA5/ITGB1）相互作用。既往研究表明，纤连蛋白（FN1）与肿瘤细胞丝状伪足的形成和细胞运动有关^［16］，整合素α‑5/β-1（ITGA5/ITGB1）是纤连蛋白（FN1）的受体，也参与肿瘤进展，包括肿瘤增殖、侵袭和转移^［17-19］。这与本研究结果一致。本研究通过GEO数据库分析发现，CEACAM6在鼻咽癌中表达较低，FN1和ITGB1在鼻咽癌中表达较高，CEACAM6与FN1和ITGB1呈负相关。Western blotting检测结果表明下调CEACAM6表达可促进FN1/ITGA5/ITGB1的表达；上调CEACAM6表达可抑制FN1/ITGA5/ITGB1的表达，FN1过表达可挽救CEACAM6过表达对ITGA5和ITGB1蛋白表达水平的抑制作用。进一步研究发现FN1过表达可逆转CEACAM6过表达对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。这些结果表明CEACAM6可能通过调控FN1/ITGA5/ITGB1轴来影响鼻咽癌的发展。

上皮间充质转化（EMT）是极化的上皮细胞向间充质细胞转化的过程^{［20， 21］}。这一过程是肿瘤异质性的关键驱动因素，与肿瘤的发生、发展、转移以及对化疗或免疫疗法的耐药性有关^［22］。癌细胞中的EMT涉及细胞骨架的大规模重组、上皮完整性的丧失以及间质特征的获得，如间质型细胞迁移，在癌症中，EMT会不同程度地干扰各种信号通路，导致基因表达程序发生重大改变，影响大多数癌症特征，如对增殖和死亡诱导信号的反应 ^{［20， 23］}。癌细胞系中EMT标记物的表达水平可表明EMT的程度，包括细胞粘附蛋白（如E-cad）表达的下调和间质标记物（如N-cad、Vim）表达的增强，其中，钙粘蛋白是一类跨膜蛋白，与连接蛋白一起参与细胞粘附，波形蛋白是间充质干细胞细胞骨架的主要成分^［24-26］。这与本研究结果一致。本研究通过鬼笔环肽染色检测发现上调CEACAM6表达后，细胞质中肌动蛋白荧光减弱；下调CEACAM6表达后，细胞质中肌动蛋白荧光增强，肌丝在细胞质中无规则排列。表明CEACAM6可影响鼻咽癌细胞的细胞骨架重组。Western blotting检测表明上调CEACAM6后E-cad的表达水平升高，N-cad和Vim的表达水平降低；下调CEACAM6表达后，E-cad表达水平降低，N-cad和Vim的表达水平升高。这些结果表明CEACAM6上调可抑制鼻咽癌细胞的EMT转化。既往研究报道，FN1参与调控许多癌症EMT，主要表现为间充质标志物波形蛋白（Vim）的表达增加，而上皮标志物E-cad的表达减少^{［27， 28］}。与纤连蛋白结合的整合素α-5/β-1也可直接或间接参与EMT进程^［17］。研究表明ITGA5可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和EMT^{［18， 29］}。ITGB1的表达与EMT特征相关，包括介导EMT的转录因子SNAIL/SNAI1，阻断ITGB1可下调间质基因并上调E-cad蛋白的表达^{［19， 30， 31］}。这些表明，CEACAM6可能通过调控FN1/ITGA5/ITGB1影响鼻咽癌细胞的EMT进程，为揭示鼻咽癌进展潜在机制和未来靶向治疗提供了新思路。本研究的局限性：研究仅阐明了CEACAM6对鼻咽癌细胞的增殖和侵袭迁移能力的影响，CEACAM6对鼻咽癌的其他生物学功能可能被忽视；本研究只分析了CEACMA6对鼻咽癌细胞EMT进程的影响，不能排除CEACAM6对其他潜在信号通路的调控作用。

综上所述，本研究表明CEACAM6在鼻咽癌中低表达，并影响鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。CEACAM6可能通过调控FN1/ITGA5/ITGB1来影响EMT进程，从而影响鼻咽癌细胞的生物学功能。

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基金资助

安徽省高等学校科学研究项目(2022AH051481)

蚌埠医学院自然科学重点项目(2021byzd048)

安徽省自然科学基金青年项目(2008085QH404)

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