源自蛇毒的蛋白C激活剂通过调控HIF-1α抑制BNIP3活性氧生成保护人脐静脉内皮细胞免受缺氧-复氧损伤

Protein C activator derived from snake venom protects human umbilical vein endothelial cells against hypoxia-reoxygenation injury by suppressing ROS via upregulating HIF-1α and BNIP3

摘要

目的 探究蛇毒天然组分蛋白C激活剂（PCA）抑制ROS生成发挥抗血管内皮细胞损伤作用及机制。 方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞系（HUVECs），建立内皮细胞氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）模型，检测PCA和2-ME2（HIF1α抑制剂）单独处理及合用对细胞ROS生成和HIF-1α、BNIP3、Beclin-1 蛋白表达的影响。OGD/R细胞模型转染BNIP3特异性siRNA，分为空载组、干扰组、PCA 组、干扰+PCA 组，检测各组HIF1α、BNIP3、Beclin-1 蛋白表达量及ROS含量。 结果 抑制HIF1α表达研究结果表明，PCA处理后蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1表达水平增高（P<0.05）而ROS含量明显降低（P<0.05），2-ME2+PCA组与PCA组相比，蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1表达水平降低（P<0.05），而ROS含量增高（P<0.05），与之相反，PCA+DMOG组与PCA组相比，蛋白HIF-1α、BNIP3、Beclin-1表达水平增高（P<0.05），而ROS含量降低（P<0.05）。BNIP3干扰研究结果显示，干扰组+PCA组与干扰组相比，蛋白BNIP3表达增高（P<0.05），HIF-1α没有变化（P>0.05），ROS含量降低（P<0.05）；干扰+PCA 组与 PCA组相比蛋白 BNIP3、Beclin-1 蛋白表达水平降低（P<0.05），而ROS含量都增高（P<0.05）。 结论 蛇毒PCA通过调控HIF-1α上调BNIP3抑制OGD/R诱导HUVECs 产生的ROS，发挥抗损伤作用。

Abstract

Objective To investigate the antioxidative mechanism of snake venom-derived protein C activator (PCA) in mitigating vascular endothelial cell injury. Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were cultured in DMEM containing 1.0 g/L D-glucose and exposed to hypoxia (1% O₂) for 6 h followed by reoxygenation for 2 h to establish a cell model of oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R). The cell model was treated with 2 μg/mL PCA alone or in combination with 2-ME2 (a HIF-1α inhibitor) or DMOG (a HIF-1α stabilizer), and intracellular production of reactive oxygen species (ROS) and protein expression levels of HIF-1α, BNIP3, and Beclin-1 were detected using DCFH-DA fluorescence probe, flow cytometry, and Western blotting. The OGD/R cell model was transfected with a BNIP3-specific siRNA or a scrambled control sequence prior to PCA treatment, and the changes in protein expressions of HIF-1α, BNIP3 and Beclin-1 and intracellular ROS production were examined. Results In the OGD/R cell model, PCA treatment significantly upregulated HIF-1α, BNIP3 and Beclin-1 expressions and reduced ROS production. The effects of PCA were obviously attenuated by co-treatment with 2-ME2 but augmented by treatment with DMOG (a HIF-1α stabilizer). In the cell model with BNIP3 knockdown, PCA treatment increased BNIP3 expression and decreased ROS production without causing significant changes in HIF-1α expression. Compared with HUVECs with PCA treatment only, the cells with BNIP3 knockdown prior to PCA treatment showed significantly lower Beclin-1 expression and higher ROS levels. Conclusion Snake venom PCA alleviates OGD/R-induced endothelial cell injury by upregulating HIF-1α/BNIP3 signaling to suppress ROS generation, suggesting its potential as a therapeutic agent against oxidative stress in vascular pathologies.

Graphical abstract

关键词

内皮细胞氧糖剥夺/再复氧 / 蛋白C激活剂 / 线粒体自噬 / HIF-1α

Key words

oxygen-glucose deprivation/reoxygenation / protein C activator / mitochondrial autophagy / hypoxia-inducible factor-1α

治疗缺血性脑卒中的主要方式是通过溶栓恢复缺血组织供血，但缺血组织血流复灌会引起脑缺血/再灌注损伤（IRI）^{［1， 2］}。有研究表明IRI的发病与ROS生成、炎症反应、细胞钙离子超载、自噬及细胞死亡等有关^［3］，但其具体机制尚未研究清楚。因此通过减少细胞ROS生成可能是治疗IRI的潜在方式。ROS生成的发生与细胞供养状态有关，在正常供氧情况下，线粒体进行氧化磷酸化产生能量不影响机体的活性氧（ROS）的生成^［4］。在缺氧条件下，细胞进行无氧呼吸，ATP产量降低，离子交换通道失效进而导致细胞酶活的降低^［5］，再复氧时，由于受损线粒体无法恢复完整的氧化磷酸化过程，产生氧自由基，从而引起ROS生成^［6］。ROS生成会导致机体内皮功能障碍、DNA损伤及局部炎症反应等不良反应^{［7， 8］}，导致细胞结构损伤引起细胞死亡^［9］。因此深入探究缺血再灌注中ROS的调控机制有很重要的临床价值。

蛇毒天然组分蛋白C激活物（PCA）是从皖南蝮蛇中分离出的一种能够激活蛋白酶C的活性多肽，具有有效的抗凝、抗炎和抗氧化作用^［10］。本实验室前期研究发现PCA对急性心肌梗死、心肌缺血再灌注^{［11， 12］}、脑梗死^{［13， 14］}等都具有保护作用，但其对血管内皮细胞氧化应激损伤的作用和机制尚未有研究报道。本研究希望从PCA改善氧化应激的角度探究其生物学效应，为以后PCA应用于临床治疗心血管疾病打下基础。

研究表明，缺氧诱导因子（HIF-1）在细胞适应缺氧过程中发挥作用^［15］。HIF-1是异二聚体蛋白，由组成型表达的亚基HIF-1β和可激活亚基HIF-1α组成^［16］。在供应氧气充足下，HIF-1α亚基脯氨酸残基被依赖于氧的脯氨酰-4-羟化酶（PHD）羟基化，从而使HIF-1α结合von Hippel-Lindau蛋白（pVHL），并靶向E3泛素-连接酶^［12］。此外，抑制因子（FIH）能够羟基化天冬酰胺残基，从而防止HIF-1α结合蛋白P300/CBP。在缺氧条件下，PHD和FIH活性受到抑制，HIF-1α发生聚集并进行核转运进入细胞核与HIF-1β亚基发生二聚化^［17］，HIF-1α可增强细胞糖酵解^{［18， 19］}，增强细胞有氧代谢的能力。并促进细胞的适应性反应，抑制ROS生成减轻损伤^［20］，但其具体的分子机制尚不明确。因此，本研究采用HUVEC人脐静脉血管内皮细胞氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）模型，探究PCA对HIF-1α及BNIP3表达及ROS水平的影响，探讨PCA抑制ROS生成的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人脐静脉血管内皮细胞系（HUVECs）（上海酶研生物科技有限公司），蛇毒蛋白C激活剂（PCA）（皖南医学院蛇毒研究所），FPS、DMEM培养基（Gibco），HIF‑1α 抑制剂2-ME2（MCE）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将人脐静脉内皮细胞放置于37 ℃、饱和湿度、体积分数5% CO₂培养箱内培养，细胞培养液为含体积分数10%胎牛血清（Clark）、100 U/mL链霉素（Gibco）和100 U/mL青霉素（Gibco）的DMEM，培养液的更换频率为2 d/次，等待细胞的生长密度至80%时进行细胞传代。传代方法如下：首先将传代所需试剂提前预热，弃去培养瓶内旧的培养基，并用PBS（Beyotime）润洗细胞15~20 s后，吸弃PBS，吸取2 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53 mmol/L EDTA）（Beyotime）于培养瓶中，将其置于37 ℃培养箱中消化，显微镜下观察，若细胞90%以上脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶，然后吸取两倍体积的完全培养基（含体积分数10%胎牛血清的DMEM）终止消化。吹打细胞至分散后转移至离心管，1000 r/min离心5 min，根据密度以1∶3或1∶4的比例接种于新的培养瓶。

1.2.2 OGD/R 细胞模型构建

将细胞种进6/96孔板内，细胞密度长到80%左右之后随机分成组对照组（Control组）和实验组。对照组细胞培养使用高糖培养基（含4.5 g/L D-Glucose）（Gibco）培养并且不做其他处理，实验组细胞培养使用低糖培养基（含1.0 g/L D-Glucose）（Gibco），将实验组细胞放到简易密封盒里，并向其中充入 94% N₂、5%CO₂、1% O₂混合气体，使细胞处于缺氧环境，缺氧结束后，换成高糖培养基，置培养箱中培养2 h。

1.2.3 PCA 浓度梯度配制

称取1 mg的PCA晶体，拿到超净台无菌操作，先加入1 mL的PBS完全溶解PCA，配制成1 mg/mL的PCA母液，再用0.22 μm针头滤过器过滤除菌后，放置-20 ℃ 冰箱保存，用时取出母液梯度稀释为1、1.25、1.5、2.0、2.5、5、10、20、40 μg/mL。根据实验需求分为：Control 组和PCA 组。

1.2.4 细胞蛋白提取

将6孔板每孔洗净后加入100 μL 裂解液（PMSF：RIPA=1∶99）（Beyotime），冰上裂解20 min后将细胞刮下转移到预冷离心管中再进行破碎（45 Hz 60 s）。 破碎后离心 25 min（4 ℃ 12 000 r/min），用移液枪吸取离心后的上清至于新离心管中，再加入1/4上清体积的5×loading buffer（Beyotime），100 ℃ 煮沸 10 min，-80 ℃ 冰箱保存。

1.2.5 Western blotting

配置10%浓度分离胶（Beyotime），5%浓度浓缩胶（Beyotime），凝固后点样 2.5 μL，80 V样品跑完浓缩胶后，继续以120 V电压进行电泳。电泳结束后，以三明治的形式组装转膜结构，275 mA，90 min转膜，转膜完毕后将膜取出用TBST清洗后用脱脂牛奶封闭15 min，室温孵育一抗（Bioss）（1∶1000）4 h后TBST清洗，再二抗（Beyotime）（1∶10 000）孵育1 h，孵育结束后清洗曝光。

1.2.6 HIF-1α抑制剂干预和激动剂处理及分组

在细胞中加入培养基（不含血清和抗生素）再分别加入2-ME2 稀释液和DMOG（APExBIO）稀释液，轻轻摇晃细胞培养板，使得细胞与培养基接触均匀，然后放到培养箱培养12 h，时间结束后，替换成完全培养基，继续孵育24 h。根据实验要求分为Control 组、模型组（OGD/R）、PCA组（OGD/R （6 h/2 h）+2 μg/mL PCA）、抑制剂组（OGD/R （6 h/2 h）+2-ME2）、抑制剂+PCA组（OGD/R （6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA）激动剂组（OGD/R （6 h/2 h）+2 μg/mL PCA+DMOG）。

1.2.7 BNIP3-siRNA 细胞转染与分组

采用上海吉玛基因有限公司合成的siRNA核苷酸，序列如表1，在细胞中加入培养基（不含血清和抗生素）和转染复合物，轻轻摇晃细胞培养板，使得细胞与培养基接触均匀，然后放到培养箱培养12 h，时间结束后，替换成完全培养基，继续孵育48 h。根据实验要求分为模型组［OGD/R（6 h/2 h）+NC］、干扰组［OGD/R （6 h/2 h）+BNIP3 siRNA］、PCA组［OGD/R （6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA］、BNIP3-siRNA+PCA组［OGD/R （6 h/2 h）+BNIP3 siRNA+ 2 μg/mL PCA］。

1.2.8 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差表示。各样本均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同缺氧复氧时间对细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，在复氧时间相同时，随着缺氧时间逐渐增长，A值逐渐降低，细胞增殖能力逐渐下降（图1）。在缺氧3 h 时A值开始下降，细胞增殖能力开始下降（P<0.05），缺氧6 h时A值下降明显，细胞增殖能力下降明显，而缺氧9 h与12 h时细胞增殖能力大幅下降。所以我们选择了6 h/2 h作为细胞的后续研究。

2.2 不同PCA浓度对血管内皮细胞的影响

CCK-8检测结果显示，随着PCA浓度的增加，血管内皮细胞增殖能力降低，A_{450 nm}值逐渐减小。4 μg/mL PCA组A_{450 nm}值与对照组相比A_{450 nm}值减小，HUVECs增殖能力下降明显（P<0.05），PCA 最适安全浓度为2 μg/mL。因此选择 2 μg/mL PCA浓度进行后续实验（图2）

2.3 PCA、2-ME2和DMOG处理后各组细胞ROS生成情况

OGD/R（6 h/2 h）组与control组比较产生的 ROS 明显增多（P<0.01），而 OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA 组与 OGD/R（6 h/2 h）组相比产生 ROS降低（P<0.05）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA 相比ROS明显增多（P<0.01，图3D/F），而OGD/R（6 h/2 h） +2 μg/mL PCA+DMOG组与OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA 相比ROS降低（P<0.05，图3D/F）。

2.4 HIF1α抑制及激动剂处理后各组HIF1α、BNIP3和 Beclin-1 蛋白表达情况

OGD/R（6 h/2 h）组和control组比较HIF1α、BNIP3和Beclin-1蛋白表达都增高（P<0.05，图4A~D）；OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）组相比HIF1α、BNIP3 和Beclin-1蛋白表达都增高明显（P<0.05，图4A~D）；而OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2组与 OGD/R（6 h/2 h）组相比HIF1α、BNIP3和Beclin-1蛋白表达都降低（P<0.05，图4A~D）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2组相比 HIF1α、BNIP3和Beclin-1 蛋白表达都降低（P<0.05，图4）；OGD/R（6 h/2 h）+2-ME2+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA相比 HIF1α、BNIP3和 Beclin-1蛋白表达都降低（P<0.05，图4），而OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA+DMOG组与OGD/R（6 h/2 h）+2 μg/mL PCA相比HIF1α、BNIP3 和 Beclin-1 蛋白表达都增高（P<0.05，图4E~H）。

2.5 BNIP3抑制后mRNA表达水平以及各组活性氧染色情况

OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA组与OGD/R+NC组相比BNIP3蛋白和mRNA表达水平明显降低（P<0.001，图5）。OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA组与 OGD/R+NC组比较ROS明显增多（P<0.05）。OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA组与OGD/R+NC组相比 ROS含量降低（P<0.05），OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mL PCA 组与 OGD/R（6 h/2 h））+BNIP3-siRNA组相比ROS降低，差异具有统计学意义（P<0.05），而与OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mLPCA 组相比ROS含量增多（P<0.05）。

Fig.5 mRNA expression and ROS staining in each group after BNIP3 inhibition. A: BINP3 mRNA expression level. B, C: Cellular ROS level changes (n=3). ***P<0.001 vs NC group; *P<0.05 vs OGD/R(6 h/2 h)+NC group, ^#P<0.05 vs OGD/R(6 h/2 h)+BNIP3-siRNA group, ^&P<0.05 vs OGD/R(6 h/2 h)+BNIP3-siRNA group.

2.6 各组 HIF1α、BNIP3 和 Beclin-1 蛋白表达情况

PCR和Western blotting结果显示（图6A~C）：OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mLPCA组与OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA组，比较BNIP3、Beclin-1蛋白表达水平增加（P<0.05），而HIF1α蛋白表达水平差异不具有统计学意义（P>0.05，图6A~D）；OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）+NC比较 HIF1α、BNIP3和Beclin-1蛋白表达都增高（P<0.05，图6A~D）；而OGD/R（6 h/2 h）+BNIP3-siRNA+2 μg/mL PCA组与OGD/R（6 h/2 h）+NC+2 μg/mL PCA组相比BNIP3和 Beclin-1蛋白表达都降低（P<0.05）。

3 讨论

缺血再灌注发生时，ROS大量生成^［21］，引发脂质过氧化与蛋白质氧化^［22］，造成血管内皮细胞凋亡与坏死，使微血管损伤，造成微循环障碍^{［23， 24］}，这对缺血再灌注的发展与患者的预后有重要影响所以寻找改善微循环氧化应激障碍具有重要的临床意义。PCA是蛇的毒液中分离出来的一种成分，有抗炎、促进细胞存活和调节内皮功能等多方面的作用^［25］，但PCA是否有抗氧化的作用和其具体机制鲜有报道，深入挖掘PCA的生物活性对实现天然蛇毒组分临床转化提供了很好的基础实验支持。随着中国心脑血管发病率的逐年增高，PCA的抗氧化效应具有很好的应用前景，它可以有效减轻心脑血管疾病的损伤，弥补蛇毒药物在这一方面的空缺。最新研究表明，HIF1-α在调控氧化应激方面具有重要的作用，在缺血再灌注中可以与其他转录因子结合，调控一系列基因的表达，发挥抗氧化应激损伤的作用。这些基因包括那些与抗氧化反应相关的酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和催化酶（Catalase），通过诱导抗氧化酶的表达，增强细胞抵抗氧化应激的能力，清除体内过量的活性氧，保护细胞免受氧化损伤^［26-30］。由此本课题组提出猜想，PCA抑制ROS生成是否与HIF-1α相关。

为了验证前期猜想，我们构建了内皮细胞OGD/R（6 h/2 h）模型，筛选了PCA的最适安全浓度2 μg/mL，此浓度不会造成内皮细胞的损伤，用PCA治疗OGD/R时发现，PCA可抑制ROS的生成；为了验证PCA抑制ROS的生成是否与HIF-1α相关，我们使用了HIF-1α抑制剂2-ME2和激动剂DMOG处理，用2-ME2处理后，HIF-1α的表达被抑制，PCA的抑制ROS生成的作用显著降低，与之相反，DMOG处理后，HIF-1α的表达被促进，这些结果提示PCA可能通过调控HIF-1α抑制ROS生成从而减轻损伤。有研究表明，HIF-1是一种转录因子，在缺氧时被激活，在抗氧化应激中通过诱导抗氧化酶的表达、调节谷胱甘肽代谢、抑制促氧化因子、等多种机制帮助细胞抵御氧化损伤^［31］。这与我们的研究结果一致。同时，在内皮细胞OGD/R（6h/2h）中发现HIF-1α可增强BNIP3的表达，为了进一步验证PCA是否可以通过HIF-1α调控BNIP3从而抑制ROS生成，我们敲低了BNIP3，发现BNIP3敲低后HIF-1α的表达没有变化，而在HIF-1α抑制时BNIP3表达降低，这些结果提示PCA可通过调控HIF-1α的水平，上调BNIP3的表达从而抑制ROS的生成。有研究表明在缺血再灌注发生时，BNIP3可诱导自噬清除损伤的细胞器与蛋白质，减轻损伤^［32］，在缺氧或其他应激条件下，BNIP3通过调节Beclin1的活性，促进自噬过程，抗氧化应激损伤^［33］。此外，在内皮细胞OGD/R（6 h/2 h）中发现，PCA可以上调Beclin1表达水平，抑制HIF-1α和BNIP3的表达后Beclin1的表达水平也受到抑制，由此我们认为PCA抑制ROS生成可能与自噬有关，PCA通过同时抑制ROS生成和调控自噬，提供了一种多层次的保护机制。这种双重作用机制在传统的抗氧化剂和自噬调节剂中并不常见，显示了PCA在细胞保护方面的独特性。PCA与自噬之间的相互关系不仅有助于理解细胞如何应对氧化应激和损伤，还为相关疾病的治疗提供了新的研究方向和临床应用潜力，在后续研究中我们会进一步探究。通过以上实验，我们认为，PCA能减轻OGD/R损伤，进而改善微循环障碍，对减轻临床上缺血再灌注损伤有指导意义。

综上所述，本研究探究了PCA与氧化应激相关蛋白因子的关系，通过PCA处理及相关因子的抑制或激动处理揭示了PCA具有抗氧化应激的作用，并发现PCA的潜在机制可能与提高HIF-1α表达水平，促进BNIP3、Beclin1释放从而抑制ROS生成，减轻OGD/R损伤。

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基金资助

安徽省教育厅重大研究项目(KJ2020ZD55)

安徽省重点实验室校级开放课题(LAB202208)

安徽省大学生创新创业训练计划(S202310368059┫皖南医学院2023年度校中青年科研基金┣WK2023ZQNZ01)

安徽省大学生创新创业训练计划(WK2023ZQNZ17)

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