石墨烯发热膜热疗改善小鼠冻伤的作用及机制

Protective effect of graphene heating film far-infrared hyperthermia against frostbite in mice

摘要

目的 研究石墨烯发热膜热疗对不同冻伤模型小鼠的防护作用，以及对微循环和凝血功能的影响。 方法 远红外干预实验：FIR热疗7 d，4 h/d，10只雄性ICR小鼠随机分为石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组（n=5），干预结束后，红外成像检测小鼠体表温度。冷暴露动物模型建立实验：76只雄性C57BL/6J小鼠随机分为2个实验分组，每个实验组分为对照组（n=8）、模型组（n=10）、石墨烯-远红外（FIR）组（n=10）、碳纤维-FIR组（n=10）。FIR热疗干预7 d，4 h/d。采用急性寒冷暴露（4 ℃，4 h）和间歇性寒冷暴露（4 ℃，4 h/d，3 d），制备急性冷暴露和间歇性冷暴露小鼠模型，并进行肛温检测。液氮法制备冻伤模型及评价：24只雄性ICR小鼠随机分为模型组、石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组（n=8）。采用液氮冷冻法直接冻伤皮肤，制备冻伤模型。造模前FIR热疗干预7 d，4 h/d，造模后第3、6天对冻伤区域表观指标进行评分。角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓模型建立及评价：40只雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组、石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组、哌唑嗪阳性药组（n=8）。腹腔注射角叉菜胶（2.5 mg/kg）进行尾部血栓模型的制备。造模前FIR热疗干预7 d，4 h/d。造模24 h后测量尾部血栓长度，通过HE检测病理变化，取血检测各组小鼠血栓因子：6-keto-PGF1α、TXB₂、t-PA，以及炎症因子：IL-6、IL-1β、TNF-α的变化。 结果 冷暴露实验结果显示，与模型组相比，石墨烯-FIR组小鼠肛温升高。液氮冻伤实验结果表明，石墨烯-FIR热疗能够降低小鼠冻伤区域表观评分（P<0.01），改善冻伤程度，且效果优于碳纤维-FIR组。角叉菜胶诱导血栓实验结果显示，与模型组比较，石墨烯-FIR组黑尾长度缩短（P<0.05），血栓面积减少，尾部血栓处血流灌注量升高（P<0.01）；血栓因子TXB₂和炎症因子TNF-α、IL-6水平下降（P<0.01），6-keto-PGF1α和t-PA水平升高（P<0.05）。 结论 石墨烯发热膜热疗通过促进血液微循环，降低炎症发生，改善凝血功能障碍来改善不同程度冻伤引起的组织损伤。

Abstract

Objective To investigate the protective effects of graphene heating film far-infrared (FIR) hyperthermia therapy against frostbite in mice and its impacts on microcirculation and coagulation function. Methods Seventy-six C57BL/6J mice were randomized into control, model, graphene-FIR, and carbon fiber-FIR groups. After 7-day FIR intervention (4 h/day), the mice were subjected to acute (4 ℃, 4 h) and intermittent (4 ℃, 4 h/day for 3 days) cold exposure and the changes in rectal temperature were monitored. In liquid nitrogen frostbite experiment, 24 ICR mice were divided into model, graphene-FIR, and carbon fiber-FIR groups, and after a 7-day FIR pretreatment (4 h/day), the liquid nitrogen frostbite models were established and apparent scores of the wounds were assessed on days 3 and 6 after modeling. In carrageenan-induced thrombosis experiment, 40 ICR mice were allocated to control, model, graphene-FIR, carbon fiber-FIR, and prazosin groups to test the effect of a 7-day FIR intervention on thrombosis induced by intraperitoneal carrageenan injection (2.5 mg/kg) by measuring thrombus length, blood perfusion, and serum biomarkers (6-keto-PGF1α, TXB2, t-PA, IL-6, IL-1β, TNF‑α) 24 h after the injection. Results The mice in graphene-FIR group showed significantly elevated rectal temperature in cold exposure tests. In mice with liquid nitrogen-induced frostbite, graphene-FIR treatment significantly reduced the wound scores and reduced frostbite area, producing better effects than carbon fiber. In mice with carrageenan-induced thrombosis, graphene-FIR treatment significantly decreased tail thrombosis length and thrombosis area, increased blood perfusion, lowered serum levels of TXB2, TNF-α and IL-6, and increased the levels of 6-keto-PGF1α and t-PA. Conclusion Graphene heating film FIR therapy can alleviate frostbite injury in mice by improving microcirculation, suppressing thrombosis and inflammatory responses, and reducing coagulation dysfunction.

Graphical abstract

关键词

石墨烯发热膜 / 远红外 / 冻伤 / 微循环 / 炎症

Key words

graphene heating film / far-infrared therapy / frostbite / microcirculation / inflammation

我国寒冷区域面积广泛，冬季从事户外作业、体育运动的人员以及从事特殊环境军事活动的官兵其肢体主干和肢体末端容易受到寒冷气候的影响，容易造成机体冻伤^［1］。冻伤可以分为全身性冻伤和局部冻伤，临床上以后者居多。局部冻伤的发生多见于人体的手、足、耳朵、面部等暴露于外界的部位，病程长，恢复慢且易于反复发作、致残率高，其病理特点是局部冻伤部位冻融造成的细胞坏死和局部微循环障碍。成年人可以通过收缩外周血管以及机体产热来维持体温恒定，用来对抗寒冷条件下的体温下降并延长生存时间^［2］。面对极端寒冷环境，人体会受到冷暴露造成的各种器官伤害：肢体冻伤、认知功能受损、血压升高及心血管风险增加、休克等^［3-5］。目前关于对寒冷暴露造成的机体损伤的预防保护手段有药物和物理疗法等。防冻药物主要包括中药类：灵芝三萜纳米凝胶、七叶皂苷钠、红花挥发油等，西药类：血管扩张剂、溶栓药物、硝酸甘油软膏、醋酸氟轻松软膏、磺胺嘧啶银霜等，但药物使用具有一定的局限性^［6］。改善微循环和凝血系统功能以及提高肢体末端皮肤温度应是目前冻伤药物的研究方向。

采用物理手段防御或治疗冻伤具有独特的优势。物理预防主要有加热毯，加热手套及鞋具，御寒服装等，因其便捷、舒适、升温迅速，是特殊环境作业人员及从事军事活动官兵的首要御寒手段^［7］。远红外射线具有很好的理疗功效，远红外（FIR）疗法不会产生传统热疗法的副作用，如感染或烧伤，因此被广泛用于机体健康维护与疾病治疗。医学领域通常将8~14 µm的光波定义为远红外线，它具有很强的辐射性和渗透性，远红外线并非透过温度达到其功效，“纯度”越高的远红外线，更有利于将能量传递到组织，激发分子振动能级，改善机体代谢。有研究报道，全身远红外线治疗具有抗缺血、抗炎、改善认知、改善局部血流微循环等作用^［8］。新型纳米材料石墨烯具有高效的电热转换效率和优异的光学特性，基于石墨烯材料制成的发热膜具有超高的FIR发射率，当施加偏置电压时，很大一部分电子能量可以转化为红外辐射，且辐射波长峰值约8 μm，能够与人体的红外频谱图几乎重合，形成同频共振，加速新陈代谢和血液流动，发挥较好的治疗效果^［9］。

目前关于石墨烯-FIR治疗冻伤的机制还未报道，主要集中在治疗原发性高血压、肿瘤、肥胖、神经系统、运动疲劳等方面^［7-12］。本课题组前期研究发现，石墨烯-FIR热疗能够调节肠道通透性和炎症反应，并通过激活AMPK信号通路改善了血流灌注量及体表温度^{［10， 11］}。这充分表明，石墨烯-FIR不同于一般热疗，它不仅具有热效应，而且其非热效应可能对机体带来更大的益处。冻伤本身是一种由极寒气温引发的机体局部血液循环受阻，进而形成血栓并造成细胞坏死性病变，而热疗一直是抵抗寒冷侵袭人体的首选方法。石墨烯-FIR热疗的独特生物学效应可能是对抗冻伤的一种有效防御及治疗手段。因此，我们提出假设，石墨烯-FIR热疗能够通过提高机体温度及血液循环，从而改善组织冻伤程度。本研究中，我们通过建立不同程度的冻伤动物模型，深入探究石墨烯-FIR热疗对机体冻伤及体温下降的防护作用，并进一步考察石墨烯-FIR热疗对机体微循环和凝血功能的影响。通过本研究，为临床预防及治疗冻伤提供新的干预策略，也为将来开发新型石墨烯防寒、防冻产品奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 药物与器材

哌唑嗪（Pra，TCI）；L-角叉菜胶（Sigma）；小鼠6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）试剂盒、小鼠血栓素B2（TXB₂）试剂盒、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）试剂盒（南京建成）；小鼠TNF-α试剂盒、小鼠IL-1β试剂盒、小鼠IL-6试剂盒（上海江莱生物）。

RFLSI ZW激光散斑血流成像系统（RWD）；UTi160T红外成像仪（中国优利德科技股份有限公司）；Victor3型全自动酶标仪（Molecular DeviceS）；5424R冷冻式高速离心机（eppendorf）；RXZ-500D智能人工气候箱（宁波江南仪器制造厂）；ThermoStar体温维持仪（RWD）。

1.2 动物及实验分组

C57BL/6J小鼠，雄性，SPF级，18~20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2019-0010］。ICR小鼠，雄性，18~22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2019-0010］。饲养于军事医学研究院行为学实验动物中心。饲养环境相对湿度40%~70%、环境温度21~25 ℃，明暗周期为12 h/12 h循环，可随意获取纯净水和饲料。动物实验遵守《实验动物的护理和使用指南》的指导原则，实验均获得军事医学研究院动物福利伦理委员会批准（伦理批号：IACUC-DWZX-2023-P561）。动物适应性饲养3 d后开始实验。实验一：远红外干预作用评价，10只雄性ICR小鼠随机分为石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组，每组5只；实验二：冷暴露动物模型建立及治疗，76只雄性C57BL/6J小鼠随机分为两个实验分组，每个实验组分为对照组（n=8）、模型组（n=10）、石墨烯-远红外（FIR）组（n=10）、碳纤维-FIR组（n=10）；实验三；液氮法制备冻伤模型及评价，24只雄性ICR小鼠随机分为模型组、石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组（n=8）；实验四：角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓模型建立及评价，40只雄性ICR小鼠随机分为对照组、模型组、石墨烯-FIR组、碳纤维-FIR组、哌唑嗪阳性药组（n=8）。小鼠干预治疗见流程图1。

1.3 发热膜热疗

将小鼠置于40 cm×25 cm×20 cm的矩形塑料箱中进行FIR干预。其中包含16片串联的FIR薄膜，单片电阻值为27 Ω。FIR薄膜安装在箱壁表面，由独立可变电压的电源供电。在FIR照射实验中，将小鼠置于箱内中心，允许其自由活动。对照笼内温度约为（24.0±1）℃，FIR舱内温度约为（30.0±1）℃。将实验室温控制在25 ℃。石墨烯器件和碳纤维器件的输入功率均设置为30 W。小鼠每天照射4 h，上午下午各2 h，照射1周。

1.4 模型建立

1.4.1 急性和间歇性冷暴露小鼠模型

将小鼠置于4 ℃智能人工气候箱中，寒冷暴露时小鼠单只放置，急性暴露4 h，建立急性冷暴露小鼠模型。将小鼠置于4 ℃智能人工气候箱中，寒冷暴露时小鼠单只放置，每天暴露4 h，共3 d，建立间歇性冷暴露小鼠模型^［13］。

1.4.2 冻伤小鼠模型

冻伤模型检测石墨烯干预治疗的作用。参考《冻伤动物模型制备规范（草案）》为依据^［14］，使用液氮法于ICR小鼠背部行Ⅳ度冻伤造模。具体方法：液氮法制备冻伤小鼠模型，小鼠麻醉，背部脱毛一定区域。将铁棒浸入液氮罐中15 min左右，使其充分冷却至-196 ℃，立刻将铁棒紧贴小鼠皮肤，持续30 s。皮肤局部冻伤后即造模成功，并按照评分标准进行综合感官评分。

1.4.3 小鼠尾部血栓模型

外周血管遇冷刺激收缩痉挛持续一段时间之后，血流瘀滞，受冻部位进入冻伤病理过程中的下一阶段：微血栓形成。本部分实验使用角叉菜胶诱发的小鼠尾部血栓模型，研究石墨烯发热膜热疗对血栓形成的抑制作用，参照文献方法^［15］加以改进建立小鼠尾部血栓动物模型，小鼠腹腔注射角叉菜胶2.5 mg/kg造模24 h，对照组腹腔注射0.9%氯化钠，阳性药组单次灌胃1 mg/kg哌唑嗪。尾部血栓造模成功的判定方法：尾部形成暗红色血栓。

1.5 体表温度及肛温测量

在FIR干预结束或者冷暴露结束后，采用红外成像仪检测被试小鼠的体表温度。使用体温仪测量小鼠的肛温，将体温仪探头轻轻插入小鼠肛门内1.5 cm，维持10 s，记录肛温。

1.6 血流灌注量检测

将实验小鼠置于激光血流散斑成像装置内，保持小鼠气麻，通过系统内置CCD摄像机检测血液流动，然后捕捉图像，并选择区域进行分析。

1.7 HE染色

为了确定小鼠组织血管内形成的血栓，收集小鼠尾巴的不同位置组织（距离尾巴尖端2 cm、4 cm、6 cm处）置于4%多聚甲醛固定过夜。制备组织样品、切片并进行HE染色。

1.8 血清生化分析

按照试剂盒说明书分别检测尾部冻伤小鼠血清中炎症及血栓因子：TNF-α、IL-6、IL-1β、6-keto-PGF1α、TXB₂、t-PA。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析，所有结果均以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，3组及以上的比较采用单因素方差分析，采用Holm-Sidak法对体温进行统计比较。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石墨烯和碳纤维材料性质对比

实验结果显示，相比于碳纤维薄膜，在相同功率条件下石墨烯薄膜升温速度更快（图2B）。在相同的功率下，石墨烯薄膜的最大发射峰值与碳纤维薄膜不同，石墨烯薄膜发射峰位置（8.0 µm）与人体体表特征吸收峰重合，而碳纤维薄膜的发射峰值波长低于石墨烯薄膜（图2C、D）。小鼠接受FIR热疗后，红外热成像结果显示，与碳纤维组相比，石墨烯-FIR组小鼠体表温度更高，维持温度时间更长（P<0.05，图2E、F）。

2.2 石墨烯-FIR热疗对急性和间歇性冷暴露小鼠肛温的影响

在急性冷暴露模型中，与对照组相比，模型组小鼠肛温下降（P<0.01）；与模型组相比，石墨烯-FIR组小鼠肛温上升（P<0.01），碳纤维-FIR组小鼠肛温则无明显变化，且石墨烯-FIR组与碳纤维-FIR组比较差异有统计学意义（P<0.01，图3A）。在间歇性冷暴露模型中，与对照组比较，模型组小鼠肛温下降（P<0.05）。与模型组相比，石墨烯-FIR组和碳纤维-FIR组小鼠肛温均上升（P<0.01），且石墨烯-FIR组小鼠肛温明显高于碳纤维-FIR组（P<0.01，图3B）。

2.3 石墨烯发热膜热疗对冻伤小鼠冻伤创面的影响

小鼠冻伤区域表观及评分（图4，图5），红外热成像结果显示，石墨烯-FIR组小鼠冻伤区域温度高于模型组和碳纤维-FIR组（P<0.01）。小鼠造模第3天，与模型组比较，石墨烯-FIR组小鼠冻伤区域面积降低（P<0.01），且与碳纤维-FIR组比较差异有统计学意义（P<0.01）。同时，石墨烯-FIR组小鼠冻伤表观综合评分明显高于模型组和碳纤维-FIR组；小鼠造模第6天，石墨烯-FIR组小鼠冻伤区域颜色评分低于模型组和碳纤维-FIR组（P<0.05）；石墨烯-FIR组小鼠冻伤区域表观综合评分高于模型组（P<0.01）。

2.4 石墨烯发热膜热疗对角叉菜胶诱导血栓的影响

实验结果显示，造模小鼠均出现不同程度血栓（图6），模型组小鼠尾部血栓率达100%。与空白组比较，模型组小鼠尾中部，根部的血流灌注量下降（P<0.01），表明血栓模型造模成功。与模型组相比，石墨烯-FIR组小鼠的尾部血栓长度降低（P<0.05），尾部（根部和中部）血流灌注量升高（P<0.01），而碳纤维-FIR组没有差异；与模型组相比，阳性药可以明显减轻血栓长度，提高尾部血栓血流灌注量（P<0.05，图7）。HE染色结果显示，对照组小鼠尾尖不同距离的血管结构清晰可辨，未见血栓形成；模型组血栓形成明显，出现炎症浸润；与模型组比较，石墨烯-FIR组和Pra组血栓情况均明显改善（图8）。

2.5 石墨烯发热膜热疗对血栓模型小鼠凝血功能和炎症因子的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清中TXB₂水平明显升高（P<0.01），6-keto-PGF1α和t-PA水平降低（P<0.01）；与模型组比较，石墨烯-FIR组和阳性药组血清TXB₂水平均降低（P<0.01、P<0.05），6-keto-PGF1α和t-PA水平升高（P<0.05、P<0.01），而碳纤维-FIR组变化无统计学意义（图9A~C）。

ELISA检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显升高（P<0.01）；与模型组相比，石墨烯-FIR组和阳性药组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均降低（P<0.01），石墨烯-FIR组IL-1β水平变化则不明显，而碳纤维-FIR小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均无明显变化（P>0.05，图9D~F）。

3 讨论

FIR医疗设备已广泛用于临床疾病治疗和健康维护^［16］。在实际应用中，由石墨烯制作的各种理疗产品已经融入社会保健和医院康复治疗领域，产品涉及方方面面（眼、颈、腰、膝部护理仪、医疗护具、智能家纺、电暖器、智能服饰等），在市面上大多石墨烯产品价格实惠，可以满足大多数人的选择需要。在本研究中，我们利用基于石墨烯发热膜的热疗装置，探究石墨烯-FIR对不同程度冻伤的预防及改善作用。前期研究已表明^{［10，11］}，石墨烯发热膜具有特殊的光谱特性和电热学特性，在特定波长范围内，石墨烯-FIR的生物效应优于碳纤维。在极寒恶劣环境下，作业人员因防寒措施不足或保护不当，极容易发生核心体温降低，并引发外周组织冻伤等一系列生理病理改变^［17］。本实验通过急性或者间歇性寒冷环境刺激建立小鼠冷暴露模型，液氮冷冻法建立急性冻伤模型以及角叉菜胶诱导血栓模型，评价石墨烯-FIR热疗对模型小鼠体温及血流微循环的影响。

在冷暴露模型中，石墨烯-FIR热疗能够明显提高小鼠肛温，避免寒冷暴露引起的体温下降，而碳纤维-FIR对模型小鼠肛温的影响并不显著，表明石墨烯发热膜热疗能够有效维持机体体温。尽管人体可以调控核心体温确保机体内环境运转，但环境温度过低对皮肤和外周肌肉组织有很大危害，肢端比身体其他部位更易受到低温暴露的影响^［18］。有研究表明，极端环境下作业人员出现手脚冻伤的概率在70%左右^［19］。本研究中，利用液氮冷冻法模拟组织冻伤，评价石墨烯-FIR热疗对冻伤的防护作用。结果发现，石墨烯-FIR热疗能显著改善冻伤程度，降低冻伤区域面积表明石墨烯-FIR治疗可以有效加快冻伤创面的修复。

肢体末端的热量供应大部分依赖于机体的血液循环带来的热量^［20］。但肢体末端的热量受到肢端血管热调节，在低温暴露下，热量产生逐渐降低，其血液循环下降^［21］。如果体表温度下降到7℃时，肢体产生麻木感觉，当体表温度降低到0℃以下后会引起组织冻伤的发生，严重会导致血栓的发生。冻伤部位的组织血管壁损伤、血流淤堵局部和血液凝结状态被公认为是血栓发生的三大成因，具备一条或多条即可引发血栓的形成。预防冻伤的关键是快速恢复机体温度、加快肢体寒冷暴露区域的血液循环。快速复温能减缓冻伤状态，减轻局部炎症；而加快血液循环，则有利于暴露区域的组织修复^{［22， 23］}。炎症分子表达的激活，如IL-6和TNF-α，已被证明与血栓形成风险增加有关^［24］。Summer等^［25］于1943年提出冻伤后微循环障碍学说，研究发现冻伤家兔后肢与人皮肤微循环血流量不同，提示血流量与冻伤组织损伤关联。Weatherley-white等^［26］通过把冻伤兔耳的皮肤移植在正常兔耳上发现可以存活，相反则造成坏死。这表明冻伤区域血流情况与组织状态密切相关。Cheng等^［18］研究发现使用特殊的远红外发热材料制作的袜子不仅可以提高二型糖尿病患者足部皮肤保暖能力，促进足部血流变化，还可以使下肢交感神经系统更加活跃，改善足部血液循环。Li等^［11］研究发现经过石墨烯-FIR干预治疗的疲劳小鼠，发现与模型组相比，治疗组小鼠的后肢和腹部血液流速显著提高，体表温度显著升高，且效果优于碳纤维-FIR，证明远红外具有增加局部血流量，改善微循环的作用。在本研究中，通过给小鼠注射角叉菜胶，诱导组织血管血栓形成，是一个常用的血栓动物模型，使用哌唑嗪作为阳性对照。结果发现，石墨烯-FIR热疗能明显改善模型小鼠尾部血栓程度，提高血流灌注量。

长时间的寒冷应激下，小鼠肢体末端的外周血管持续收缩痉挛一段时间之后，体表及组织内的局部血流瘀堵，受冻部位的微血栓形成。血栓形成与血液凝固、血小板活化功能以及纤维蛋白溶解密切相关。TXB₂是血栓素A2（TXA₂）的无活性代谢物，在伤口愈合过程中对血小板的激活和聚集起着重要的作用，具有促进血小板聚集、促凝和缩血管的作用，6-keto-PGF1α是一种血小板聚集抑制物，具有较强的抗凝和扩血管作用，t-PA浓度增高是血管内皮损伤和纤溶系统激活的标志物^［27］。血栓形成与血小板激活关系密切，血小板是生理性止凝血的主要成分，激活后参与止血与血栓形成。血小板首先粘附于受损血管部位，然后被胶原或凝血酶激活，发生花生四烯酸反应产生并释放TXA₂，后者具有强大的促进血小板聚集、活化的作用，能够继续诱导凝血过程形成血栓，被认为是血小板活化的分子标志物之一。前列环素（PGI₂）主要由血管内皮细胞分泌，是舒血管和抗血小板活性物质，能够与血小板膜的特异受体结合，抑制血小板活化。在正常生理状态下，血浆或组织中的TXA₂和PGI₂的浓度比例处于相对平衡，病理状态下，TXA₂和PGI₂平衡失调是造成血小板聚集、血管痉挛收缩或血栓形成的原因之一。此外，冻伤造成微血栓，血液中t-PA与纤维蛋白结合耗损增加，导致血浆含量下降，血小板激活后，α颗粒中的PAI急性释放入血，压倒性地灭活t-PA，稳定已生成的血液凝块，血浆中t-PA及组织型纤溶酶原激活物（PAI）含量的平衡关系在血栓性疾病的发病机制中起关键作用，本实验通过测定TXB₂和6-keto-PGF1α（PGI₂的代谢产物）在血栓状态下及FIR治疗后生成量的变化，以及血管内皮细胞分泌的t-PA的改变，进一步分析石墨烯-FIR治疗抗血栓的分子机制^［28］。IL-1β、IL-6和TNF-α是典型的促炎因子，是炎症反应的重要标志物^［24］。炎症分子表达的激活，如c反应蛋白，IL-6和TNF-α，已被证明与血栓形成风险的增加相关。本研究发现，石墨烯-FIR热疗显著升高了血清中6-keto-PGF1α、t-PA水平，并降低了TNF-α、IL-6及TXB₂水平，而碳纤维组则无此作用，表明石墨烯-FIR可能通过调节血清凝血因子和炎症水平，抑制炎症与血栓之间的级联反应，改善小鼠尾部血栓状况。

内皮细胞损伤是血栓形成的重要始动因素。凋亡的内皮可诱发血小板的活化和内皮-血小板黏附，从而加速血栓的形成。PI3K/Akt是重要的维持细胞活性抑制的细胞凋亡通路^［29］。AKT在调节血小板活化中起着重要作用。研究发现，由陶瓷制成FIR热疗装置通过诱导的PLZF上调PI3K p85的表达并诱导AKT磷酸化，来发挥保护胰腺β-细胞免于凋亡，从而防止DM小鼠胰岛功能的减少，改善血糖水平^［7］。同时，有研究报道，石墨烯远红外辐射可增强血管微循环，调节影响血管平滑肌收缩的细胞因子，改变血管形态和平滑肌表型，缓解原发性高血压水平^［30］。课题组前期发现^{［10，11］}石墨烯-FIR热疗通过激活AMPK活性，调节肠道微生物群稳态，增强肌肉葡萄糖摄取和血流量，从而达到模拟或增强运动的效果。同时，本次研究发现石墨烯-FIR热疗可以降低角叉菜胶模型小鼠尾部血栓长度，增加血流灌注量，推测石墨烯-FIR热疗干预冻伤部位血栓减轻可能是由于AMPK信号通路和AKT信号通路介导发挥作用。

本研究通过建立不同动物模型来评价石墨烯-FIR热疗对冻伤的防护作用。研究结果表明，石墨烯-FIR热疗可以改善寒冷暴露对机体的损伤，提高机体温度，减少创面组织炎症浸润，加快创面愈合，减少血栓的形成。石墨烯热疗调节微循环及抗炎作用可能是其改善冻伤的关键机制。本研究将为极寒地区作业人员防寒及冻伤修复提供新的干预方式，也为石墨烯发热膜的临床应用提供了新的实验依据。

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