低强度脉冲超声联合制霉菌素可协同抑制兔阴道白色念珠菌生物被膜感染

Low-intensity pulsed ultrasound combined with nystatin treatment synergistically inhibits vaginal Candida albicans biofilm infection in rabbits

摘要

目的 探索低强度脉冲超声（LIPUS）联合制霉菌素（NYS）对阴道白色念珠菌生物被膜感染的治疗效果。 方法 建立体外白色念珠菌生物被膜模型，同时将体外培养成熟的生物被膜用自动微移液管接种至20只雌性新西兰大白兔阴道内，以建立兔阴道白色念珠菌生物被膜感染模型，实验分为Control组、NYS组、US组和联合治疗组。体外实验采用XTT法检测生物被膜最低抑菌浓度（MIC），结晶紫染色定量生物被膜，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察生物被膜活性，扫描电镜（SEM）观察形态学变化，DCFH-DA检测活性氧（ROS）。体内实验通过观察兔外阴症状，HE染色和透射电镜（TEM）观察治疗前后阴道组织病理结构变化。 结果 体外实验显示，联合治疗组MIC₅₀和MIC₈₀相比NYS组均降低2倍（P<0.05），此外，联合治疗组生物被膜清除率分别比NYS组和US组增加约26%和68%（P<0.001），同时联合治疗组生物被膜活性更低、结构破坏更严重，ROS产量更多。体内实验表明，与NYS组和US组比较，联合治疗组兔外阴症状与炎症浸润显著改善（P<0.05），阴道残留菌丝/菌株减少，上皮超微结构明显改善。 结论 LIPUS联合NYS对体内外白色念珠菌生物被膜有显著的协同抗真菌作用。

Abstract

Objective To explore the efficacy of low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) combined with nystatin for treatment of vaginal Candida albicans biofilm infection. Methods In vitro cultured Candida albicans biofilm were treated with LIPUS, nystatin, or both, and the minimum inhibitory concentration (MIC) of nystatin was determined. Crystal violet staining, confocal laser microscopy (CLSM) and scanning electron microscopy were used to quantify the biofilm and observe the activity and morphological changes of the biofilms; DCFH-DA was used to detect the changes in reactive oxygen species (ROS). Twenty female New Zealand White rabbits with vaginal inoculation of Candida albicans biofilm were randomized into 4 groups for treatment with normal saline, LIPUS, nystatin, or both LIPUS and nystatin. The changes in vulvar symptoms of the rabbits were observed, and the histopathological and ultrastructural changes of the vagina before and after treatment were observed using HE staining and transmission electron microscopy. Results In the combined treatment group, the MIC₅₀ and MIC₈₀ of nystatin in Candida albicans biofilms were both reduced by 50% compared with those in nystatin group, and the biofilm clearance rate increased by 26% and 68% compared with nystatin and LIPUS groups, respectively. Compared with nystatin and LIPUS treatment alone, the combined treatment produced stronger effects for inhibiting biofilm activity, causing structural disruption and promoting ROS production. In the rabbit models, the combined treatment more effectively improved vulvar symptoms and inflammatory infiltration, reduced residual vaginal hyphae/strains, and improved ultrastructure of the vaginal epithelium than LIPUS and nystatin treatment alone. Conclusion LIPUS combined with nystatin produces a significant synergistic antifungal effect against Candida albicans biofilm both in vitro and in vivo.

Graphical abstract

关键词

低强度脉冲超声 / 白色念珠菌 / 生物被膜 / 制霉菌素 / 阴道炎

Key words

low-intensity pulsed ultrasound / Candida albicans / biofilm / nystatin / vaginitis

在妇女健康问题中，阴道炎居妇科感染性疾病首位。白色念珠菌是人类常见的致病性真菌，它能够以共生菌的形式定植于人体的各个器官，引起浅表或全身性感染^{［1， 2］}，其能以生物被膜的形式附着在生物或非生物表面，形成由基质包裹的微生物聚集体，由于基质强大的粘附力有助于维持生物被膜结构稳定性，其耐药性和对宿主免疫的抵抗性明显强于浮游菌^［3-6］。外阴阴道念珠菌病（VVC）主要是由白色念珠菌感染引起的女性下生殖道黏膜真菌感染，其发病率仅次于细菌性阴道炎。目前临床上对于复发性、难治性VVC，传统治疗方式存在治疗时间长、毒副作用大、疗效不稳定等缺点^［7，8］。既往研究已经证实难治性、复发性VVC与生物被膜的形成有关，生物被膜致密的三维结构能抵抗大部分抗真菌药物渗透到感染区域，此外阴道中的粘液通过相互作用，也能限制一部分药物渗透到上皮层^［9，10］。因此迫切需要寻找一种更有效的治疗方式。

声动力疗法（SDT）是利用低强度脉冲超声（LIPUS）穿透靶区组织并诱导声敏剂的瞬态物理化学行为，能触发一定量活性氧（ROS）的产生，从而对病变细胞造成永久性损伤。此外，现有研究已经证实其机械效应和空化效应不仅能破坏致密的生物被膜结构，同时还能短暂打开人体内诸多递药屏障，如皮肤角质层及体内各粘膜屏障，从而增加药物的渗透性，具有显著的协同抗真菌作用^［11-13］。

制霉菌素（NYS）是一种有效的广谱多烯类抗生素，常用于治疗VVC等浅表念珠菌病^{［14，15］}。前期我们团队发现NYS联合超声治疗生物被膜后产生的ROS明显多于NYS组，该结果表明NYS可能具有声敏性。目前尚未见NYS联合超声治疗阴道白色念珠菌生物被膜感染的研究，因此本研究旨在探究超声联合临床常用抗真菌药物NYS对阴道白色念珠菌生物被膜感染的治疗效果，为临床上真菌性生物被膜感染提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

白色念珠菌标准菌株ATCC 10231（中国微生物菌种保藏中心）。

1.1.2 实验动物

20只健康新西兰雌性大白兔，月龄3~4月、体质量2.5~3.0 kg，购于重庆医科大学动物中心，所有实验动物均在相同标准的实验环境下饲养。本研究所有动物相关实验操作符合并通过重庆医科大学实验动物伦理委员会审核标准（伦理批号：2022162）。

1.1.3 药品与试剂

NYS（GlpBio）；甲基四氮盐（XTT）、甲萘醌、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养液（Hycline）；SYTO 9/PI染料（Nvitrogen）；磷酸盐缓冲液（PBS，PH=7.2，赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；沙氏葡萄糖液体培养基（广东环凯微生物有限公司）；DCFH-DA试剂（碧云天）。

1.1.4 实验仪器

低强度脉冲超声治疗仪（重庆融海超声医学国家工程研究中心），TCS-SP2激光共聚焦显微镜（Leica），紫外分光光度计（Thermo Scientific），Spectra MaxM2e多功能酶标仪（美谷分子仪器有限公司），扫描电镜（Hitachi），透射电镜Hitachi 7500（Hitachi），正置显微镜（Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 体外白色念珠菌生物被膜模型建立

通过细胞培养板法建立体外生物被膜模型，从琼脂培养基中挑取1~2个菌落，并将其接种至100 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，培养条件为37 ℃、180 r/min，持续培养24 h，收集菌液，并用RPMI 1640将菌液浓度调整为3×10⁶ CFU/mL。取1.5 mL菌液于35 mm细胞皿中继续在37 ℃培养24 h后，用PBS轻轻冲洗未黏附的悬浮菌，然后添加1.5 mL RPMI 1640，继续培养至生物被膜成熟。

1.2.2 实验分组及超声辐照方式

在培养72 h获得成熟生物被膜后，以PBS轻轻冲洗3次，随机将生物膜分为 对照组（Control）、超声组（US）、NYS组（NYS）、NYS联合超声组（NYS+US），共4个组。其中联合治疗组和US组进行超声辐照，辐照方式为将超声探头末端涂抹偶合剂，紧贴于细胞培养板下端辐照，避免气体干扰，辐照参数为：1 MHz，1 W/cm²，5 min，50%占空比^［16］；另外Control组和NYS组进行超声假照（换能器关闭状态）。

1.2.3 白色念珠菌生物被膜MIC测定

取100 μL菌液（3×10⁶ CFU/mL）加入96孔板中，72 h生物被膜形成后PBS冲洗3遍，将NYS以RPMI 1640为溶剂并以二倍稀释法配制2~256 μg/mL的药物浓度，以不加药物的RPMI 1640培养液为阳性Control组，每个浓度重复3孔；其中联合治疗组进行超声辐照，另外阳性Control组和NYS组进行超声假照（换能器处于关闭状态），辐照完成后继续培养24 h。之后加入200 μL配置好的XTT-甲萘醌溶液，37 ℃避光，孵育2 h后，酶标仪测量各组的吸光值A_{450 nm}，以评估生物被膜内细胞的活性，进而确定NYS组及联合治疗组对生物被膜的MIC₅₀及MIC₈₀（即吸光值相对于阳性Control组下降50%、80%的最低浓度）。

1.2.4 结晶紫染色定量白色念珠菌生物被膜

获得成熟生物被膜后，以PBS冲洗未黏附的浮游菌，随机将生物被膜分为4组，每组重复3个样本。NYS组和NYS+US组分别加入1 mL药物浓度为32 μg/mL（MIC₅₀） NYS溶液，Control组和US组分别加入1 mL PBS溶液，各组治疗后继续放入37 ℃孵箱培养24 h后吸去上清液，然后在各个组中加入100 μL 0.1%的结晶紫溶液染色10 min，接着用PBS洗涤3次。然后加入200 μL 95%乙醇溶液溶解30 min，最后用酶标仪检测吸光度值A_{570 nm}，并进一步计算生物被膜量清除率：生物被膜量清除率= ［（A_Control-A_Test）/A_Control］×100%。

1.2.5 扫描电镜（SEM）观察白色念珠菌生物被膜结构形态学变化

首先将专用盖玻片置于6孔板内，取1.5 mL配制好的菌液（3×10⁸ CFU/mL）加入6孔板，将菌液培养在此盖玻片上直至成熟白色念珠菌生物被膜形成，不同条件治疗生物被膜24 h后用PBS漂洗3次，最后用SEM观察生物被膜的结构变化。

1.2.6 激光共聚焦显微镜（CLSM）观察白色念珠菌生物被膜活性

SYTO 9/PI试剂盒用于观察不同条件治疗后白色念珠菌的活性，该试剂盒同时提供检测活细胞和死细胞两种探针用于细胞活力测定，SYTO 9探针检测活细胞、PI探针检测死细胞。在不同条件治疗24 h后，将2 μL SYTO 9和2 μL PI探针依次加入细胞培养皿中，室温下避光孵育30 min， 按照3~5 min/次混合，之后用PBS冲洗3次，并在CLSM下观察生物被膜活性。

1.2.7 DCFH-DA检测白色念珠菌生物被膜ROS

在本研究中，使用DFCH-DA试剂盒来检测白色念珠菌生物被膜的ROS水平。不同条件治疗生物被膜5 h后，加入200 μL DCFH-DA试剂在37 ℃下孵育30 min后用PBS清洗3次，最后用CLSM和流式细胞术检测ROS水平。

1.2.8 兔阴道白色念珠菌生物被膜感染治疗效果评价

根据已有文献中的方法，在建模前连续3 d对兔进行皮下注射戊酸雌二醇，用以诱导假发情和免疫抑制状态^［17］。随后将体外培养成熟的生物被膜用自动微移液管接种至阴道内，接种频率为1次/d，持续5 d。每次注射后，用无菌棉球堵塞阴道口，防止液体流出。连续接种5 d后，观察兔阴道外阴症状，并取阴道盥洗液进行平板计数和HE染色阴道组织以确定是否建模成功。生物被膜阴道炎建模成功的兔子随机分为4组（n=5），分为Control组、US组、NYS组、NYS+US组，每组连续治疗7 d，超声辐照方法为在注射药物或生理盐水后，立即将环形超声治疗器缓慢插入兔阴道内，超声辐照参数同前。治疗结束后观察各组兔外阴症状，并将所有兔安乐死，随后对阴道组织进行HE染色，分析各组治疗后阴道组织病理结构变化、白色念珠菌残留情况，最后利用透射电镜（TEM）观察阴道上皮的超微结构变化。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 9.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 体外白色念珠菌生物被膜的形成过程及特征

通过结晶紫染色观察体外白色念珠菌生物被膜的形成过程，在生物被膜形成的初期（2~6 h），白色念珠菌以单一酵母菌落形态附着于细胞皿表面；12 h时白色念珠菌微菌落数量增多，并以簇状分布呈现；在培养24 h时，菌落数量进一步增加，形成厚薄不一的膜状结构；在48 h时，白色念珠菌微菌落呈大小不一团块，膜状结构明显，结晶紫染色加深；在培养72 h后，生物被膜结构较48 h更为致密，形成了厚度明显的致密膜状结构，提示成熟白色念珠菌生物被膜结构形成时间在48~72 h期间（图1）。

2.2 白色念珠菌生物被膜MIC检测

通过XTT法检测NYS组治疗白色念珠菌生物被膜的MIC₅₀、MIC₈₀分别为32 μg/mL和256 μg/mL，联合治疗组MIC₅₀、MIC₈₀分别为16 μg/mL和128 μg/mL，与NYS组比较，联合治疗组MIC₅₀和MIC₈₀均降低两倍（P<0.05），表明联合治疗组增加了对生物被膜的敏感性。

2.3 结晶紫染色检测白色念珠菌生物被膜量的变化

不同条件治疗24 h后，使用结晶紫染色白色念珠菌生物被膜并在显微镜下观察，Control组生物被膜结晶紫染色较深、结构致密；与Control组比较，US组染色程度稍变浅、结构稍稀疏；NYS组生物被膜结晶紫染色变浅、结构较为稀疏，部分致密结构被破坏；联合治疗组结晶紫染色结果显示生物被膜染色进一步变浅，大部分致密膜状结构被破坏，呈散在菌落状（图2A）。Control组和US组A_{570 nm}变化不大（P>0.05，图2B）。联合治疗组的生物被膜清除率分别比NYS组和US组增加约26%和68%（P<0.001，图2C）。

2.4 CLSM观察白色念珠菌生物被膜活性

Control组和US组生物被膜以绿色荧光（活菌）为主，NYS组生物被膜有近一半呈现红色荧光（死菌），而联合治疗组可见大部分生物被膜都呈现红色荧光（死菌），结果显示与NYS组和US组比较，联合治疗组对生物被膜抗真菌效果更明显（图3）。

2.5 SEM观察白色念珠菌生物被膜结构变化

通过SEM观察，可见Control组中白色念珠菌生物被膜较为致密，呈具有一定厚度的三维结构；US组生物被膜结构稍稀疏，膜内少许白色念珠菌得以暴露（红色箭头）；NYS组致密的生物被膜结构大部分被破坏，膜内白色念珠菌基本得以暴露，但暴露的致病菌表面结构受损不明显（图4①）；联合治疗组生物被膜结构基本被破坏，膜内白色念珠菌结构严重破坏，并现出菌体破裂情况（图4②）。

2.6 DCFH-DA检测白色念珠菌生物被膜产生活性氧情况

Control组和US组未观察到明显的ROS产生，NYS组ROS荧光强度较低，相比之下，联合治疗组生物被膜内ROS荧光强度增强、ROS水平升高（图5）。

2.7 兔阴道白色念珠菌生物被膜感染治疗效果评价

连续治疗7 d后，通过观察兔外阴症状发现Control组兔外阴红肿明显，US组症状无显著变化，NYS组可见兔外阴存在白色豆腐渣样分泌物、外阴红肿症状有所改善，与NYS组和US组比较，联合治疗组兔外阴症状得到明显改善（图6A）。HE染色可见Control组阴道腔内大量菌落聚集（黑色箭头），部分白色念珠菌酵母细胞及菌丝粘附于黏膜下（黑色箭头），粘膜炎症浸润明显（红色箭头）；US组变化不大，阴道腔仍有大量菌丝残留（黑色箭头）；NYS组菌丝明显减少（黑色箭头），但粘膜下仍可见炎症浸润情况（红色箭头）；联合治疗组阴道腔内未见明显菌丝残留，炎症浸润也得到明显改善（图6B）。TEM可见Control组存在大量白色念珠菌浸润阴道上皮细胞（黄色箭头），阴道上皮细胞肿胀明显失去正常结构，细胞间隙消失，细胞器、细胞核明显变形；US组阴道上皮细胞结构损伤严重，无明显改善，仍可见白色念珠菌浸润（黄色箭头），中性粒细胞渗入阴道上皮细胞（绿色箭头）等情况；NYS组阴道上皮细胞超微结构基本恢复正常，细胞间隙变窄，但细胞内可见线粒体稍肿胀、其基质密度降低（蓝色箭头），渗入的中性粒细胞（绿色箭头）；联合治疗组阴道上皮超微结构得到明显改善，细胞间隙恢复正常（图6C）。

3 讨论

白色念珠菌是女性阴道炎常见条件致病菌，其发病率、复发率高，是世界抗真菌治疗的难题之一^［18］。临床上治疗VVC的主要方法包括口服或局部使用抗真菌药物^［19］，但在反复感染的情况下，致病菌往往在阴道黏膜形成生物被膜，其强大内聚力和粘附力，使得抗真菌药物难以有效渗透，此外，阴道内的黏液及上皮褶皱结构进一步加剧了这一问题^{［6， 10］}。针对以上问题，有学者提出可分散或破坏生物被膜结构使膜内致病菌更容易受到抗真菌药物和宿主免疫应答的影响，同时研究更有效的给药方法也是一种可行的方案。低强度超声作为非侵入性、无辐射、可靶向的物理治疗手段，已被证实能提高药物在皮肤和血脑屏障的渗透性，是一种非常有前景的增强抗生素抗菌的方法^{［12， 20］}。在本研究中，我们将超声与一线抗真菌药物NYS联合使用，并在体内外建立白色念珠菌生物被膜模型以验证联合治疗的协同抗真菌作用。

本研究首先在体外探究了联合治疗对白色念珠菌生物被膜的抗真菌作用，通过XTT法测定结果显示，与NYS组比较，联合治疗组的生物被膜MIC₅₀和MIC₈₀均降低了两倍。类似的结果在海藻酸寡糖协同抗真菌的研究中得到了验证，该研究显示海藻酸寡糖联合抗真菌药物治疗白色念珠菌的MIC降低幅度与本研究相似^［21］，该结果提示超声可能具有协同抗真菌作用。结晶紫染色结果进一步支持了这种观点，联合治疗组较NYS组生物被膜清除率提高约26%，同时SYTO 9/PI活死菌染色结果也显示联合治疗组生物被膜的死菌数量明显增多、活性明显降低，这与结晶紫结果一致，进一步证实了联合治疗在清除生物被膜方面的优势。在抗真菌治疗方面，有研究报道光动力疗法与NYS联合使用能引起生物被膜基质的改变，促进更多NYS渗透到生物被膜深层，并增强其与细胞膜中的麦角甾醇结合，从而导致更多真菌死亡^［22］。同样，有研究表明超声能够促进十二烷基硫酸钠在金黄色葡萄球菌生物被膜中的渗透，从而增强抗菌效果^［23］。扫描电镜结果显示，联合治疗组成功破坏了大部分致密的生物被膜结构，导致白色念珠菌细胞结构严重受损。超声联合声敏剂能通过声致发光和空化效应产生大量ROS，这种有毒的化合物对浮游生物和生物被膜感染具有抗菌作用^［24］，本研究通过检测ROS水平发现，超声能激活NYS产生更多ROS，这一现象表明联合治疗组可能通过声动力效应进一步增强抗真菌作用。以上结果支持了超声联合NYS治疗白色念珠菌生物被膜的潜在协同效应。

虽然阴道局部给药是治疗VVC的首选方法，但由于阴道内的黏液层和上皮结构的存在，许多传统药物往往受到局部屏障的限制^{［10， 19］}。因此，本研究进一步在体内验证了超声联合NYS治疗的效果，结果表明，超声辅助给药方式相比于单独使用NYS，表现出更显著的治疗效果。这些结果为超声联合抗真菌药物的临床应用提供了理论支持，并为复发性、难治性VVC的治疗提供了新的思路。

本研究推测联合治疗对白色念珠菌生物被膜感染的协同抗真菌机制可能涉及以下几个方面：首先，超声波产生的机械效应和空化效应（如微射流冲击波和高剪切力）可能通过破坏生物被膜基质和细胞膜结构，促进药物更有效地渗透至被膜内部；其次，超声波激发NYS生成的ROS能够进一步破坏生物被膜结构并杀灭更多的致病菌。此外，在体内实验中，超声波与阴道粘液之间的相互作用，产生的空化效应或其他声物理学效应，可能对粘液中的主要成分——粘蛋白产生影响，从而增加粘液的通透性，这一变化提高了药物在阴道内的递送效率，进而增强了其对致病菌的抗真菌作用。

由于传统疗法在治疗复发性和难治性VVC中的局限性，相关学者已提出了一系列新的治疗策略。例如，益生菌治疗VVC的研究表明，将酿酒酵母引入小鼠阴道能抵抗白色念珠菌的侵袭。然而，作为活体制剂，益生菌的使用仍然存在潜在的风险，已有研究表明益生菌在少数女性中可能引起类似阴道炎的症状^［25］。此外，抗菌肽也是一种很有前途的候选药物，其能与靶细胞膜相互作用导致细胞内大分子物质泄漏，来达到抗菌目的^［26］。光动力疗法利用无毒光敏剂和可见光诱导ROS物质的产生以增强对致病菌的清除能力，但目前其安全性和具体实施方案尚未得到充分验证^［27］。尽管针对生物被膜形成相关的粘附因子Als3和酶Sap2的疫苗已在实验阶段取得一定进展，但目前尚未获得临床批准用于人体治疗，未来可能会有进一步发展^［28］。SDT具有优越的穿透性、能量沉积性、生物相容性和方向性，在临床和基础研究中得到了广泛应用^{［24， 29］}。我们团队的前期研究已证实，特定超声参数不仅在体内外具有良好的生物安全性，而且能够促进乳杆菌的增殖（约1.8倍），同时调节阴道局部免疫反应^［16］。乳杆菌的增殖不仅有助于维持阴道的低pH环境，支持有益细菌的生长，还能增强阴道的免疫功能，并促进阴道微环境的重塑^［30］。综合考虑超声波促进药物渗透和声动力效应所展现的显著协同抗真菌优势，超声联合NYS作为一种潜力巨大的药物递送系统，在克服阴道药物渗透障碍方面具有重要意义。该联合治疗方案有望降低临床上复发性和难治性VVC的药物用量，减少毒副作用，并缩短治疗周期。

本研究使用的兔阴道感染模型由于物种差异，其阴道的尺寸、解剖结构和阴道内环境与人类阴道的独特性和复杂性存在显著差异，因此可能无法完全模拟人类阴道的生理特征。此外，本研究未对比不同抗真菌药物联合超声对VVC疗效的差异，存在一定的局限性。后续研究将开展大量的体内外实验，优化超声参数（如声强、功率、辐照时间等），并对比不同抗真菌药物（如克霉唑、氟康唑）联合超声对VVC的疗效。此外，研究将进一步探讨SDT在抗真菌机制中的作用，以及其对阴道微生态调控和阴道菌群代谢的影响。未来，我们将通过优化治疗方案并开展更大规模的临床研究，期望为难治性和复发性VVC提供一种既安全又高效的协同治疗策略。

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基金资助

重庆市自然科学基金(CSTB2022NSCQ-MSX0124)

重庆市教委科学技术研究计划项目(KJZD-K202400408)

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