认知障碍是指由不同原因导致的一个或多个认知功能受损，从而造成大脑高级智力加工过程出现异常的情况，认知功能包括记忆、语言、视空间、执行、计算和理解判断等方面。根据损害程度不同，包括从轻度认知功能损害（MCI）到痴呆
［1］。
牙周炎被认为是认知障碍发展的最常见危险因素之一
［2， 3］，能够引起全身低炎症状态，影响全身健康，增加疾病易感性或导致已有全身性疾病的发展（包括糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等）
［4-7］。主要原因是牙周细菌及其毒素通过血源性、口-消化道等途径传播，导致全身低度炎症
［8］。且能通过血脑屏障导致神经系统受损、退变，引发认知功能障碍
［7］。
近年来由于高通量测序技术的进步，已经产生了大量关于口腔微生物组与牙周病之间关系的数据。并从龈下牙菌斑中分离出伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、产黑普雷沃氏菌（Pn菌）和福赛斯坦纳菌
［9］。其中红色（牙龈卟啉单胞菌、齿状密螺旋体、连翘坦纳菌）和橙色复合物种（梭杆菌、普雷沃氏菌和弯曲杆菌物种）与牙周炎发生发展密切相关，有研究中从牙周炎患者龈下菌斑中分离出两种普雷沃氏菌，包括产黑普雷沃氏菌和颊普雷沃氏菌
［10］，它们同为橙色复合物种成员，是龈下斑块中最常见的菌种之一
［11］。在口腔中，该菌属与慢性牙周炎、牙髓感染以及牙齿或牙周源性脓肿有关，是龋齿和牙周炎等口腔疾病的主要病原体
［12， 13］。另有研究表明阿尔兹海默症与牙周病原菌产黑普雷沃氏菌相关，并且发现阿尔兹海默症的死亡风险会随着产黑普雷沃氏菌的IgG负载增高而增高
［14］，但其确定的关系和具体机制还有待进一步研究证实。目前尚未见有关Pn菌对体内认知功能的影响及其潜在机制的研究。本研究拟探究牙周炎密切相关细菌产黑普雷沃氏菌对小鼠认知功能的影响，为认知障碍的早期预防与治疗提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选取24只C57BL/6J小鼠，7~8周龄雄性，体质量20 g左右，于北京药康生物科技有限公司购买［许可证号：SCXK（京）2023-0008］。饲养条件，采用12 h/12 h明暗交替照明，饲养温度控制在22±2 ℃，相对湿度50%±10%，给予小鼠自由饮食。在实验开始前1周适应饲养。本课题已通过军事医学研究院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：IACUC-DWZX-2022-610）。
1.2 实验仪器与系统
戊巴比妥钠（北京化学试剂公司）；架空视频系统、视频跟踪软件、旷场试验箱、新物体试验箱、水迷宫试验池（上海欣软信息科技有限公司）。
1.3 Pn的培养
Pn冻干粉（BNCC369693），在胰酪胨大豆羊血琼脂即用型平板［TSA+5%脱纤维羊血］中复苏培养。随后接种于布氏肉汤培养基中在厌氧条件下培养7 d（37 ℃，55%湿度）。然后离心收集Pn菌（13 000 g，5 min），将沉淀的细胞重悬于PBS中进行实验。
1.4 动物实验分组及造模
将24只C57BL/6J小鼠随机分为对照组（CON），结扎组（P）、结扎+菌组（P+Pn），8只/组。造模持续6周，实验流程（
图1）。
1.4.1 小鼠实验性牙周炎模型的建立
除正常组（CON）小鼠外，其余小鼠使用腹膜内注射戊巴比妥钠（0.04 g/mL，Sigma）麻醉，用5-0丝线结扎左侧上颌第一磨牙牙颈部。每周检查丝线的结扎情况，如发现丝线脱落及时重新结扎。结扎造模持续6周，待行为学实验结束后进行上颌骨取材，拍摄Micro-CT，观察牙槽骨吸收情况。
1.4.2 局部涂菌
CON组用100 μL PBS+配置2.5%羧甲基纤维素涂抹小鼠牙龈边缘；P组结扎造模并用100 μL PBS+配置2.5%羧甲基纤维素涂抹小鼠牙龈边缘（结扎丝线）；P+Pn组在结扎后，用100 μL PBS +配置的含2.5%羧甲基纤维素和109 CFU活菌。结扎线在整个实验期间都保持在原位。禁食禁水1 h，2次/周；在实验开始当天开始记录小鼠体质量，1次/周，观察其变化。连续涂菌与结扎造模同时进行，持续6周，待行为学实验结束后处死取材。
1.5 行为学实验
1.5.1 旷场测试（OFT）
将小鼠置于装置的右上角并进行5 min的自由探索。中心区域被设置为距离墙壁10 cm的正方形。采用架空视频系统记录运动轨迹，系统识别动物的头部、重心及尾巴，自动跟踪目标小鼠的运动轨迹，直接生成活动轨迹图。计算中心区距离、时间与总距离的百分比。每次测试后，使用75%酒精擦拭清洁箱底及侧面，清理设备中的小鼠排泄物和气味，待酒精气味完全挥发后，再放下一只小鼠进行实验。
1.5.2 新物体识别测试（NOR）
在适应阶段（第1天），每只小鼠在没有任何物体的情况下单独留在装置中30 min以适应环境。在训练阶段（第2天），将两个相同的物体放置在距离墙壁10 cm的设备的相对角落。每只小鼠被允许探索两个相同的物体10 min。在测试阶段（第3天），两个物体中的一个被换成了一个新的物体，它在颜色和形状上都与前一个物体不同。每只小鼠被允许探索两个不同的物体10 min。小鼠的鼻子指向小于2 cm的物体并探索它（即与物体互动或嗅探）被视为对物体的探索。视频跟踪软件记录了探索物体所花费的时间、次数、行进路程。判别指数根据以下公式计算：判别指数（在新物体上花费的时间/在两个探索物体上花费的总时间）×100%。每次测试后，使用75%酒精擦拭清洁物体、箱底及侧面，清理设备中的尿液和粪便，待酒精完全挥发后，下一只小鼠进行实验。
1.5.3 Morris水迷宫测试（MWM）
MWM设备由一个直径为120 cm，深度为50 cm的圆形水池组成。该池划分为4个相等区域的象限，在其中一个象限中心放置一个圆形逃生平台（直径9 cm），位于水面下约1 cm，实验于安静且较暗光线的环境下进行，水温控制在与室温相当的22±1 ℃。上方安装摄像头，采用视频分析系统监测和记录小鼠的游泳活动。
小鼠通过平台位置的不断学习记忆，最终以较短的时间游至放置于水池中的平台。实验共6 d完成，前5 d为平台获取和平台隐藏实验。水池共分为4个象限，将站台固定放置于某一象限中央位置，实验者将小鼠放入其中一个象限，使其在水中活动60 s，记录其寻找到平台位置所需要的时间；若60 s内不能自发找到站台位置，实验者将小鼠引导至平台处，使其在平台上停留20 s。每天进行3次实验，分别从不同象限入水，每次实验间隔30 min，共持续5 d。第6天为空间探索实验，撤去水池中的平台，将小鼠从原平台对侧象限放入水中，记录小鼠在水池中的游泳轨迹、找到平台的潜伏期、穿越原平台位置的次数以及在目标象限的活动时间。
1.6 样本收集
行为学实验结束后，小鼠麻醉致死，取材，收集小鼠上颌骨，固定于4%多聚甲醛溶液中，用Micro-CT检测颌骨吸收情况；其余4只保留牙龈组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于HE切片染色。同时收集小鼠脑组织，迅速分离取出脑组织后，固定在4%多聚甲醛溶液中用于后续组织病理学检查，HE和尼氏切片染色。
1.7 Micro-CT观察骨吸收情况
每组小鼠随机选取4块上颌骨，用于Micro-CT扫描，观察骨吸收情况。待测小鼠颌骨组织样本擦干固定液，用塑料薄膜包裹。用小动物Micro-CT（Bruker）扫描影像系统上机进行样本扫描，扫描分辨率9 μm，扫描电压50 kV， 电流400 μA，曝光时间1300 ms。采用NRecon软件（版本1.6.10.1）进行图像重建， CTvox软件（3.0.0.0）对牙周骨组织进行三维重建，测量上颌第二磨牙釉牙骨质界（CEJ）至牙槽嵴顶（ABC）的距离，记为 CEJ-ABC。随后采用 SkyscanCT-Analyzer（CTAn，1.15.2.2）软件获取2D虚拟断层图像进行图像重建，手绘第一磨牙周围牙槽骨设为ROI区域进行微结构参数分析，所有标本的分析范围保持一致。对感兴趣区域（ROI）内的骨组织进行3D分析和量化。
1.8 HE、Masson及尼氏染色检测小鼠颌骨与脑组织病理变化
骨组织使用 15%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液在室温下脱钙，脱钙完成后，将固定的脑组织与脱钙的的骨组织按顺序置于 70%~100%梯度酒精中脱水，熔融蜡缸中浸蜡包埋，制备3 μm石蜡切片备用。分别进行HE和尼氏染色，再次脱水密封。显微镜镜检，图像采集分析（Nikon）。
1.9 统计学分析
采用GraphPad Prism10.0软件进行数据分析及图形绘制。计量资料以均数±标准差表示。Morris水迷宫逃避潜伏期釆用双因素重复测量方差分析，旷场测试、新物体识别测试、空间探索实验中的穿越平台次数进行正态分析和方差齐性检验，若呈正态分布且方差齐，则运用单因素方差分析，并以LSD法进行组间的两两比较，否则运用非参数检验。当P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠牙周炎模型建立及验证
2.1.1 组织学HE染色结果
CON组牙龈上皮完整，牙槽骨未见吸收破坏及炎细胞浸润，表现为正常牙周组织，P组第一，二磨牙之间牙槽骨吸收破坏，牙周组织炎症细胞浸润，结合上皮向根方退缩，P+Pn组小鼠牙周组织炎症细胞更多，牙槽骨吸收最严重，结合上皮向根方进一步退缩（
图2）。
2.1.2 Micro CT结果
Micro-CT三维重建结果显示：与未放置丝线的对照组（CON）小鼠相比，牙周炎组（P）小鼠第一磨牙、第二磨牙之间牙槽骨发生明显吸收，牙周炎+P菌组（P+Pn）小鼠吸收最严重（
图3）。定量比较两组间上颌第一磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离（CEJ-ABC）距离。牙周炎组（P）小鼠骨高度下降，P+Pn组小鼠骨高度较CON组下降（
P<0.01），牙槽骨破坏严重。
2.1.3 小鼠体质量变化
P组和P+Pn组小鼠牙周结扎造模后体质量开始明显下降，第15天后开始缓慢上升，与CON组相比，P组和P+Pn组体质量明显下降，P+Pn组与CON组存在差异（
P<0.05，
图4）。
2.2 实验性牙周炎对小鼠行为学影响
2.2.1 Pn加剧牙周炎小鼠抗焦虑和运动能力
在中央区的路程占比、时间占比，均是CON组最高，P组降低，P+Pn组占比最低，且各组之间存在差异（
P<0.01）。小鼠在旷场实验中运动总路程显示，CON组距离最长，P组有所下降，P+Pn运动距离最短，差异有统计学意义（
P<0.05，
图5A、B）。
2.2.2 Pn加剧牙周炎小鼠的海马认知能力损伤
P组相较于CON组，与新物体接触的路程占比有所降低（
P<0.05），P+Pn组比P组降低（
P<0.05），与新物体接触的时间及次数占比，P组明显低于CON组（
P<0.05），且P+Pn组低于P组，但差异无统计学意义（
图5C、D）。
2.2.3 Pn加剧牙周炎小鼠学习记忆以及空间认知能力
训练第1天，3组小鼠的潜伏期无明显差异；2~5 d，各组小鼠的平均逃避潜伏期均呈缩短趋势。3组小鼠中，P+Pn组逃避潜伏期最长，CON组最短（
P<0.0001）。与对照组CON相比，P组小鼠表现出更长的潜伏期（
P<0.01）。6 d空间探索实验显示，P+Pn组穿越平台的次数最少，CON组次数最多（
P<0.05，
图5F）。与对照组CON相比，P组穿越平台的次数减少（
P<0.05）。在目标象限的活动时间和路程占比，均是CON组占比最高，P组降低（
P<0.05），P+Pn组最低，但差异无统计学意义（
图5E、G）。
2.3 实验性牙周炎对小鼠海马影响
2.3.1 大脑组织学切片HE 染色结果
HE 染色结果显示：牙周炎6周，CON组海马区神经元结构完整，核仁清晰。P组小鼠海马 CA3 区神经元出现结构破坏，部分细胞出现深染、核固缩、核空泡等现象（
图6A），神经元细胞数量较CON组下降（
P<0.05）；P+Pn组则神经元细胞结构破坏更加严重，正常神经元数量较P组降低（
P<0.05）。
2.3.2 大脑尼氏染色切片
与CON组相比，P组、P+Pn组大鼠海马CA3区神经元结构破坏，Nissl小体及神经元数量明显减少，出现细胞核固缩、核空泡，P+Pn组变性的神经元更多，破坏更严重（
图6B）。
3 讨论
牙周炎作为一种慢性炎症性疾病，与全身多种疾病发生和进展密切相关。已经有大量研究表明牙周炎及其相关唾液菌群与认知障碍密切相关
［5， 15， 16］。有研究报道Pn是牙周炎的主要病原体，并且与阿尔兹海默症相关
［14］，但并未进行实验验证。本研究通过Pn结合牙龈丝线结扎法建立了小鼠牙周炎模型，发现Pn加重了牙周炎的破坏，同时也加重了小鼠记忆、学习等认知功能的损害，这表明Pn菌可能与认知障碍发生发展有关。
牙周炎相关口腔细菌Pn菌如何通过牙周炎诱导神经炎症，本研究采用牙龈丝线结扎联合牙龈致病菌感染的方法构建牙周炎模型，首先用5~0丝线结扎上颌第一磨牙，形成局部牙周袋，并将活细菌涂抹在牙龈缘，相较于钢丝结扎最大限度的减少了对牙周组织的机械损伤。这种方法可以促进牙周袋形成，并提供持续的炎症微环境，促进牙周炎的持续进展。实验结果显示牙槽骨明显吸收，表明我们成功构建了牙周炎模型。结扎法作为牙菌斑机械聚集的促进因子，可导致菌斑的持续积累，引发牙龈免疫反应，表现为炎症细胞的浸润、牙周纤维结缔组织的破坏和牙槽骨吸收
［17， 18］。同时细菌毒素激活大量炎性因子的释放，这些炎症因子及毒素可通过外周血和血脑屏障进入大脑皮层，诱导炎症过程和神经炎症，上调IL-6和IL-21水平
［19-22］。已有研究采用结扎法诱导阿尔茨海默病小鼠模型（3×Tg-AD）牙周炎，出现显著牙槽骨吸收，牙龈中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）基因表达水平升高，同时下丘脑中IL-6显著增加，同时增加了大脑DG区和丘脑区域的Iba-1免疫反应性以及丘脑区域的GFAP免疫反应性
［12］。本研究组织学结果显示正常牙周炎小鼠认知功能检测未见异常，而伴随着牙槽骨吸收、炎细胞浸润等牙周炎症出现，小鼠大脑海马区认知相关测试水平降低，而且Pn加重了牙周炎牙槽骨破坏和牙龈上皮炎症反应，小鼠大脑切片显示海马区神经元细胞损害加重，而对应的小鼠认知障碍进一步加重，这提示Pn菌可能加重对小鼠认知障碍影响。
新物体识别和莫里斯水迷宫是广泛用于评估啮齿动物记忆、学习和空间认知功能的经典试验，这两项任务都涉及海马体和相关区域的完整性，以及前额叶皮层连接，可以用来评估海马依赖记忆时面临的主要问题
［23］。其中脑前额叶皮质功能与认知和行为管理等相关，海马体CA3区在信息的整合和传递过程中发挥着关键作用，此外，海马体CA3区还与GABAA受体和NMDA受体相互作用，这些受体在学习和记忆中也起到了重要的作用
［24］。本研究对Pn菌所致牙周炎6周的小鼠模型进行大脑取材，通过组织学HE和尼氏小体染色观察到其海马CA3区神经细胞变性坏死等病变，病理表型与上述文献报道一致，也与行为学改变一致，首次证明Pn菌诱导的神经细胞损伤破坏了大脑海马体CA3区从而导致了认知障碍，对其认知能力、学习记忆以及空间认知能力造成损害。
目前相对大量的临床观察和流行病学实验证据表明，牙周炎是中枢神经系统疾病的危险因素
［25］。慢性牙周炎和牙龈卟啉单胞菌感染已被确定为痴呆和阿尔兹海默症发生的重要危险因素
［16］。单纯结扎诱导的牙周炎也会对认知造成损害，有研究发现结扎诱导的大鼠牙周炎会导致全身炎症，最终导致认知障碍
［21］。同时牙周炎中失调的促炎细胞可能会诱导炎症和神经炎症
［19， 21］。细菌及其产物如外囊泡和脂多糖可能分别通过三叉神经和牙周血通路易位到到大脑中，导致认知能力下降
［26］。因此我们通过设置单纯结扎组，观察由结扎诱导的牙周炎对认知的影响，由结果推断Pn菌与海马区神经元的关系应该是通过牙周炎介导的，且Pn菌会加重牙周炎，并对小鼠海马体造成进一步损害，具体机制有待进一步探究。
以阿尔兹海默症的为例的认知障碍，其发病机制至今尚未完全阐明，也缺乏有效的治疗手段及药物成为临床上亟待解决的难题。有研究发现牙周炎最常见的致病菌牙龈卟啉单胞菌（Pg）诱发的慢性牙周炎与阿尔兹海默症、心血管疾病和类风湿性关节炎发生相关，并已经在阿尔兹海默症患者的大脑中发现了Pg
［27-29］。本研究推测Pn菌很可能与Pg菌的作用机制相似，由其本身和致病性副产物（如LPS和外囊泡）引起的神经炎症和神经元细胞凋亡，或导致血脑屏障受损
［16， 30， 31］，使细菌及其毒性产物由口腔进入大脑并通过多种途径传播，包括单核细胞感染后在脑部募集
［32］、直接感染和损伤血脑屏障的内皮细胞
［33］、感染并通过颅神经传播（例如嗅觉
［34］或三叉神经）。因此我们推测Pn菌及其毒性产物通过口腔突破血脑屏障进入大脑，导致神经细胞变性或死亡，从而诱导神经炎症，导致认知障碍，使小鼠的学习和记忆能力受损。相关推测有待进一步验证。
综上，本研究结果表明Pn通过加重牙周炎症破坏小鼠大脑海马CA3区神经元数量及细胞结构，对认知能力、学习记忆以及空间认知能力造成损害，导致小鼠出现认知障碍。该研究揭示了牙周炎与牙周炎相关Pn对认知障碍的影响，为未来牙周炎与认知障碍相关疾病的治疗和预防提供了更具有针对性的策略。而有关Pn菌加重牙周炎及认知障碍的分子机制，未来可以通过对使用Pn菌干预后的小鼠口腔菌群进行转录组测序，探究相关分子通路机制，进行进一步的研究和验证，以深入了解Pn菌对牙周炎及认知障碍中的重要作用。
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