金丝桃素通过调节小鼠小胶质细胞内CN-NFAT钙信号通路改善压力应激诱导的抑郁样行为

Hypericin ameliorates stress-induced depressive-like behaviors in mice by modulating the CN-NFAT calcium signaling pathway in microglia

摘要

目的 探究金丝桃素（HY）通过钙调蛋白（CaM）介导引起钙调磷酸酶蛋白（CN）-活化T细胞因子（NFAT）钙信号通路变化调节压力应激引起的抑郁（DP）障碍并研究其机制。 方法 将C57BL/6J小鼠随机分为正常组（Control组）、DP组和DP+HY组（15只/组），行为学测试旷场实验（PFT）、糖水偏好实验（SPT）、悬尾实验（TST）、黑白场实验（LDB）、新奇食物抑制实验（NSFT），免疫组化检测小鼠脑海马体1区（CA1）酪氨酸羟化酶（TH）阳性表达，ELISA检测小鼠血清5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）水平，Western blotting检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-2（IL-2）及CN-NFAT通路相关蛋白表达水平。同时，将小胶质细胞（BV-2）分为Control组、脂多糖（LPS）组、LPS+HY组以及钙调磷酸酶抑制剂（CNIS）组，采用免疫荧光法检测离子钙结合接头分子1（IBA-1）阳性表达，ELISA检测细胞上清液5-HT、NA水平，Western blotting检测炎症因子IL-1β、IL-2和TNF-α以及CN-NFAT通路相关蛋白表达水平。 结果 与Control组相比，DP组小鼠的PFT经过中间区域的次数、SPT糖水消耗率、LDB明暗箱之间的穿梭次数以及NSFT食物的摄食率都降低（P<0.05），TST不动时间增加（P<0.05），TH神经元的数量减少（P<0.05），5-HT和NA的水平减低（P<0.05），促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达水平升高（P<0.05），LPS组的IBA-1表达上升（P<0.05），神经递质水平（NA、5-HT）减少（P<0.05），促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达量升高（P<0.05），与DP组相比，HY组均逆转了上述结果（P<0.05），与LPS组相比，CNIS组与HY组作用相似，对IBA-1表达及神经递质水平（NA、5-HT）和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达量均有逆转作用（P<0.05）。 结论 HY对于压力应激诱导的DP样小鼠和激活态下BV-2的改善作用，可通过靶向降低CN-NFAT钙信号通路表达起有效作用。

Abstract

Objective To investigate the role of the calcium/calmodulin (CaM)-mediated activation of calcineurin (CN)-nuclear factor of activated T cells (NFAT) signaling pathway in mediating the regulatory effect of hyperforin (HY) on stress-induced depression-like disorder (DP) in mice. Methods C57BL/6J mice were randomly divided into control group, DP model group, and hyperforin treatment group (n=15). Behavioral changes of the mice were assessed using open field test (OFT), sucrose preference test (SPT), tail suspension test (TST), light/dark box test (LDB), and novel object suppression test (NSFT). Immunohistochemistry was used to detect tyrosine hydroxylase (TH) expression in the CA1 region of the hippocampus, and serum serotonin (5-HT) and norepinephrine (NA) levels were detected with ELISA. Western blotting was used to analyze the expressions of TNF-α, IL-1β, IL-2, and CN-NFAT pathway proteins. In cultured BV-2 microglial cells with lipopolysaccharide (LPS) stimulation, the effects of hyperforin and CN inhibitor (CNIS) on expressions of ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA-1), 5-HT, NA, inflammatory cytokines and CN-NFAT pathway proteins were examined using immunofluorescence assay, ELISA or Western blotting. Results Compared with the control mice, the mice in DP group showed significantly reduced activity in OFT, decreased sucrose consumption in SPT, reduced shuttle crossing in LDB, and lowered food intake in NSFT with significantly increased immobility in TST. The mice with DP showed significantly decreased TH-positive neurons, lowered 5-HT and NA levels, and increased expressions of TNF-α, IL-1β, IL-2 and CaM-CN-NFAT pathway proteins. In cultured BV-2 cells, LPS stimulation strongly increased cellular IBA-1 expression, decreased the levels of neurotransmitters (5-HT and NA), and increased the levels of inflammatory cytokines and CN-NFAT signaling, and these changes were effectively reversed by treatment with hyperforin or CNIS. Conclusion Hyperforin improves stress-induced depression-like behaviors in mice and activated BV-2 cells by targeting the CN-NFAT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

金丝桃素 / 压力应激 / CN-NFAT信号通路 / 脂多糖 / 抑郁

Key words

hypericin / stress due to pressure / CN-NFAT signaling pathway / lipopolysaccharide / depression

抑郁症（DP）又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是一种常见的复发性精神障碍疾病。该疾病影响着全世界人口的4.4%，且患病率、死亡率日益增高^{［1， 2］}。在中医情志病中，DP障碍属于“郁病”范畴^［3］。中医理论将阳气不足、情志不舒等作为DP发病的主要病因^［4］。其病理特征为大脑相关激素DA、5-HT及NA水平降低^［5］。中医疗法以“疏肝解郁、畅通气机、补益气血、活血化瘀”等作为DP调养原则^［6］。

贯叶连翘为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，为我国传统中药材，具有抗菌消炎、疏肝解郁等功效^［7］。研究表明，贯叶连翘提取物可通过调节T细胞对DP等神经性疾病起作用^［8］。金丝桃素（HY）作为贯叶连翘中含量最多且较为重要的化学成分单体，其可通过激活TRPC6通道并调节神经元可塑性改善DP^{［9， 10］}。小胶质细胞（BV-2）是大脑中的一类巨噬细胞，主要负责免疫反应。近年来的研究揭示，压力应激可激活先天免疫反应，导致炎症因子分泌，诱导神经内分泌和神经化学变化，造成BV-2内Ca²⁺内流，引发胞内钙超载，使CaM与Ca²⁺结合，激活Ca²⁺-CN-NFAT通路；研究表明通过调节BV-2中CN-NFAT钙通路信号水平，可改善DP^［11-15］。因此，异常的CN-NFAT信号传导与神经元凋亡、突触缺陷和神经胶质细胞激活等病理状态有关^［16］。然而目前HY与钙信号通路之间调节DP的相关机制尚未阐明。

综上所述，基于现有研究，通过调节钙信号传导可改善DP的现象，以及压力应激可激活CN-NFAT钙信号通路的发现，我们假设HY的抗DP作用可能与CN-NFAT钙信号通路相关。因此，本实验将验证CN-NFAT信号传导引起小鼠DP样行为和认知改变及BV-2神经炎症变化。基于以上研究探讨HY对压力应激诱导的DP小鼠及激活态下BV-2的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

C57BL/6J雄性6周龄小鼠45只，分笼饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级环境，5只/笼，饲养温度恒定于（20±5） ℃，湿度（50±5）%，12 h明暗循环，自由饮水进食。实验动物处理遵守中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会要求（伦理批号：FJTCM IACUC2023323）。

1.1.2 细胞培养

BV-2复苏后使用F12/DMEM培养基加入10%胎牛血清在37 ℃，5%CO₂培养箱中进行培养，隔天换液，每隔2 d传代，显微镜下观察细胞的形态，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.1.3 药物

HY（阿拉丁）；LPS（索莱宝）；NFAT1、NFAT4抗体（上海优宁维生物科技股份有限公司）；CN（proteintech）；CaM、IL-2、重组Anti-IL-1 beta抗体、TNF-α、TH（Abcam）；胎牛血清（上海吉泰依科赛生物科技有限公司）。

1.1.4 仪器

旷场箱、摄食实验纸盒、黑白箱子、小鼠饮水器、石蜡切片机、烘片机、电热恒温鼓风干燥机、光学显微镜、高速冷冻离心机、磁力搅拌器、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、半薄切片机、超薄切片机、H7650型透射电子显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验

1.2.1.1　动物分组、造模及干预

小鼠适应喂养1周后，按随机数表法将C57BL/6J小鼠分为Control组、DP组及HY组，15只/组。Control组小鼠进行等量生理盐水灌胃，根据小鼠质量确定并调整灌胃剂量，连续灌胃4周；DP组对小鼠进行慢性不可预见性应激（CUMS）造模连续4周包括：笼子倾斜45 °（24 h）、禁食（48 h）、在4 ℃水环境下游泳5 min、身体束缚（2 h）、湿床用品（24 h）和夜间照明。连续4周每日随机给予压力源，连续2 d不给予相同的压力源。在整个实验过程中，对照组小鼠都被安置在一起，没有受到任何这些压力刺激。HY组每日先进行压力刺激后用50 mg/kg HY进行灌胃。

1.2.1.2　行为学观察

实验前及第36天给予压力刺激4 h后，分别对各组小鼠进行行为学测试。包括：糖水偏好实验、旷场实验、悬尾实验、黑白场实验和新奇食物抑制实验。

旷场实验（OFT）：开始时将测试大鼠放入测试箱中心点，记录5 min内大鼠的自发活动。测试箱为30 cm×30 cm×40 cm的塑料箱，底部黑色，四壁白色，采集指标为中心区的经过时间。结果由Top Scan^TM2.0软件进行分析。

糖水偏好实验（SPT）：第1个24 h，两瓶水均为质量分数为1%蔗糖水；第2个24 h，1瓶为纯水，1瓶为蔗糖水；第3个24 h，禁水不禁食；第4个24 h开始正式测试，即每只小鼠分别给予1瓶纯水，1瓶蔗糖水，24 h后测量各组小鼠糖水和纯水消耗量，按公式1计算糖水偏好率。糖水偏好率%=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%（公式1），结果由Top Scan^TM2.0软件进行分析。

悬尾实验验（TST）：小鼠被一个在声音和视觉上都隔离的钩子吊着，钩子离地面50 cm。钩子放在离尾巴尖约1 cm的地方。将小鼠被悬挂6 min，录制视频6 min，取后4 min记录并分析不动时间。不动时间增加表示无助水平升高。结果由Top Scan^TM 2.0软件进行分析。

黑白场实验（LDB）：将小鼠放入40 cm×40 cm×40 cm暗箱正中，头部对着通道口方向，迅速盖上盖子，观察5 min。观察指标为明箱与暗箱之间的穿梭次数，其中小鼠在明暗箱中一次探索行为的开始或结束的标准是：以小鼠4足完全进入明箱或暗箱，实验结束后将小鼠放回笼内，清理留在装置上的粪便和尿液，并用75%医用酒精溶液擦拭，待酒精挥发完全或用干布擦干后再进行下一只小鼠的测试。结果由Top Scan^TM 2.0软件进行分析。

新奇食物抑制实验（NSFT）：先进行食物控制，在试验前1 d，将实验动物单独放入新的笼子中，对其进行食物剥夺，但要确保充足的饮水。食物剥夺时间通常为18~24 h。设置一个新的环境，让场地与实验动物的原饲养环境有显著差异。场地中央放置一个含有新奇食物的容器。将实验动物放入新环境中，并开始计时。记录动物在实验期间的摄食量。实验时间通常为5 min。结果由Top Scan^TM 2.0软件进行分析。

1.2.1.3　动物取材

在最后1次给药后，隔夜禁水不禁食，采用20 %乌拉坦腹腔注射麻醉，摘眼球、取血，随后将小鼠置于冰上，剖取脑海马体-80 ℃冰箱保存备用。用于免疫组化实验的小鼠心脏灌注后取全脑，固定于4 %多聚甲醛中。

1.2.1.4　免疫组化检测TH阳性表达

处死小鼠，取脑组织，于4 %多聚甲醛中固定24 h。脑组织进行常规脱水、包埋、切片，厚度约5 μm，进行常规脱蜡和水化。滴加3%H₂O去离子水孵育10 min；滴加山羊血清封闭液2 h；滴加一抗放入湿盒中4 ℃过夜；次日滴加反应增强液室温孵育20 min；滴加酶标抗鼠IgG聚合物室温孵育30 min；DAB显色液显色，用中性树胶进行封片。待中性树胶干燥后置于光学显微镜下观察阳性表达。

1.2.1.5　ELISA检测血清5-HT、NA水平

小鼠麻醉后眼球取血，静置后以3000 g，离心15 min（离心半径为16 cm），吸取血清。按酶免ELISA试剂盒操作步骤稀释标准品、加样、温育洗涤，加入酶标试剂，再次温育洗涤。加入显色剂37 ℃避光显色10 min，终止反应后450 nm波长测量各孔的吸光度A。绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.2.1.6 Western blotting检测CaM、CN、NFAT1和NFAT4以及IL-β、IL-2和TNF-α蛋白表达

将海马标本充分剪碎，加入RIPA裂解液使其充分裂解。转入高速离心机以获取上清液，采用BCA法检测样品中总蛋白浓度。制备浓缩胶及分离胶，向SDS-PAGE上样孔滴加待测样品，设置好参数后开始电泳。待电泳结束，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原。充分漂洗后，加入一抗（CaM、NFAT1、NFAT4、IL-β、IL-2和TNF-α抗体浓度均为1∶1000；CN抗体浓度为1∶5000），4 ℃冰箱中孵育过夜。次日，将膜取出并漂洗后，加入二抗（1∶5000），常温下孵育1 h。孵育完毕后，漂洗，用ECL液显影，上机曝光、拍照。

1.2.2 细胞实验

1.2.2.1　细胞分组及干预

取对数期、状态良好的BV-2细胞混悬液，接种于10 cm大皿中（4×10⁷ /L），当BV-2细胞生长至80%融合度时，加入HY（浓度为2 μg/mL）预处理12 h，再加入1 μg/mL的LPS刺激BV-2细胞12 h。将BV-2细胞分为4组，分别为Control组、LPS组、HY+LPS组、CNIS（浓度为1 μg/mL）组。处理结束后，收集各组细胞上清液或提取细胞蛋白作为后续实验检测样本。

1.2.2.2　免疫荧光指标检测IBA-1阳性表达

HY+LPS组用HY预处理24 h后，加入LPS至终浓度为1 μg/mL，作用12 h，与LPS组相同。然后用PBS洗涤细胞1次，固定液固定15 min，洗涤3次，加入免疫染色封闭液中，室温封闭1 h。IBA-1一抗孵育并洗涤3次，二抗孵育，洗涤，与4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色剂孵育，洗涤，封闭后对切片进行拍照。

1.2.2.3　ELISA检测细胞内5-HT、NA的水平

将细胞接种于24孔板中，分为空白组、LPS组、HY+LPS组及CNIS组培养24 h。吸出上清液，后续方法同上。

1.2.2.4 Western blotting检测CaM、CN、NFAT1和NFAT4以及IL-β、IL-2和TNF-α蛋白表达

各处理组细胞加入100 μL裂解液，裂解，离心，收集上清，检测蛋白浓度，后续方法同上。

1.2.3 统计学分析

本研究采用SPSS 27.0、GraphPad Prism 9.0等统计软件进行数据分析和统计制图，检验水准α=0.05，双侧检验。计量资料服从正态分布，组间比较采用t检验或单因素方差分析结合LSD法多重比较；多个时间点测量数据采用重复测量资料方差分析。若计量资料数据不服从正态分布组间比较采用秩和检验。计数资料以例（率）表示，行χ²检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物实验结果

2.1.1 HY对小鼠DP样行为的影响

与Control组相比，DP组小鼠的PFT经过中间区域的次数、SPT糖水消耗率、LDB明暗箱之间的穿梭次数以及NSFT食物的摄食率降低（P<0.05），TST不动时间明显升高（P<0.05），DP组相比，HY组的PFT经过中间区域的时间、SPT糖水消耗率、TST不动时间、LDB明暗箱之间的穿梭次数、NSFT食物的摄食率都有明显增强（P<0.05），TST不动时间明显降低（P<0.05，图1）。

2.1.2 HY对小鼠海马TH神经元及5-HT、NA神经递质水平的影响

与Control组相比，DP组小鼠TH神经元的数量明显减少、5-HT和NA的水平减低（P<0.05）；相反，HY组小鼠TH神经元数量、5-HT、NA神经递质代谢水平增加（P <0.05，图2）。

2.1.3 HY对促炎细胞因子及CaM-CN-NFAT钙信号通路的影响

DP组促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达水平较Control组升高（P <0.05）；与DP组相比，HY组海马促炎细胞因子和CaM-CN-NFAT钙信号通路蛋白表达降低（P <0.05，图3）。

2.2 细胞实验结果

2.2.1 HY对BV-2中IBA-1表达及5-HT、NA神经递质水平影响

与Control组相比，LPS组IBA-1表达显著上升（P<0.05），5-HT、NA神经递质水平明显减少（P<0.05）；而与LPS组相比，HY组及CNIS组的IBA-1表达明显降低（P<0.05），5-HT、NA神经递质水平增强（P<0.05，图4）。

2.2.2 HY对BV-2中促炎细胞因子及CaM-CN-NFAT钙信号通路的影响

通过Western blotting测定BV-2中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达水平。LPS组促炎细胞因子及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达量较Control组升高（P<0.05）；与LPS组相比，HY组及CNIS组TNF-α、IL-1β和IL-2及CaM-CN-NFAT钙信号通路的蛋白表达降低（P<0.05，图5）。

3 讨论

贯叶连翘具有疏肝理气之功效，常被用于治疗中医情志类疾病^［17］。它含有多种化学成分，其中含量最多也较为重要的化学成分为HY^［18］，相关药理学研究发现其在抵抗炎症、降血脂、抗肿瘤、缓解DP、抗阿兹海默疾病等方面作用显著^［19］。有研究证实，HY可通过调节相关通路蛋白、改善脑神经元以及影响神经递质的活性来缓解DP。因此，我们探讨HY对于压力应激诱导的DP行为进行研究。本实验选用压力应激构建小鼠DP模型，体外LPS诱导BV-2神经炎症，分别给予HY干预，在动物及细胞水平上探索DP的发病机制。

压力应激是DP的重要致病因素之一，DP样行为与压力应激诱发的海马炎症和BV-2焦亡密切相关，且会造成内质网应激、线粒体功能障碍等导致钙超载^{［15， 20］}。细胞经LPS处理后，先天免疫细胞上的模式识别受体（PRR）通过识别病原体相关分子模式（PAMP）来感知微生物的存在，Toll样受体（TLR）是主要的PRR^［21］。TLP通过识别LPS，诱发BV-2炎症，引起神经毒性，引发诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和炎症因子的产生，诱导钙超载，激活CN-NFAT钙信号通路，导致DP等神经退行性疾病；同时炎症因子还会增加吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）的活性，导致5-HT水平下降^［22-24］。相关研究结果发现，HY可以通过调节神经内分泌系统和降低神经炎症来治疗DP^［25］。

神经炎症与DP机体大脑血清素系统等多种认知功能的表现密切相关^［26］。研究发现，IL-1β可抑制神经元的再生，使海马学习、记忆和神经可塑性退化，且过度表达可激活HPA轴，导致糖皮质激素水平升高^{［12， 27］}。TNF-α导致细胞和组织损伤，使色氨酸分解代谢增加以及5-HT合成减少，诱发DP样行为^{［22， 28， 29］}。压力应激可通过诱导机体炎症，造成Ca²⁺内流，引发胞内钙超载，使CaM与Ca²⁺结合，激活CN的表达^{［14， 30］}。CN通过去磷酸化激活NFAT^{［31， 32］}，诱导NFAT从细胞质易位到细胞核和DNA结合位点，促进NFAT依赖性IL-2基因表达，导致大脑海马区神经元受损^［33］，进而造成机体长期DP。TH是DA和NA生物合成的限速酶，其活性失常使DA与NA的功能障碍导致的DP等神经病理状况有关^{［34， 35］}。IBA-1是一种细胞质蛋白，被认为是泛BV-2标记物。一些研究已经证明其表达与BV-2活化和炎症相关^［36］。本研究结果显示，压力应激诱导小鼠后，炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-2）递质水平明显上升，TH、5-HT、NA递质水平明显下降，CaM-CN-NFAT蛋白表达明显增加，HY可逆转上述结果，表明HY能降低机体DP样状态，增强机体免疫能力。LPS处理细胞后IBA-1水平明显增高，5-HT、NA递质水平降低，CaM-CN-NFAT蛋白表达显著增加，使用HY后，上述结果可逆转，表明HY能够减少细胞神经炎症水平，降低钙信号通路水平，抑制钙超载；同时采用CNIS干预细胞后，上述结果与HY干预相似。以上结果从分子水平上表明，HY可有效降低压力应激处理的DP模型小鼠和LPS处理的BV-2神经炎症水平，抑制CN-NFAT钙信号通路表达，得出HY改善DP样行为可能与抑制CN-NFAT激活有关。

综上所述，HY对于压力应激诱导的DP样小鼠和炎性激活的BV-2具有明显的改善作用，提高神经细胞存活率，提高DP障碍相关神经递质的表达，减轻体内、外神经炎症。其改善压力应激诱导的DP样行为可能与抑制钙超载及CaM-CN-NFAT通路的激活有关。研究表明，压力脆弱性和恢复力与免疫改变之间存在多个层面的联系，自主神经系统和HPA轴在协调身体对危险的反应中发挥着关键作用^［37］。基于此，我们在今后的研究会更加关注小鼠早期DP压力恢复与神经免疫之间的作用机理。

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