槲皮素促进应激颗粒G3BP1解聚改善HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞神经毒性

Quercetin mitigates HIV-1 gp120-induced rat astrocyte neurotoxicity via promoting G3BP1 disassembly in stress granules

摘要

目的 探究槲皮素（QC）在HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞神经毒性中的抑制作用及机制。 方法 分离原代星形胶质细胞作为细胞模型，将细胞分为对照组、QC组、HIV-1 gp120组和梯度剂量QC治疗组。免疫荧光法观察应激颗粒（SGs）形成。氧化应激标志物水平和相关蛋白表达水平分别使用特异性试剂盒和Western blotting测定。HIV-1 gp120转基因小鼠（Gp120 tgm）灌胃50 mg/kg QC治疗4周。随后进行行为学评价实验，取血清进行氧化应激指标检测，取脑组织进行免疫组化染色与Western blotting分析。 结果 体外实验中，QC减少星形胶质细胞中的SGs（P<0.05），提高抗氧化指标水平（P<0.05），同时降低氧化物质水平（P<0.001），并且上调与SGs解聚相关的蛋白水平（P<0.05）。在体内，QC改善了Gp120 tgm的认知功能障碍表现，缓解氧化应激（P<0.05），促进SGs解聚相关蛋白表达（P<0.05）。 结论 QC通过抑制氧化应激，促进SGs解聚蛋白表达和SGs解聚，减轻HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞毒性和改善认知功能。提示QC具备作为HIV-1相关神经认知障碍的治疗药物的潜力。

Abstract

Objective To explore the effect of quercetin for mitigating HIV-1 gp120-induced astrocyte neurotoxicity and its underlying mechanism. Methods Primary rat astrocytes were isolated and treated with quercetin, HIV-1 gp120, or gradient concentrations of quercetin combined with HIV-1 gp120. The formation of stress granules (SGs) in the treated cells was observed with immunofluorescence assay, and the levels of oxidative stress markers and protein expressions were measured using specific assay kits and Western blotting. HIV-1 gp120 transgenic mice were treated with quercetin (50 mg/kg) by gavage for 4 weeks, and the changes in cognitive functions and oxidative stress levels were examined by behavioral assessments, oxidative stress index analysis in serum, and immunohistochemical and Western blotting of the brain tissue. Results In primary rat astrocytes, treatment with quercetin significantly reduced HIV-1 gp120-induced SG formation, increased the levels of antioxidant indexes, decreased the levels of oxidative substances, and up-regulated protein level associated with SG depolymerization. In the transgenic mouse models, quercetin obviously improved the cognitive function of the rats, reduced oxidative stress levels, and promoted the expression of proteins associate with SG depolymerization in the brain tissues. Conclusion Quercetin mitigates HIV-1 gp120-induced astrocyte neurotoxicity and cognitive function impairment by inhibiting oxidative stress, enhancing expressions of SG depolymerization-related proteins, and promoting SG disassembly, suggesting the value of quercetin as a potential therapeutic agent for neuroprotection in HIV-associated neurocognitive disorders.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / 星形胶质细胞 / 应激颗粒 / 氧化应激 / HIV-1 gp120

Key words

quercetin / astrocyte / stress granules / oxidative stress / HIV-1 gp120

自抗逆转录病毒疗法广泛应用以来，HIV-1感染者的预期寿命延长，但新的挑战随之出现^［1］。HIV-1感染者出现一组以神经病变、痴呆和认知功能损害为特征的症候群，称为HIV-1相关神经认知障碍（HAND）^［2］。研究认为HIV-1包膜糖蛋白gp120与HAND病理密切相关，但具体机制仍不明确，目前研究聚焦于HIV-1 gp120通过刺激胶质细胞，释放炎症因子引起神经炎症最终导致神经认知障碍^［3］。氧化应激通常发生在如阿尔兹海默症、帕金森病等神经退行性疾病中，是神经退行性疾病进展过程中的固有表现^［4］。应激颗粒（SGs）是真核细胞在应激条件（氧化应激、高温刺激、营养耗竭等）下，以Ras GTP酶活化蛋白结合蛋白1（G3BP1）为核心形成的液滴状复合体^［5］。G3BP1的过表达或敲低能够诱导SGs组装或形成的数量和大小降低，是针对SGs研究的标志物^［6］。应激条件长期存在时，SGs持续性存在，转化为不溶性病理性SGs，已被证明与额颞叶痴呆症及肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病的发生具有密切关系^{［7， 8］}。不溶性SGs可作为异常蛋白复合物在神经退行性疾病的发生发展中发挥作用，而目前研究对病理性SGs在HAND发生发展中的作用了解有限。

槲皮素（QC）是一类天然存在于植物中的黄酮类化合物，在苹果果皮、洋葱、石斛等植物中蕴含含量较高^［9］。石斛在我国传统医药中被用于治疗多种疾病，包括恶疮，瘰疬，痢疾，肠风下血，并在药理研究中显示出了丰富的药理学作用，主要特性包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等^［10］。研究表明QC在阿尔兹海默症、帕金森病等神经退行性疾病的研究中通过调节氧化应激发挥神经保护作用，改善神经认知障碍^［11-13］。QC能够激活Nrf2/HO-1信号，调节氧化应激，减少活性氧的积累，维持细胞稳态，保护细胞免受氧化损伤^［14-16］。氧化应激作为神经退行性疾病常见的病理过程，QC对于由HIV-1 gp120诱导的HAND是否具有改善作用，尚未有相关报道。

目前研究对于HIV-1 gp120诱导星形胶质细胞内SGs形成以及QC对HIV-1 gp120诱导的HAND的改善作用暂无报道。课题组前期研究发现星形胶质细胞活化在HIV-1 gp120诱导的HAND病程中有密切联系^{［17， 18］}。本研究以原代培养的星形胶质细胞作为体外研究细胞模型，探究HIV-1 gp120对星形胶质细胞SGs形成及QC对SGs的清除作用，及QC通过清除SGs改善HAND的潜在机制，并以HIV-1 gp120转基因小鼠模型（Gp120 tgm）为HAND动物模型，验证QC对HIV-1 gp120所诱导HAND的改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 大鼠原代星形胶质细胞提取纯化及培养

实验前使用多聚赖氨酸溶液包被培养瓶。取3 d龄SD大鼠（性别不限）10只（南方医科大学实验动物中心），75%酒精消毒5 min，剥离头骨，暴露并分离全脑组织，去除嗅球、小脑及中脑，剥除软脑膜。剪碎脑组织，加入0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液，移入细胞培养箱，消化20 min。DMEM/F12完全培养基终止消化，1500 r/min离心10 min。完全培养基重悬细胞，经70 μm细胞筛网滤除组织碎块，接种于75 cm²细胞培养瓶，转移至37 ℃、5% CO₂的细胞培养箱。第2天更换新鲜完全培养基继续培养，之后3 d/次更换新鲜完全培养基。培养7 d后进行星形胶质细胞纯化。细胞培养瓶置于37 ℃恒温摇床上，250 r/min震荡处理2 h，更换新鲜培养基继续培养，待细胞密度达80%时传代培养，以传代3代以内、状态良好的细胞进行实验。

1.1.2 实验动物

Gp120 tgm（性别不限，12月龄）由美国南加州大学洛杉矶儿童医院Saban研究所惠赠，遗传背景为C57BL/6J，携带HIV-1 gp120毒力因子，以GFAP为启动子在星形胶质细胞中高表达可溶性HIV-1 gp120，可诱导产生神经毒性，诱导模型动物产生认知障碍，可作为HAND模型使用^［19］。相同遗传背景的C57BL/6J野生型小鼠购买于南方医科大学实验动物中心。所有动物实验均经南方医科大学实验动物中心伦理委员会审核批准（伦理批号：2015029）。

1.3 主要试剂及仪器

DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Gibco），胎牛血清（FBS）（Pricella），HIV-1 gp120蛋白质（SinoBiological），槲皮素（aladdin），总超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（WST-1法）、丙二醛（MDA）检测试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒、过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒、过氧化物（H₂O₂）检测试剂盒（Elabscience）、CCK-8试剂盒（GLPbio），活性氧（ROS）荧光法检测试剂盒（APE×BIO），G3BP1多克隆抗体、GFAP多克隆抗体（Proteintech）、HSP70单克隆抗体（Abmart）、HSP90多克隆抗体、LC3B多克隆抗体、p62多克隆抗体（Abmart），β‑actin单克隆抗体（Solarbio），山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech）。

恒温培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）、酶标仪（Tecan）、化学发光凝胶成像系统（UVP）、荧光显微镜（Nikon）、倒置激光共聚焦显微镜（Carl Zesis）、SDS-PAGE凝胶电泳仪（Bio-rad）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞给药

QC粉末以DMSO溶解完全。原代星形胶质细胞在37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养24 h，随后更换新鲜培养基，HIV-1 gp120组加入150 pmol/L HIV-1 gp120蛋白，在梯度浓度QC治疗组中分别给予1、4、8 μmol/L的QC与150 pmol/L HIV-1 gp120蛋白，处理24 h后收集细胞蛋白并检测相关指标。

1.4.2 动物分组及处理

选取健康C57BL/6J小鼠3只与Gp120 tgm 6只设为对照组（WT）、阳性对照组（Gp120 tgm）与QC治疗组（QC）。QC组每日灌胃50 mg/kg剂量的QC混悬液，WT组与Gp120 tgm组灌胃0.9%生理盐水，持续4周。造模结束后，进行水迷宫与旷场实验评估各组小鼠认知功能障碍情况。麻醉处死小鼠，取血清及全脑组织以备后续实验。

1.4.3 CCK-8细胞增殖与毒性实验

原代星形胶质细胞接种于96孔板，每组设置6个复孔，按照100 μL/孔加入CCK-8应用液，在37 ℃下培养1 h，用酶标仪量各孔的吸光值A_{450 nm} ，计算细胞存活率。计算公式为：细胞存活率（%）=（A_实验组 -A_空白孔）/（A_对照组 -A_空白孔）×100%。

1.4.4 免疫荧光定位SGs形成

各组细胞以预冷PBS洗涤3次后，经4%多聚甲醛固定20 min、Triton X-100通透10 min、山羊血清封闭60 min后，G3BP1一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶500）孵育1 h，封片后于倒置激光共聚焦显微镜下采集图像。

1.4.5 总蛋白提取

各组细胞经PBS洗涤3次后，加入300 μL含1% PMSF的RIPA裂解液，冰上静置20 min；称取各组小鼠40~50 mg脑组织，加入裂解液，匀浆完全后冰上静置20 min。收集蛋白裂解液，4 ℃，12 000 g离心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白测定试剂盒说明书检测总蛋白浓度。加入上样缓冲液，100 ℃金属浴5 min变性蛋白。

1.4.6 Western blotting检测相关蛋白表达水平

使用12.5% SDS-PAGE电泳体系分离蛋白。在恒定电流0.25 A条件下将蛋白从凝胶转移至PVDF膜。封闭液封闭60 min。封闭结束转移至一抗工作液（1∶1000）中，4 ℃过夜孵育。次日，使用TBST洗膜后加入二抗工作液（1∶5000），室温孵育60 min。TBST洗去残余二抗工作液后转移至化学发光凝胶成像系统中采集图像数据，Image J软件计算蛋白相对表达水平。

1.4.7 氧化应激相关指标检测

收集小鼠血清及星形胶质细胞匀浆，按照试剂盒说明书方案，测量吸光度并计算样本SOD、CAT蛋白活性与GSH、MDA、H₂O₂含量。ROS的检测使用ROS检测试剂盒（荧光法），按照试剂盒说明书，检测各组细胞ROS水平，使用Image J软件分析荧光强度。

1.4.8 行为学实验

干预结束后，对各组小鼠进行水迷宫实验（MWM）和旷场实验（OFT）。通过摄像设备采集小鼠的运动轨迹、移动速度和距离等参数评估小鼠认知功能障碍程度。MWM：获得性训练期间保留水下平台训练5 d，记录逃避潜伏期、游泳速度等参数。获得性训练结束后的第2天，撤除水下平台，开始空间探索实验，记录60 s内小鼠的运动轨迹，计算游泳速度、平台穿越次数、目标象限停留时间等参数，评价各组小鼠空间学习能力差异。OFT：所有小鼠均置于安静的测试环境，适应60 min。将小鼠放入40 cm×40 cm旷场箱中心，进行录制，计时5 min。分析小鼠在实验期间的活动轨迹，计算旷场中心活动时间、活动距离、排便次数等参数，评估各组小鼠焦虑程度。

1.4.9 免疫组化检测脑组织SGs形成情况

石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。经柠檬酸钠进行抗原热修复后，加入3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶10 min，山羊血清封闭60 min。滴加稀释后的G3BP1一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜。PBS冲洗切片3次，5 min/次，随后加二抗（1∶200），37 ℃孵育30 min。用PBS冲洗3次，5 min/次。用二氨基联苯胺显色液显色1~3 min，显微镜下控制反应。苏木素液复染细胞核1 min。中性树脂封片后于显微镜下收集图像，使用Image J软件分析图像数据。

1.4.10 统计学方法

数据分析统计使用SPSS 25.0软件，采用GraphPad Prism 9.5.0制作统计图表。进行正态性检验和方差齐性检验，均满足的条件下多组比较采用单因素方差分析，计量资料以均数±标准差表示，所有实验均重复至少3次，P<0.05（双侧）认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 QC与HIV-1 gp120对星形胶质细胞活力的影响

与空白对照组相比，1~8 μmol/L QC对星形胶质细胞存活率无明显改变（P>0.05），高浓度（16~64 μmol/L）QC处理降低星形胶质细胞活力（P<0.001，图1A）。HIV-1 gp120可诱导星形胶质细胞毒性（P<0.01），在加入梯度浓度QC处理后细胞活力提升（P<0.01，图1B）。

2.2 QC降低星形胶质细胞中SGs阳性细胞比例

G3BP1免疫荧光结果显示，与对照组相比，HIV-1 gp120组SGs阳性细胞比例显著增加，G3BP1荧光强度升高（P<0.001，图2A~C），G3BP1蛋白表达量提升（P<0.05，图2D、E）；在QC干预后SGs阳性细胞比例、G3BP1荧光强度和G3BP1蛋白表达量均降低（P<0.05，图2）。

2.3 QC通过减轻氧化应激上调促SGs解聚蛋白表达

在体外实验中，与对照组相比，HIV-1 gp120组SOD酶活力无明显差异（P>0.05），CAT酶活力、GSH含量降低（P<0.01），H₂O₂、MDA含量与ROS水平升高（P<0.01，图3A、B）；加入QC治疗后，相较于HIV-1 gp120组，星形胶质细胞中CAT酶活力与GSH、MDA含量及ROS水平均恢复至正常水平（P<0.05），H₂O₂含量降低且低于对照组水平（P<0.05，图3A、B）。Western blotting结果显示，HIV-1 gp120诱导星形胶质细胞HSP70与HSP90表达降低（P<0.05）；加入QC处理后上调星形胶质细胞LC3 Ⅱ、HSP70与HSP90蛋白表达，下调p62蛋白表达，差异具有统计学意义（P<0.05，图3C）。

在体内水平，相较于WT组，Gp120 tgm组血清中SOD酶活力无明显区别（P>0.05），CAT酶活力与GSH含量降低（P<0.01），H₂O₂、MDA含量升高（P<0.001）；与Gp120 tgm组相比，QC组CAT酶活力、GSH含量明显增加（P<0.01），H₂O₂与MDA含量明显降低且恢复至WT组水平（P<0.001，图4A）。与WT组相比，Gp120 tgm脑组织中LC3、p62和HSP90蛋白表达无差异（P>0.05），HSP70表达量升高（P<0.001）；与Gp120 tgm组相比，QC组LC3、HSP70、HSP90表达量升高（P<0.05），p62蛋白表达降低（P<0.01，图4B）。

2.4 QC降低Gp120 tgm脑组织SGs水平改善HIV-1 gp120诱导的认知功能障碍

在Gp120 tgm组脑组织免疫组化切片中，G3BP1阳性率增加（P<0.001），G3BP1蛋白表达升高（P<0.01）；与Gp120 tgm组相比较，QC组脑组织切片G3BP1阳性率减少（P<0.001），G3BP1蛋白表达降低（P<0.01，图5）。此外，在Morris水迷宫实验中，相较于WT组，Gp120 tgm组在目标象限滞留时间与穿越平台次数降低（P<0.05）；相比于Gp120 tgm组，QC组目标象限滞留时间与穿越平台次数提升（P<0.05，图6A~C）。旷场实验结果显示，与WT组相比，Gp120 tgm组在旷场中的总移动距离、进入中心区域次数、中心区域移动距离与停留时间均减少（P<0.01），排便次数增加（P<0.01）；同Gp120 tgm组相比，QC组总移动距离、进入中心区域次数、中心区域移动距离与停留时间上升（P<0.05），排便次数下降（P<0.05，图6D~I）。

3 讨论

HIV-1能够穿过血脑屏障，通过结合宿主细胞表面受体，释放炎症因子，诱导氧化应激，导致神经元损伤和炎症反应，进而加剧认知和运动障碍，导致神经退行性变化，影响患者的生活质量^［20-22］。星形胶质细胞占神经胶质细胞的90%，表达HIV-1感染与依附所需的受体，是HIV-1在大脑中的重要靶细胞之一^［23］。在前期研究中，HIV-1 gp120诱导星形胶质细胞反应性活化，释放IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子，产生神经毒性，破坏神经系统^{［17， 18］}。本研究使用原代星形胶质细胞作为细胞模型，以Gp120 tgm作为HAND动物模型，探索并验证了QC在HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞毒性中的保护作用，揭示了QC可能作为治疗HAND的潜在药物的新机制。本研究结果表明，QC处理显著改善了星形胶质细胞的活力，并促进SGs的清除及其相关蛋白的表达。此外，QC还通过减轻氧化应激反应、调节SGs解聚相关蛋白表达，保护星形胶质细胞免受HIV-1 gp120诱导的氧化损伤。

根据课题组前期实验结果，150 pmol/L HIV-1 gp120处理24 h降低原代星形胶质细胞活力^［18］。在0~8 μmol/L浓度范围内，QC对星形胶质细胞的活力没有影响，表明在24 h处理期内，0~8 μmol/L是QC处理星形胶质细胞的安全应用浓度范围。根据上述结果，本研究设定0、1、4、8 μmol/L作为QC的处理浓度，处理时间设定为24 h，作为体外细胞模型的条件。在HIV-1 gp120存在的条件下，QC处理提高了星形胶质细胞存活率，提示QC可能通过减轻HIV-1 gp120的毒性效应来保护星形胶质细胞。

SGs定位于细胞质内，是细胞内的小体，含有神经递质和蛋白质，参与细胞间的信号传导和细胞生存，在神经退行性疾病中扮演重要角色。在神经退行性疾病如额颞叶痴呆症^［7］、肌萎缩侧索硬化症^［8］、阿尔茨海默病^［24］及帕金森病^［25］中，SGs的异常聚集和功能异常导致神经元损伤和死亡，加剧疾病进程^［26］。然而，鲜少有关于SGs的形成与持续留存在HIV-1 gp120诱导的HAND发生发展中的作用及机制报道。G3BP1的过表达或敲低能够诱导SGs组装或形成的数量和大小降低^［6］，是针对SGs研究的标志物。本研究使用G3BP1作为SGs形成的标志物，观察到HIV-1 gp120增加了SGs阳性细胞的比例和G3BP1的荧光强度与蛋白表达量，表明HIV-1 gp120诱导了星形胶质细胞内SGs形成，并上调了G3BP1蛋白的表达水平。QC干预后，我们观察到SGs阳性细胞比例、G3BP1荧光强度和G3BP1蛋白表达量均降低，说明QC能有效促进SGs的清除与抑制HIV-1 gp120诱导的SGs的累积。

氧化应激是神经退行性疾病进展过程中的固有表现^［4］，也是联通SGs与神经退行性疾病的桥梁^［27］。真核细胞启动针对应激源迅速启动固有防御机制，形成SGs^{［28， 29］}。应激源包括但不限于氧化应激、营养耗竭、高温刺激、病毒入侵等。本研究使用SOD、CAT酶活力以及GSH、H₂O₂、MDA含量作为评估各组氧化应激指标。结果显示，HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞显示出明显的氧化应激反应，抗氧化系统受损，表现为CAT酶活力和GSH含量的降低，H₂O₂、MDA含量以及ROS水平的显著升高。这些变化反映了细胞内氧化还原稳态失衡的状态。相反，QC处理能够改善上述现象至正常水平，减少了H₂O₂和MDA的积累，表明QC通过调节星形胶质细胞的氧化还原平衡，保护星形胶质细胞免受HIV-1 gp120诱导的氧化损伤。此外，体内实验结果同样支持上述结论。SGs的解聚依赖于热休克蛋白（HSP）分子伴侣和细胞自噬的协同作用，借助热休克蛋白去除SGs的外壳^{［30， 31］}，通过细胞自噬途径解聚SGs的核心^{［32， 33］}。本研究在体内外水平检测细胞自噬标志物LC3与p62蛋白以及HSP70和HSP90等与SGs解聚相关的蛋白表达水平，结果表明，QC可促进星形胶质细胞与Gp120 tgm脑组织HSP70与HSP90的表达，提高细胞自噬水平，提示QC具备促进SGs解聚的能力。

QC已被证明在部分神经退行性疾病中具有神经保护作用。Sharma等^［34］发现，QC有助于促进细胞抗氧化与抗炎作用，以此对鱼藤酮和铁补剂诱导的帕金森病模型发挥神经保护作用。通过行为学实验结果进一步验证了QC在HIV-1 gp120诱导的认知障碍中的神经保护作用。既往研究表明，Gp120 tgm的认知功能障碍程度与月龄增长呈正相关，在12月龄时达到顶峰^［18］。在Morris水迷宫实验和旷场实验中，QC处理改善了Gp120 tgm的认知功能，缓解焦虑样行为，表现为目标象限滞留时间、穿越平台次数提高，以及在旷场中趋向于中心区域探索的活动表现。免疫组化与Western blotting分析进一步证实，QC处理降低了Gp120 tgm脑组织中G3BP1阳性细胞的比例和G3BP1蛋白的表达水平，这与其在细胞水平上得出的结果一致。因此QC可通过抗氧化机制改善认知功能和情绪状态，改善Gp120 tgm脑组织中SGs稽留情况，在未来制定HAND治疗策略具有一定的应用价值与临床意义。

综上所述，本研究揭示了QC在改善HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞毒性和认知功能障碍方面的治疗潜力。QC通过改善氧化应激，增强星形胶质细胞和脑组织的抗氧化防御能力，促进SGs解聚，改善由HIV-1 gp120诱导的星形胶质细胞毒性。这些发现为开发HAND的新型治疗策略提供了理论基础与新的思路。不足之处在于，尽管现有数据支持QC作为潜在的治疗药物，但本研究对于QC改善HIV-1 gp120诱导的认知功能障碍的机制探索处于初级阶段，其临床应用价值仍需进一步深入研究与验证。未来的研究可以进一步探索阐明QC神经保护作用的确切分子机制，以及在其他神经退行性疾病的治疗效果。

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