加味逍遥丸通过神经递质调节、抗炎抗氧化及肠道菌群调控改善大鼠的抑郁样行为

Jiawei Xiaoyao Pills improves depression-like behavior in rats by regulating neurotransmitters, inhibiting inflammation and oxidation and modulating intestinal flora

摘要

目的 基于网络药理学、代谢组学和16srDNA探究加味逍遥丸（JWXYP）改善抑郁样行为的功效物质及作用机制。 方法 通过TCMSP、TCMIP等数据库，筛选加味逍遥丸治疗抑郁症的功效物质群、关键靶点及通路。将SD大鼠随机分为空白（Control）组、模型（CUMS）组、阳性组（1.8 mg/kg）组和加味逍遥丸低、中、高（JWXYP，1.44、2.88、4.32 g·kg^-1·d^-1）组（n=6）。通过行为学实验评估大鼠抑郁样行为， HE染色观察肝脏和海马病理变化，ELISA检测血清和脑组织生化指标。血清代谢组学采用OPLS-DA方法筛选差异代谢物并进行通路分析。盲肠内容物进行16srDNA基因测序分析肠道菌群变化。 结果 网络药理学研究发现，加味逍遥丸中的薄荷酮和丹皮酚等关键成分可通过血脑屏障，调节炎症通路保护神经系统。动物实验显示，加味逍遥丸均显著改善模型大鼠的体质量、糖水偏好率及旷场中央区域活动时间（P<0.05）；明显减少肝脏炎性细胞浸润和细胞坏死，改善海马神经元结构；降低血清中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6水平以及脂多糖结合蛋白，上调外周血和大脑中5-羟色胺、血管活性肠肽的浓度（P<0.05），其中高剂量效果最为显著（P<0.01）。代谢组学分析显示，加味逍遥丸干预的差异代谢物包括吲哚-3-乙酰胺、乙酰左旋肉碱、3-甲基-L-组氨酸等，涉及次级胆汁酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢和D-氨基酸代谢等多条通路（P<0.05）。16srDNA分析发现，加味逍遥丸组的Chao1、Observed和Shannon指数均明显升高，肠道菌群丰富度和均匀度增加，且菌鼠乳杆菌、肠乳酸杆菌的丰度显著提高。 结论 加味逍遥丸通过调节神经递质、抗炎抗氧化以及肠道菌群三条途径相互作用，改善情绪和认知功能减轻抑郁样症状。

Abstract

Objective To explore the bioactive components in Jiawei Xiaoyao Pills (JWXYP) and their mechanisms for alleviating depression-like behaviors. Methods The active compounds, key targets, and pathways of JWXYP were identified using TCMSP and TCMIP databases. Thirty-six SD rats were randomized equally into 6 groups including a control group and 5 chronic unpredictable mild stress (CUMS)-induced depression groups. After modeling, the 5 model groups were treated with daily gavage of normal saline, 1.8 mg/kg fluoxetine hydrochloride (positive control drug), or JWXYP at 1.44, 2.88, and 4.32 g/kg. The depression-like behaviors of the rats were evaluated using behavioral tests, and pathological changes in the liver and hippocampus were examined with HE staining. The biochemical indicators in the serum and brain tissues were detected using ELISA. Serum metabolomics analysis was performed to identify the differential metabolites using OPLS-DA, and gut microbiota changes were analyzed using 16S rDNA sequencing. Results Network pharmacology revealed that menthone and paeonol in JWXYP were capable of penetrating the blood-brain barrier to regulate inflammatory pathways and protect the nervous system. In the rat models subjected to CUMS, treatment with JWXYP significantly improved body weight loss, sucrose preference and open field activities, reduced liver inflammation, alleviated structural changes in the hippocampal neurons, decreased serum levels of TNF‑α, IL-1β, IL-6 and LBP, and increased 5-HT and VIP concentrations in the serum and brain tissue, and these effects were the most pronounced in the high-dose group. Metabolomics analysis showed changes in such metabolites as indole-3-acetamide and acetyl-L-carnitine in JWXYP-treated rats, involving the pathways for bile acid biosynthesis and amino acid metabolism. 16S rDNA analysis demonstrated increased gut microbiota diversity and increased abundance of Lactobacillus species in JWXYP-treated rats. Conclusion JWXYP alleviates depression-like symptoms in rats by regulating the neurotransmitters, inhibiting inflammation and oxidation, and modulating gut microbiota.

Graphical abstract

关键词

加味逍遥丸 / 网络药理学 / 肠道菌群 / 血清代谢组 / 抑郁样行为

Key words

Jiawei Xiaoyao Pills / network pharmacology / intestinal flora / serum metabolome / depression-like behavior

肠道菌通过基本代谢过程、恢复免疫系统以及提供防御病原体入侵的功能，在维护宿主健康方面起着至关重要的作用。肠道微生物组现已经被更加广泛地应用于抑郁症的相关研究中。微生物-肠-脑轴理论提出了最新的抑郁症假说，阐明了肠道微生物对大脑功能和情绪调节的影响^{［1， 2］}。肠道微生物群直接或间接地影响抑郁症，维持肠道微生物群稳态对宿主精神健康至关重要。肠道微生物对宿主行为和认知功能的治疗作用研究，为抑郁症治疗提供了新的思路^［3］。

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》，具有疏肝解郁、养血健脾的功效^{［4， 5］}。加丹皮、栀子两味中药^［6］为加味逍遥丸，丹皮清血中之伏火，栀子清肝热泻火除烦并导热下行，增强复方中清热功效。现代研究表明，加味逍遥丸可以改善患者食欲不振、失眠、焦虑等抑郁样行为^{［7， 8］}。然而，该复方的作用机制尚不明确。基于本课题组前期建立的基于中药物质基础的多组学结合的数据分析方法^［9-12］，围绕中药对及复方开展中药复方治疗疾病的物质基础及分子机制研究^{［9， 13］}。本研究通过网络药理学、分子对接、血清代谢组学和动物实验的多层次验证，揭示了加味逍遥丸在模型组大鼠模型中显著改善抑郁样行为的多重机制，并表明加味逍遥丸通过调节肠道微生物群、促进神经递质的合成与释放、并减少神经炎症，发挥其抗抑郁作用。

1 材料和方法

1.1 主要实验仪器、试剂和动物

1.1.1 药品及试剂

加味逍遥丸 （北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂），氟西汀胶囊 （苏州中化药品有限公司），肿瘤坏死因子-α （TNF-α） ELISA检测试剂盒、白细胞介素-1β（IL-1β） ELISA检测试剂盒、白细胞介素-6（IL-6）ELISA检测试剂盒、5-羟色胺（5-HT） ELISA检测试剂盒、血管活性肠肽 （VIP） ELISA检测试剂盒（上海源桔生物科技中心），脂多糖结合蛋白 （LBP） ELISA检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司），乙酸铵 （Sigma），乙腈 （Merck），粪便DNA 提取试剂盒（广州美基生物科技有限公司），蔗糖 （天津科密欧米化学试剂有限公司）。

1.1.2 主要实验仪器

ABTripleTOF6600型质谱仪（ABSCIEX），Agilent1290InfinityLC型超高压液相色谱仪（Agilent），DW-HL528S型-80 ℃冰箱（中科美菱），DigBehv动物行为分析系统（上海吉量软件科技有限公司），Tanon-2500型凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），Qubit3.0（Thermo Fischer），Milli-Q水净化系统（Millipore），色谱柱（Waters，ACQUITYUPLCBEH Amide1.7 μm，2.1 mm×100 mm column），5430R型低温高速离心机（Eppendorf）、5427R型4 ℃离心机（Eppendorf），明澈TM-D型超纯水仪器（RephiLeBioscience.），NanoDrop2000型微量分光光度计（赛默飞世尔科技），ETC811型PCR仪（东胜兴业科学仪器有限公司），米欧mix-28+型涡旋振荡器（广州广围古润仪器有限公司），DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.1.3 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠36只，6~8周龄，体质量200~220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（川）2020-030。饲养于陕西中医药大学中药药理学实验室。本实验符合动物实验伦理学标准且得到陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：SUCMDL20230515001）。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学

本研究对加味逍遥散活性成分及其相关靶点的数据库构建，通过TCMSP、TCMIP、BATMAN-TCM、CNKI数据库中分别检索收集加味逍遥丸所含中药包括柴胡、当归、白芍、茯苓、白术、炙甘草、薄荷、生姜、栀子、牡丹皮的化学成分信息及其候选靶标信息。在Genecards、OMIM数据库中以“Depression”、“Depressive、Disorder”为关键词进行搜索，筛选值设定Relevancescore>10.0。使用Veeny2.0与抑郁症取交集，构建了“药物-疾病”的靶点数据库。算法筛选构建核心蛋白互作网络与富集分析，对关键靶点利用string构建PPI网络（.csv格式文件），以及Cytoscape中MCODE算法筛选对该网络进行拓扑学性质的深度分析，运用R语言clusterProfiler包对模块分析的关键靶点进行GO/KEGG通路分析。

1.2.2 不可预知慢性应激大鼠（CUMS）模型的建立

大鼠随进分为空白组以及造模组，其中6只空白大鼠自由饮水和进食，无刺激。其他造模大鼠每天给予1~2种应激因子刺激，连续28 d，以构建模型^{［14，15］}。造模刺激因子主要包括：禁食（24 h），禁水（24 h），禁食和禁水（24 h），冰水游泳4 ℃，冰水游泳5 min，昼夜颠倒12 h，倾斜鼠笼12 h，夹尾5 min，摇晃鼠笼15 min，噪音刺激1 h，垫料潮湿24 h，束缚2 h。

1.2.3 分组与给药

除空白组外，造模成功后，造模组随机分为模型组（CUMS）组、加味逍遥丸（低剂量组、中剂量组、高剂量组）、阳性组（n=6）。次日开始给药，高、中、底组分别按照1.44、2.88、4.32 g·kg^-1·d^-1灌胃加味逍遥丸溶液，阳性组按照1.8 mg·kg^-1·d^-1灌胃盐酸氟西汀，模型组按体质量ig等体积的生理盐水，1次/d，持续给药28 d。

1.2.4 宏观指标与行为学实验

观察并记录各组大鼠的活动以及精神状态、皮毛状态色泽以及粪便情况等宏观表征。定期对大鼠进行称体质量并记录。给药结束后的进行行为学实验，糖水偏好实验评估大鼠对奖励的敏感性，用于评估抑郁水平。旷场实验评估大鼠的自发活动和探索行为。在测试前让大鼠适应测试环境，记录大鼠在旷场箱中的活动路程和中央区停留时间等指标；通过DigBehv动物行为分析系统进行数据分析。

1.2.5 取样及样品处理

行为学试验结束后，大鼠禁食12 h。使用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉后腹主动脉取血。取出大鼠的肝脏、大脑组织以及盲肠内容物，肝、大脑分别分装入4%组织固定液中固定，于-4℃保存。血样以2000 r/min速度进行离心处理，离心后取上层血清置于无菌管中，于-80 ℃冷冻备用。

1.2.6 HE染色

将大脑、肝脏样本固定48h后进行慢速脱钙，制成4μm的石蜡切片，进行HE染色。

1.2.7 酶联免疫（ELISA）吸附测定

为了测定大脑组织的5-HT、VIP，IL-1β、IL-6、TNF-α、LBP、5-HT和VIP等分子，首先称量大脑组织并加入冷PBS缓冲液进行匀浆，然后在4 ℃、12 000 r/m离心10~15 min，收集上清液用于后续ELISA检测。使用相应ELISA试剂盒预包被微孔板。然后加入样本和标准品系列，孵育1~2 h后，加入稀释的一抗（1∶1000），再室温或37 ℃孵育1 h，洗涤并加入稀释的酶标二抗（1∶1000~1∶5000），室温孵育1 h。洗涤后加入显色底物溶液（如TMB），避光孵育10~15 min，加入终止液后，读取吸光度A_{450 nm}，利用标准曲线计算样本中目标分子的浓度，并进行数据分析。

1.2.8 血清代谢组学

取血清样本50 μL和20%乙腈甲醇内标提取液300 μL加入2 mL微量离心管中。涡旋3 min，4 ℃和12 000 r/min离心10 min；取200 μL上清液，-20 ℃放置30 min，然后12 000 r/min（4 ℃）离心3 min。取180 μL的上清液到对应进样瓶内衬管中，用于上机分析。色谱条件：色谱柱WatersACQUITYUPLCHSST3C18（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相A：超纯水（0.1%甲酸），流动相B：乙腈（0.1%甲酸）。梯度程序：0~11 min，5%~90%B；11~12 min，90%B；12~12.1 min，90%~5%B；12.1~14 min，5%B。柱温：40 ℃，流速：0.40 mL/min，进样量：2 µL。质谱条件：采用双喷射流电喷雾离子源，正负离子模式质谱参数：离子源电压：正离子模式2500 V，负离子模式1500 V；雾化器电压：40 V；碎裂压力：135 V；辅气流速：8 L/min；离子源温度和鞘气温度均为325 ℃；鞘气流速：11 L/min。

1.2.9 肠道菌群的16srDNA测序

采用HiPure Stool DNA Kits从大鼠盲肠内容物中提取DNA，对16srDNA V3+V4区进行扩增，引物序列为341F：CCTAcG cGN Gcc WGC AG，806R：GGA CTA CHV GGG TAT CTAAT。PCR产物经AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化，StepOnePlus Real-Time PCR System定量，再通过Illumina MiSeq测序平台测序，原始数据上传至NCBl Sequence Read Archive（SRA）数据库。利用Omicshare云平台进行序列分析、菌群多样性和差异分析等数据处理。

1.3 统计学分析

应用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析。计量数据用均数±标准差表示，多组间比较采用（单因素方差分析）方法。P<0.05的差异为具有统计学意义。基于Spearman相关性数据，构建“行为指标-代谢物-肠道菌群”的可视化相关分析热图。将数据矩阵导入生物信息学平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）和基因云平台（https：//www.genescloud.cn/）进行相关分析。

2 结果

2.1 加味逍遥丸防治抑郁症的网络药理学分析

通过数据库挖掘，筛选出加味逍遥丸治疗抑郁症的潜在靶点共计505个（图1A）。基于MCODE聚类分析，从505个靶点中筛选出35个关键靶点，包括IFNG、TNF、IL10、IL1B等（图1B）。通过degree值排序和药理作用筛选，鉴定出加味逍遥丸治疗抑郁症的16种关键化合物，包括槲皮素、柴胡皂苷A、薄荷酮、异甘草素、芍药苷、柴胡皂苷F、甘草查尔酮A、丹皮酚等（表1，图1C）。

GO功能分析显示其分子功能涉及神经细胞因子活性、蛋白质结合和生长因子活性等（图1D）。KEGG信号通路富集分析显示，加味逍遥丸的作用机制与炎症性肠病、IL-17信号通路等炎症相关通路密切相关，通过整体改善免疫系统功能，从而发挥抗抑郁作用（图1E）。

2.2 加味逍遥丸对CUMS大鼠表型及行为学影响

与模型组相比，加味逍遥丸给药组体质量缓慢增加（P<0.001，图2A）。在糖水偏好试验中，模型组的糖水偏好系数显著降低，而与模型组相比，阳性组和加味逍遥丸各剂量组（低、中、高）的糖水偏好系数升高（P<0.001，图2B）。在旷场试验中，模型组在旷场中央区域的活动时间比例显著减少，运动轨迹显示其更倾向于在箱体外围活动（图2E）。相比之下，加味逍遥丸给药组在旷场中央区域的活动显著增加（P<0.05，图2D）。

造模前，大鼠毛色柔顺光亮（图2C-1），性格温顺，大便正常；造模后，模型组大鼠毛发枯燥发黄、掉毛（图2C-2），自发活动减少，胆小易惊、易怒、异常攻击，便稀等抑郁样行为显著；阳性组表现出毛色部分变白、体型瘦小、便稀等变化；而加味逍遥丸给药组体质量逐渐上升，高剂量组大鼠毛色柔顺、性格温顺，大便恢复正常（图2C-3）。模型大鼠高、中、低剂量干预组对比结果显示，高剂量组（JWG）各项指标改善最为显著（P<0.001）。

2.3 加味逍遥丸对CUMS大鼠海马病理形态、炎症因子以及神经递质水平的影响

ELISA实验结果显示，与模型组相比，加味逍遥丸给药组（JW D、JW H、JW G）血清和脑组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、LBP的水平下降（P<0.05，图3A~H）。此外，加味逍遥丸给药组血清和脑组织中的5-HT和VIP含量增加（P<0.05）。

加味逍遥丸给药组（低、中、高）大鼠相比于模型组组，大幅减轻了肝脏坏死及炎症细胞浸润现象（图3L）。在脑组织中，模型组组大鼠的海马神经元呈现变性特征，包括结构松散、排列紊乱、胞核固缩和边界模糊等病理变化。经过加味逍遥丸各剂量组及阳性对照组干预后，这些病理变化显著改善（图3M、N）。此外，加味逍遥丸给药组的大鼠肝脾脏器指数升高，而模型组组大鼠的脏器指数则下降（图3J、K）。

2.4 加味逍遥丸对CUMS大鼠血清差异代谢物的影响

通过PLS-DA（图4A）和PCA分析（图4B），显示加味逍遥丸调控一系列代谢物DL-精氨酸、牛磺胆酸、龙胆苦苷等的表达（图4C），其中部分代谢物表现为下调或上调，CUMS组与JWXYP高剂量组在代谢谱上存在区分。

2.5 差异代谢物鉴定以及通路分析

根据VIP值>1和P<0.05筛选出加味逍遥丸干预模型组大鼠的差异代谢物。加味逍遥丸组中，POS模式下显著上调DL-精氨酸、DL-脯氨酸、甜菜碱等203个差异代谢物，显著下调吲哚-3-乙酰胺、乙酰肉碱等116个差异代谢物。在NEG模式下上调牛磺胆酸、龙胆苦苷等159个差异代谢物，下调DL-谷氨酰胺、胆酸等108个差异代谢物（图5A、B）。

KEGG富集结果进行二次分类，分为环境信息处理、有机体系统、代谢、人类疾病4大类（图5C）。模型组组与加味逍遥丸组显著富集到的差异代谢通路（P<0.05），主要包括次级胆汁酸生物合成、D-氨基酸代谢、组氨酸代谢等途径；在环境信息处理类中，显著富集于大脑调控神经活性配体-受体相互作用通路（图5D、E）。

2.6 肠道菌群物种丰度以及差异物种筛选

在种分类水平上，PCoA、PCA分析结果显著分离（图6A、B）。模型组组大鼠肠道菌群的α多样性指标低于给药组，而加味逍遥丸组大鼠肠道菌群的α多样性指标则有所恢复，加味逍遥丸组Chao1、Observed和Shannon指数均明显升高说明治疗后大鼠肠道菌群的丰富度、均匀度均升高（图6D~E）和β多样性下降（图6C）。

2.7 行为学指标与肠道菌群以及差异代谢物相关性分析

通过Spearman相关性分析构建“行为指标-代谢物-肠道菌群”热图（图7），其中血清中的差异代谢物肌酸、3-甲基组氨酸、肌酐和康德芬的水平与OFT和SPT呈现正相关性（0<r<1）。DL-arginine、Lpc18：2、Lpc18：1、Glycerophosphocholine-与OFT和SPT呈现负相关性（-1<r<0）。Bergaptol与鼠乳杆菌（Lactobacillusmurinus）和肠乳酸杆菌（Lactobacillusintestinalis）呈负相关。Taurocholate与鼠乳杆菌（Lactobacillusmurinus）和肠乳酸杆菌（Lactobacillusintestinalis）呈正相关。异柠檬酸、亚油酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、吲哚-3-乙酰胺、乙酰肉碱、肌酸、3-甲基组氨酸、肌酐和康德芬均能正调节5-HT在大脑中的水平（0<r<1）。

加味逍遥丸处理后，模型组大鼠旷场实验行为学指标与肠乳酸杆菌、LachnospiraceaeNK4A136_group的物种丰度变化呈现出明显的正相关性。在糖水偏好试验（SPT）实验中，大鼠的糖水偏好增加，同时检测到肠道菌群中Lactobacillus与TNF-α、VIP在脑中的含量表现明显的负相关。Candidatus_Saccharimonas与5-HT呈现出明显的正相关性，与LBP、IL-1β、TNF-α表现明显的负相关。

3 讨论

本研究构建了"行为指标-代谢物-肠道菌群"相关性模型，突显加味逍遥丸通过调节肠道菌群稳态而展现的抗抑郁潜力。结果显示，Candidatus_Saccharimonas与5-HT水平显著正相关，同时与LBP、IL1β和TNF-α呈负相关，表明该复方在调节神经递质合成和抑制炎症反应中发挥作用。此外，异柠檬酸、亚油酸、牛磺鹅脱氧胆酸等代谢物显著正调节5-HT水平，表明其能通过增强神经递质合成发挥抗抑郁作用。牛磺胆酸与鼠乳杆菌和肠乳酸杆菌等益生菌的正相关性，进一步支持了肠道菌群在神经功能调节中的关键作用。

加味逍遥丸为中药制剂，由柴胡、丹皮栀子等10味中药配伍组成。君药柴胡，味苦微寒，性开散疏泄，解郁升阳，为疏肝解郁之要药。现代药理学研究表明，柴胡具有抗抑郁和抗焦虑作用。首先，本研究通过网络药理学方法探讨了加味逍遥丸（JWXYP）的潜在作用机制及其关键活性成分。研究发现，加味逍遥丸中的关键活性分子通过两种途径协同发挥抗抑郁效果。丹皮酚、麝香草酚、豆甾醇和薄荷酮等成分能够穿过血脑屏障，而柴胡皂苷A、异甘草素、芍药苷和甘草查尔酮A则通过其抗炎和抗氧化特性对情绪和心理状态产生显著影响，从而改善抑郁样行为。首先，丹皮酚通过减少炎症因子的释放和调节氧化应激来改善神经元的环境，保护大脑细胞免受氧化应激和神经炎症的损伤。柴胡皂苷A通过抑制T细胞和巨噬细胞的活性，调节cAMP/PKA/CREB信号通路改善失眠^{［16， 17］}。同时，柴胡皂苷A作用于Notch信号通路改善氧化应激导致的肝郁脾虚型抑郁症大鼠海马的神经元炎症。槲皮素、芍药苷和甘草查尔酮A通过调节免疫细胞的活性和功能^［18］，抑制NF-κB通路和MAPK通路^［19］，从而减少炎症因子如IL-6、TNF-α的释放；芍药苷通过STAT3抑制IL-13诱导的BEAS-2B细胞氧化应激和自噬^［20］，减少ROS生成保护免疫细胞免受氧化损伤^{［18， 21］}。综上，加味逍遥丸通过调节免疫细胞活性和炎症反应，有效保护肝脏调节免疫系统，促进各系统协调，从而有效缓解抑郁样行为。

其次，血清在肠道菌群与大脑之间的双向交流网络中起着关键作用，作为传递信息和调节生理功能的介质，涉及神经系统、免疫系统及肠道微生物群的相互作用。针对抑郁症这种复杂疾病，血清代谢组学能够有效捕捉全身范围内的代谢变化，进而揭示潜在的分子机制和治疗靶点。本研究结果显示加味逍遥丸影响次级胆汁酸生物合成、丁酸酯代谢、D-氨基酸代谢，调节神经递质的合成和释放。同时，为进一步验证虚拟预测结果，进行了血清代谢组学测序分析。结果显示，DL-精氨酸、DL-脯氨酸、甜菜碱、吲哚-3-乙酰胺、乙酰肉碱、DL-谷氨酰胺、胆酸、牛磺胆酸及龙胆苦苷等代谢物通过调控炎症反应和神经递质的合成。具体而言，吲哚-3-乙酰胺通过调控肠道-脑轴中的炎症反应^［22］，调节免疫反应、促进组织修复^［22］、调控NO和NF-κB等重要炎症通路、维持肠道屏障功能等^［23］，影响5-HT和DA、NE等神经递质的合成与释放。D-氨基酸作为神经调节剂调节NO信号通路，参与突触可塑性和神经信号传递，调节N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体^［41］，从而影响中枢神经系统的炎症和神经元健康^［23］。而在调控中枢神经系统功能和情绪稳定中起到关键作用。其中差异代谢物牛磺胆酸、龙胆苦苷通过调节胆汁酸代谢抑制炎症因子如TNF-α和IL-1β^［25］，减轻神经炎症^［26］。并通过其抗氧化特性保护神经元，同时调节神经递质水平，修复大脑组织，减轻神经损伤，促进恢复大脑的正常功能，增强了加味逍遥丸的整体抗抑郁效果^［22］。验证外周和中枢神经系统中神经递质水平的变化与现有研究结果的一致性，确定其发挥抗抑郁作用的潜在机制。验证炎症因子TNF-α、IL-1β、IL6以及LBP，显著改善了外周血清以及大脑中的炎症水平，并通过病理切片证实这些活性成分能够显著改善海马神经元的病理变化，包括神经元变性、结构松散、排列紊乱、胞核固缩和边界不清等特征。

加味逍遥丸中的功效物质还通过调节肠道菌群，增加乳酸杆菌属中的Lactobacillusmurinus、Lactobacillusintestinalis物种丰度。据研究发现，药物与微生物群之间的相互作用可改变细菌代谢以及药物活性和疗效。中药复方口服后，其部分活性成分直接调节肠道共生微生物群，包括细菌、真菌和其他微生物的^［27］，达到维持肠道菌群稳态的作用。Liu等^［28］研究发现与本研究结果一致：其中乳酸菌的家族被发现是与抑郁症相关的主要微生物。研究表明，乳酸菌可以缓解由抑郁症引起的肠道菌群失衡，进而改善宿主的行为和情绪^［29］。Lactobacillus有助于增强肠道黏膜屏障的完整性，防止有害物质和细菌进入血液循环，从而减少引发抑郁症的可能性^{［30， 31］}。Lactobacillusmurinus、Lactobacillusintestinalis这能调节抑郁症患者有害菌肠道菌群的平衡^［32］，刺激肠道中的神经递质（如血清素、γ-氨基丁酸）的合成^［33］，调节色氨酸合成^{［34， 35］}，减少肠道炎症、保护肠道黏膜和调节肠道免疫反应来缓解抑郁症状^［36］。此外，通过将行为学和炎症因子的表达与肠道菌的丰度进行相关性分析后发现加味逍遥丸增效调控的乳酸杆菌有报道与抑郁情绪调控或神经递质合成密切相关。本研究结果显示5-羟色胺、肠脑肽的含量显著变化，这些数据表明，抗抑郁药改变了肠道微生物组成和功能，证明其可通过肠-脑、血液-脑屏障传递到大脑，改善神经元的健康和可塑性^［37］，这可以部分解释的抗抑郁作用。综上所述，加味逍遥丸可恢复肠道菌群稳态，改善肠道屏障的通透性，防止有害物质和病原体进入血液循环，影响大脑功能，从而缓解抑郁症状^［38］。后续研究将进一步探讨加味逍遥丸在不同抑郁症亚型中的疗效，以实现个体化治疗的目标。本研究阐明了加味逍遥丸防治抑郁症的功效物质以及分子作用机制，为推动精准医疗，推动老药新用，提供有益的见解，为中药复方的临床科学、安全用药奠定理论基础。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2022JM-538)

重点产业创新链(群)-社会发展领域(2024SF-ZDCYL-03-04)

陕西省中医药中青年科技骨干人才项目(11610000MB29656749/2020-00894)

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