SLC1A5通过促进M2型巨噬细胞极化促进肝癌进展

SLC1A5 overexpression accelerates progression of hepatocellular carcinoma by promoting M2 polarization of macrophages

摘要

目的 探讨SLC1A5高表达在泛癌种的临床意义及其促进肝癌进展的机制。 方法 利用癌症基因组图谱（TCGA）、国际肿瘤基因组协会（ICGC）等数据库探讨SLC1A5在泛癌种的表达水平及其与临床分期、淋巴结转移及生存预后的关系；利用EPIC、CIBERSORT、TIMER算法分析SLC1A5与免疫细胞浸润的关系，分析SLC1A5联合M2型巨噬细胞浸润水平与肿瘤预后的关系。利用慢病毒过表达系统构建过表达SLC1A5肝癌细胞株；利用小干扰RNA（siRNA）构建沉默SLC1A5（NC组、si-SLC1A5-1组、si-SLC1A5-2组）的肝癌细胞株；CCK-8增殖实验检测SLC1A5对肝癌细胞增殖的影响；利用过表达SLCA5稳转株（NC组，SLC1A5过表达组）构建肝癌皮下瘤模型，体内水平探讨SLC1A5对肝癌增殖的影响；利用共培养体系验证干扰和过表达SLC1A5肝癌细胞对巨噬细胞极化的影响。 结果 SLC1A5主要定位于细胞膜上，SLC1A5在大多数肿瘤中均显著高表达（P<0.05），其表达水平与临床分期及淋巴结转移呈正相关（P<0.05）；SLC1A5高表达与多癌种不良预后相关（P<0.05）。在13个癌种中显示SLC1A5与免疫评分呈正相关，二者相关性在低级别胶质瘤（LGG）、肝癌（LIHC）及甲状腺癌（THCA）中最显著（P<0.05）。多癌种显示SLC1A5与巨噬细胞浸润水平呈正相关（P<0.05），该相关性在LGG及LIHC中最显著；而在包括肺鳞癌、胰腺癌、胃癌在内的5种肿瘤中，二者呈负相关（P<0.05）。生存分析发现SLC1A5高表达且M2型巨噬细胞高浸润水平的患者生存预后最差（P<0.05）；SLC1A5与免疫抑制相关基因、细胞因子及细胞因子受体表达呈正相关，该相关性在LGG、LIHC中最显著（P<0.05）。不同肝癌细胞株均高表达SLC1A5，过表达SLC1A5促进肝癌细胞增殖，干扰SLC1A5则抑制肝癌细胞增殖；体内实验验证过表达SLC1A5促进肝癌增殖。SLC1A5与M2型巨噬细胞极化分子标志物表达呈正相关，过表达SLC1A5促进M2型巨噬细胞极化并抑制T细胞分泌IFN-γ。 结论 SLC1A5与多种肿瘤的临床分期、淋巴结转移、预后及免疫浸润水平相关；SLC1A5通过促进M2型巨噬细胞极化抑制T细胞功能来促进肝癌进展。

Abstract

Objective To investigate the clinical significance of SLC1A5 overexpression in pan-cancer and its mechanism for promoting hepatocellular carcinoma (HCC) progression. Methods We analyzed the correlation of SLC1A5 expression with clinical stage, lymph node metastasis and prognosis in pan-cancer using TCGA and ICGC datasets and explored its association with immune cell infiltration using EPIC, CIBERSORT, and TIMER algorithms. In HCC cell lines, the effects of lentivirus-mediated SLC1A5 overexpression or RNA interference on cell proliferation were examined using CCK-8 assay, and the growth of HCC cell xenografts overexpressing SLC1A5 was observed in nude mice. The effects of SLC1A5 overexpression or silencing in HCC cells on macrophage polarization were evaluated in a cell co-culture system. Results SLC1A5 was mainly localized on cell membrane and was highly expressed in most cancers in association with clinical stage, lymph node metastasis and poor prognosis. SLC1A5 expression was positively correlated with immunity score in 13 cancer types, especially in low-grade glioma (LGG), LIHC and thyroid cancer. SLC1A5 was positively correlated with macrophage infiltration level in LGG and LIHC but negatively correlated with macrophage infiltration in 5 cancers including lung squamous carcinoma, pancreatic carcinoma, and gastric carcinoma. Patients with SLC1A5 overexpression and high level of M2 macrophage infiltration had the worst survival outcomes. SLC1A5 was correlated with immunosuppression-related genes, cytokines, and cytokine receptors, which was the most obvious in LGG and LIHC. SLC1A5 was highly expressed in different HCC cell lines, and its overexpression promoted HCC cell proliferation both in vitro and in nude mice. In the cell co-culture experiment, SLC1A5 was positively correlated with the molecular markers of M2 polarization of macrophages, and its overexpression strongly promoted M2 polarization of the macrophages and inhibited T cell secretion of IFN-γ. Conclusion SLC1A5 expression level is correlated with clinical stage, lymph node metastasis, prognosis, and immune cell infiltration in most cancers, and its overexpression promotes HCC progression by inhibiting T-cell function via promoting M2 polarization of macrophages.

Graphical abstract

关键词

泛癌 / SLC1A5 / M2型巨噬细胞 / 肝癌 / 增殖

Key words

pan-cancer / SLC1A5 / M2 macrophages / hepatocellular carcinoma / proliferation

免疫治疗特别是免疫检查点抑制剂治疗已成为肿瘤治疗的热点^［1］，但目前的免疫疗法，包括程序性死亡-1 （PD-1）、程序性死亡配体-1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）抑制剂，在大多数肿瘤中的临床疗效有限^［2］。鉴于肿瘤发生发展的复杂性，迫切需要开发能够预测不同类型肿瘤预后和免疫治疗效果的关键基因^［3］。借助癌症基因组图谱（TCGA），可以通过泛癌表达分析发现新的免疫治疗靶点，并研究其与临床病理特征、免疫浸润及相关信号通路的相关性^{［4， 5］}。

谷氨酰胺转运体溶质载体家族1成员5（SLC1A5）是一种高亲和力的L型谷氨酰胺转运蛋白，属于SLC家族，定位于正常细胞的细胞膜^［6］。SLC1A5在肺癌^［7］、直肠癌^［8］、乳腺癌^［9］、前列腺癌^［10］等多种癌症类型中与肿瘤进展有关，其在不同癌症中的潜在作用因不同的组织起源和肿瘤微环境而异。肿瘤微环境的主要成分之一是免疫细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞和中性粒细胞，它们可以调节肿瘤的侵袭、转移、增殖和进展^［11-13］。据报道，SLC1A5是T细胞激活所必需的，它在T细胞受体刺激的mTORC1信号通路的激活中起重要作用^［14］。此外，Slc1a5缺陷小鼠的炎症T细胞反应减弱，表现为Th1和Th17细胞减少^［15］。SLC1A5高表达与乳腺癌中PD-1、PD-L1、CD68⁺和CD20⁺ T细胞浸润相关^［16］。由此可见，越来越多的证据表明SLC1A5在免疫系统和癌症中起着重要作用。

尽管SLC1A5在大部分肿瘤中的表达情况及其与免疫细胞浸润的关系，但大部分研究仅从mRNA水平探讨泛癌种中SLC1A5的表达情况^［17］。促癌基因更多通过蛋白水平发挥生物学功能，在泛癌种中SLC1A5的mRNA跟蛋白表达水平是否一致目前尚不清楚；多数促癌基因可通过调控细胞因子、免疫抑制分子及免疫激活分子调控免疫微环境，既往研究未探讨泛癌种中SLC1A5对细胞因子的调控作用，更多是探讨泛癌种中SLC1A5表达水平与CD8⁺T细胞及髓系抑制性细胞的关系^［18］，而泛癌种中SLC1A5与巨噬细胞尤其是M2型巨噬细胞的关系如何仍待进一步阐明；SLC1A5表达水平与M2型巨噬细胞浸润增加是否更能预测肿瘤患者预后未见报道。

本研究借助癌症基因组图谱数据库，分别从mRNA水平及蛋白质水平探讨泛癌种中SLC1A5的表达情况，并探讨其与临床分期、淋巴结转移、预后、免疫细胞浸润水平、免疫抑制相关基因的关系，并利用体内外实验探讨SLC1A5在肝癌中的生物学功能及其促进肝癌进展的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人肝癌细胞株Huh7、HCC-LM3、MHCC-97H、HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、SNU-449等（中国科学院上海细胞库）。

1.1.2 药品、试剂

SLC1A5慢病毒过表达系统由上海吉凯基因构建并包装，针对SLC1A5的小干扰RNAs（siRNAs）（苏州吉玛基因），PCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司设计合成。DMEM培养基、胎牛血清（Gibco），蛋白提取试剂盒（碧云天生物），SLC1A5抗体（Proteinthch），GAPDH抗体、鼠二抗、兔二抗（abcam），Lipofectamin^TMRNAiMAX转染试剂（Thermo Fisher Scientific）、细胞因子PMA和IL-4（biolegend），ELISA试剂盒（Invitrogen），Trizol裂解液（Takara）、逆转录试剂盒、Real-Time PCR试剂盒，Transwell小室（Corning），Ki-67免疫组化试剂盒（中杉金桥）；CCK-8试剂盒（同仁）。

1.1.3 实验动物

4~6周雄性裸鼠由广东省动物中心提供，并饲养于南方医院实验动物中心。动物实验获得南方医科大学医学伦理委员会审批（伦理批号：NFEC-201208-K3）。

1.2 方法

1.2.1 数据处理

从TCGA数据集下载RNA测序及相关临床信息，该数据集包含33种癌症类型的11 069个样本，利用UCSC Xena在线网站（https：//xena.ucsc.edu/）进一步行数据处理。从cell数据库（https：//portals.broadinstitute.org/ccle/）下载各种肿瘤细胞系的表达谱数据。通过GTEx （https：//commonfund.nih.gov/GTEx）获得31个正常组织的基因表达谱数据。使用Strawberry Perl （Version 5.32.0，http：//strawberryperl.com/）从前述的数据集中提取SLC1A5 mRNA表达谱数据。数据分析采用R软件4.0.2版（https：//www.Rproject.org），使用R软件包ggpubr绘制小提琴曲线图。使用UALCAN网站（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html）评估来自CPTAC数据集（临床蛋白质组学肿瘤分析联盟）中不同癌种的SLC1A5蛋白表达。从HPA（http：//www.proteinatlas.org/）数据库获取正常及相应肿瘤组织中SLC1A5蛋白表达的免疫组化图像，以及3个细胞系中SLC1A5表达的免疫荧光图像。利用GEPIA2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，version 2）在线软件（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#analysis）中的“Expression Analysis-stage Plots”模块，以及TCGA数据集中可获得的肿瘤分期的信息，分析7种癌症类型不同肿瘤分期中SLC1A5的表达差异。

1.2.2 生存预后分析

使用GEPIA的“Survival Map”模块分析并获得SLC1A5的表达水平与不同肿瘤总生存期和无病生存期预后分析。SLC1A5高表达组和低表达组的cutoff值分别为cutoff-high（50%）和cutoff-low（50%）。生存预后分析采用Log-rank检验。从GEPIA的“生存分析”模块下载不同肿瘤的生存曲线。

1.2.3 SLC1A5表达水平与免疫浸润的关系

利用ESTIMATE数据评估恶性肿瘤组织基质和免疫细胞浸润是一种公认的有效方法^［19］，ESTIMATE算法评估不同癌症的免疫评分。R软件“estimate”和“limma”包分析SLC1A5表达水平与免疫评分的相关性。CIBERSORT算法计算不同癌症中26种免疫细胞的评分^［20］。R软件包“ggplot2”、“ggpubr”、“ggExtra”计算并绘制SLC1A5表达水平与不同肿瘤中免疫细胞浸润水平的关系。利用TIMER web server的“explore-gene_corr”模块研究TCGA所有肿瘤中SLC1A5表达与免疫相关基因的关系，并用“Immune-Gene”模块计算SLC1A5表达与不同亚型巨噬细胞浸润水平的关系。此外，我们应用TIMER在线软件的“explore-gene_outcome”模块，评估巨噬细胞免疫浸润水平与SLC1A5表达与LGG及LIHC患者预后的相关性。使用EPIC、CIBERSORT、CIBERSORT-abs、MCPCOUNTER、QUANTISEQ、TIMER和XCELL算法估计免疫浸润水平。P值和相关值采用纯度校正的Spearman秩相关检验计算。采用R-packages“psych”分析SLC1A5基因与M2巨噬细胞相关趋化因子和免疫检查点抑制基因在不同癌种中的相关性。

1.2.4 细胞培养

用含10%血清的DMEM培养基培养人肝癌细胞株Huh7、HCC-LM3、MHCC-97H、HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、SNU-449，并置于含5% CO₂，37 ℃的恒温箱内培养，待细胞密度达到85%左右进行常规传代和后续实验，1~2 d进行换液。

1.2.5 Western blotting法检测蛋白质表达

RIPA裂解液提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白质浓度，加入5×loading buffer，95 ℃加热10 min变性蛋白质。取20 μg蛋白质，行10%~12% SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，PAGE胶上的蛋白质电转移至PVDF膜上。5% BSA室温孵育1 h，加入一抗（GAPDH： 1∶1000、SLC1A5： 1∶1000）4 ℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗（1∶10 000），发光采用ECL化学发光检测试剂盒。总蛋白以GAPDH为对照。

1.2.6 SLC1A5过表达肝癌细胞株的构建

合成SLC1A5过表达慢病毒（上海吉凯公司），按照吉凯公司病毒转染说明书进行转染。具体方法如下：慢病毒转染前，将细胞以1×10⁵/孔铺到24孔板中，使细胞在慢病毒转染数量达到2×10⁵/孔左右。待细胞达到对数生长期后，含有6 μg/mL polybrene的2 mL新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液，37 ℃孵育，24 h后用新鲜的完全培养基替换含有病毒的培养基。为了筛选稳定转染SLC1A5的细胞克隆，在病毒转染第3天开始加入嘌呤霉素，持续嘌呤霉素暴露2周后，收集部分细胞，提取细胞总蛋白质，利用Western blotting法检测SLC1A5的过表达情况。

1.2.7 小干扰RNA（siRNA）沉默SLC1A5的表达 根据Lipofectamin^TMRNAiMAX转染试剂说明书操作，具体方法如下：铺板使细胞板中每个孔内的细胞密度达到30%~40%，待细胞充分贴壁并达到对数生长期时，进行siRNA转染。吸取5 μL的Lipofectamine RNAiMAX至250 μL Opti-MEM 无血清培养基中，同时分别将2个SLC1A5 siRNA序列加入至250 μL Opti-MEM 无血清培养基中（siRNA：Opti-MEM=1∶50），按照1∶1的比例将上述两试剂混和均匀，在室温条件下孵育20 min，使转染体系内的siRNA和Lipofectamine RNAi MAX充分反应。去除细胞板内的旧培养基，重新加入2 mL新鲜培养基。反应结束后将500 μL的转染体系滴加到培养板中，轻柔摇晃使反应体系均匀分布于新鲜培养基中。将细胞板置于37 ℃含5% CO₂的细胞培养箱，待转染48 h后收集细胞进行后续实验。设计的siRNA序列经GENEBANK数据库blast比对特异性后使用，siRNA序列详见表1。

1.2.8 CCK-8增殖实验

取SLC1A5相对低表达的肝癌细胞株HCC-LM3，根据1.2.5方法构建稳定过表达SLC1A5的肝癌细胞株，包括NC组（NC）、SLC1A5过表达组（SLC1A5）；取SLC1A5相对高表达的肝癌细胞株Hep3B及MHCC-97H细胞株，根据1.2.6方法构建沉默SCL1A5的肝癌细胞株，包括NC组（NC）、SLC1A5干扰组（siSLC1A5-1、siSLC1A5-2）。每组取1×10³肝癌细胞接种于96 孔板，细胞培养箱培养1、2、3、4、5、6、7 d，去除原培养基，每孔加入200 μL用无血清的培养基配置的10% CCK-8，培养2 h，用Bio-Rad酶联免疫检测仪在450 nm测光密度值。每组设3个重复孔，取平均值，绘制增殖曲线。

1.2.9 裸鼠皮下成瘤实验

将不同处理组肝癌细胞（HCC-LM3细胞株：NC组，SLC1A5过表达组）消化成单细胞，用PBS清洗3次，调整细胞浓度至1×10⁷/mL，取其中100 μL注射于4周龄裸鼠大腿外侧，每2 d观测肿瘤形成情况，测量肿瘤体积及小鼠质量，绘制肿瘤生长曲线。实验结束时取皮下瘤，分为两部分：一部分提取蛋白，一部分放入福尔马林中浸泡，用于制作石蜡块，留待之后免疫组化检测。

1.2.10 免疫组化检测组织蛋白表达

将石蜡切片置于67 ℃烘箱，烤片2 h，经脱蜡、水化后，PBS冲洗3次，每次3 min。柠檬酸高压修复，蒸馏水冲洗2次，然后用PBS冲洗3次。加入1滴3% H₂O₂，室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次。去除PBS，加入1滴相应的一抗（SLC1A5：稀释比例1∶400，Ki-67：稀释比例1∶100），室温孵育2 h。PBS冲洗3次，去除PBS，加入1滴聚合物增强剂，室温孵育20 min。PBS冲洗3次，去除PBS，加入1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30 min。PBS冲洗3次，去除PBS，加入1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5 min。苏木素染核，0.1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，蓝化。经梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，晾干后显微镜下观察并拍照。

1.2.11 肝癌细胞与巨噬细胞共培养

巨噬细胞体外诱导实验：THP-1单核细胞计数后将浓度调整为1×10⁶/mL，于六孔板中2 mL/孔，并加入100 ng/mL PMA，诱导24~48 h至M0阶段；肝癌细胞与M0巨噬细胞体外共培养实验：根据1.2.5方法构建稳定过表达SLC1A5的肝癌细胞株，包括NC组（HCC-LM3-NC）、SLC1A5过表达组（HCC-LM3-SLC1A5）；根据1.2.6方法构建干扰SCL1A5，包括NC组（Hep3B-NC、MHCC-97H-NC）、SLC1A5干扰组（Hep3B-siSLC1A5-1、Hep3B-siSLC1A5-2、MHCC-97H-siSLC1A5-1、MHCC-97H-siSLC1A5-2）。将0.4 μm孔径的聚碳酸脂膜Transwell小室置于6孔板中，上室种植肝癌细胞，下室种植M0巨噬细胞，并加入20 ng/mL IL-4，37 ℃，5% CO₂条件下孵育48 h，收集巨噬细胞提取RNA并检测M2型巨噬细胞分子标志物的表达情况。

1.2.12 qRT-PCR检测各基因mRNA水平表达情况

细胞作相应处理后，Trizol裂解细胞，经异丙醇沉淀、75%的酒精洗涤后，初步提取总RNA，用DNase I处理粗提的RNA，去除RNA中混有的基因组DNA，以纯化RNA。按PrimeScirpt逆转录试剂盒说明书进行RNA逆转录，按Real-Time PCR 试剂盒SYBR I Premix Ex TaqTM说明书进行Real-time PCR，PCR反应采用Roche Light Cycle480 Real-Time PCR系统。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性和稳定性后使用，引物序列见表2。

1.2.13 共培养体系上清与Jurkat T细胞共培养

根据1.2.5方法构建稳定过表达SLC1A5的肝癌细胞株，包括NC组（HCC-LM3-NC）、SLC1A5过表达组（HCC-LM3-SLC1A5）；根据1.2.6方法构建干扰SCL1A5，包括NC组（Hep3B-NC、MHCC-97H-NC）、SLC1A5干扰组（Hep3B-siSLC1A5-1、Hep3B-siSLC1A5-2、MHCC-97H-siSLC1A5-1、MHCC-97H-siSLC1A5-2）。将过表达或者干扰SLC1A5的肝癌细胞与M0巨噬细胞共培养，取用IL-4共培养48 h的培养基，培养活化的Jurkat T淋巴细胞，培养48 h，ELISA法检测T细胞分泌IFN-γ的能力。

1.2.14 ELISA检测细胞IFN-γ的含量

收集共培养体系上清，检测上清液中细胞因子IFN-γ表达量；用包被液稀释抗体，100 μL每孔加入酶标板；4 ℃包被过夜，次日弃液体；加入洗涤液洗板；加入封闭液室温放置2 h；用样品稀释液稀释待测细胞上清，稀释标准液并将标准液、待测样品、阴性对照、阳性对照依次加样，室温孵育1 h。洗板，加酶标抗体，加底物液显色，室温避光反应30 min，加终止液，酶标仪检测样品孔OD值，计算不同处理后细胞因子IFN-γ的含量。

1.2.15 统计学分析

本研究纳入的所有样本的基因表达均通过log2转化归一化。采用t检验比较正常组织与癌组织的差异。相关性分析采用Spearman或Pearson检验。双侧P<0.05认为差异有统计学意义。采用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank检验和Cox比例风险回归模型进行生存分析。所有统计分析均使用R语言软件（Version 4.0.2，64位）进行。

2 结果

2.1 泛癌种中SLC1A5的表达情况

根据GTEx数据集，所有组织器官中普遍表达SLC1A5，其在骨髓中表达最高，其次是膀胱和前列腺组织（图1A）。CCLE数据集中SLC1A5在所有检测的细胞系中均有表达（图1B）。与对应非肿瘤组织相比，SLC1A5在大多数癌症中高表达，其在直肠腺癌中表达水平最高，在肝细胞癌中表达水平最低。在有配对癌旁组织表达谱数据的癌症类型中，SLC1A5在14种癌症类型中显著上调，包括胆管癌、结肠癌、食管癌、胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾透明细胞癌、脑胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胰腺腺癌、直肠癌、胃腺癌、甲状腺癌）和子宫体子宫内膜癌，而SLC1A5在肾嫌色细胞癌症中表达相对下调（图1C，P<0.001）。以GTEx数据集中正常组织为对照，探讨SLC1A5在肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润性癌、急性髓系白血病、卵巢浆液性囊腺癌、皮肤黑色素瘤、睾丸生殖细胞瘤和子宫癌肉瘤中非肿瘤组织和肿瘤样本中的表达差异，结果显示SLC1A5在上述所有癌症中均高表达（P<0.05，图1D）。

免疫荧光显示在人表皮癌细胞（A-431）、人成骨肉瘤细胞（U-20S）及人星形胶质瘤细胞（U-251MG）中细胞膜的绿色荧光（SLC1A5）最强，提示SLC1A5主要表达于细胞膜上（图2A）。CPTAC和HPA数据集显示，SLC1A5蛋白在结直肠癌、肺癌和子宫内膜癌等原发肿瘤样本中的表达高于正常组织（P<0.05，图2B~D）。TCGA数据集中BRCA样本与对应正常组织的SLC1A5 mRNA水平差异无统计学意义，这种现象同样发生在蛋白表达水平（图2E）。SLC1A5 mRNA在KIRC中与相应非肿瘤组织相比略有上调（P<0.05，图2F），而SLC1A5蛋白表达水平在KIRC中明显下调（P<0.001，图2F）。此外，与正常组织相比，胆管癌、胶质瘤、头颈部鳞癌、肝癌、胰腺癌、胃癌及甲状腺癌中SLC1A5的mRNA水平明显升高（P<0.05，图3）；正常胆囊、大脑皮层、平滑肌、肝脏、胰腺、胃和甲状腺组织的SLC1A5 的免疫组化染色不明显或较弱，而对应肿瘤组织的SLC1A5的免疫组化染色中等或较强（图3）。

2.2 SLC1A5表达与临床特征的关系

SLC1A5表达与肿瘤临床分期的关系分析结果显示，在HNSC（F=3.15，P=0.026）、KIRC（F=9.14， P<0.001）、KIRP（F=2.73，P=0.044）、LIHC（F=3.68，P=0.012）、PAAD（F=6.33，P=0.0004）、TGCT（F=3.55，P=0.0315）和THCA（F=9.93，P<0.001）中，随着肿瘤临床分期越晚，肿瘤组织中SLC1A5表达水平逐渐升高（图4A）。在HNSC、KIRC、LIHC和THCA癌种中，有淋巴结转移患者的SLC1A5表达水平较高（P<0.05，图4B）。

2.3 SLC1A5表达水平在不同癌症类型中的预后价值

根据SLC1A5的表达水平将肿瘤样本分为高表达组和低表达组，生存曲线分析显示，在BLCA（HR=1.4，Log-rank P=0.046）、BRCA（HR=1.4，Log-rank P=0.046）、KIRC（HR=1.5，Log-rank P=0.016）、LGG（HR=2.3，Log-rank P=1e-05）、LIHC（HR=2.5，Log-rank P=7e-05）、MESO（HR=2.1，Log-rank P=0.0021）、SARC（HR=1.5，Log-rank P=0.034）和UVM（HR=8，Log-rank P=0.012）患者中，SLC1A5高表达的患者总生存期缩短 （图5A），而在KIRC（HR=1.6，Log-rank P=0.012）、LGG（HR=2，Log-rank P=3.1e-05）、PAAD（HR=1.7，Log-rank P=0.026）和THCA（HR=1.9，Log-rank P=0.036）患者中，SLC1A5高表达患者的无病生存期明显缩短（图5B）。然而，在PRAD（HR=0.57，Log-rank P=0.0087）患者中SLC1A5高表达患者无病生存期明显延长（图5B）。

2.4 SLC1A5表达水平与肿瘤微环境及肿瘤免疫细胞浸润水平的相关性

33种癌症类型的免疫评分结果显示在包括LGG、LIHC和THCA在内的22种癌症类型中，SLC1A5的表达水平与泛癌种中的免疫评分呈正或负相关（P<0.05），相关系数最高的3种癌症类型包括LGG（r=0.81，P=3.1e-116）、LIHC（r=0.38，P=5.3e-14）和THCA（r=0.41，P=3.6e-22，图6A）。

TIMER算法结果显示在大多数类型的癌症中，免疫浸润水平与SLC1A5表达密切相关（P<0.05，图6B）。其中LGG和LIHC是SLC1A5与免疫浸润细胞相关性最强的前两种肿瘤。在LGG（r=0.61，P<0.001）和LIHC（r=0.54，P<0.001）中，SLC1A5的表达水平与巨噬细胞的免疫浸润呈正相关（图6B）。

共表达热图显示，大多数免疫相关基因与SLC1A5共表达，且二者呈显正相关（P<0.05，图7A~D）。

2.5 SLC1A5表达水平与肿瘤相关性巨噬细胞亚群的关系

SLC1A5表达水平与肿瘤相关性巨噬细胞浸润水平呈正相关（P<0.05，图8A），该相关性在LGG（r=0.54，P=1.42e-37）、LIHC（r=0.481，P=1.19e-29）和THCA（r=0.463，P=9.81e-20）中最强（图8B）。在预后较差的LGG患者中，M2巨噬细胞水平较高（P<0.05，图8C）。在LGG中，SLC1A5表达水平较低且M2巨噬细胞浸润较少的患者生存期最佳，而SLC1A5表达水平较高且M2巨噬细胞浸润增多的患者生存期最差（P<0.0001，图8D）。在LIHC中，相较于SLC1A5表达水平低且M2巨噬细胞浸润减少的患者，SLC1A5表达水平较高且M2巨噬细胞浸润增多的患者生存期明显缩短（图8D）。

2.6 过表达SLC1A5促进肝癌增殖

不同肝癌细胞株中SLC1A5的表达结果显示SLC1A5在肝癌细胞株中均一定程度过表达（图9A），在相对高表达SLC1A5的Hep3B及MHCC-97H细胞株中干扰SLC1A5的表达，利用相对低表达SLC1A5的HCC-LM3细胞株构建稳定过表达SLC1A5的肝癌细胞株，并验证相应肝癌细胞株中SLC1A5的干扰及过表达效果（图9B）。与对照组相比，干扰SLC1A5组能抑制肝癌细胞增殖（P<0.001，图9C）；反之，与NC组相比，过表达SLC1A5（SLC1A5过表达组）则促进肝癌细胞增殖（P=0.003，图9D）。过表达SLC1A5明显促进皮下瘤增殖（P<0.001，图9E、F）；与对照组相比，过表达SLC1A5的皮下瘤肿瘤质量增加（P<0.001，图9G）；过表达SLC1A5后皮下瘤组织中SLC1A5的表达上调（P=0.0014，图9H），并且过表达SLC1A5促进肿瘤组织Ki-67的表达（P=0.0151，图9I）。

2.7 SLC1A5促进M2型巨噬细胞极化并抑制T细胞功能

SLC1A5与M2型巨噬细胞分子标志物IL-10（r=0.54，P<0.0001）、TGFB1（r=0.46，P<0.0001）、TGFB2（r=0.21，P<0.0001）、TGFB3（r=0.53，P<0.0001）等的表达呈显著正相关；验证集（ICGC-LIRI-JP）结果也验证肝癌中SLC1A5表达与M2型巨噬细胞分子标志物IL-10（r=0.43，P<0.0001）、TGFB1（r=0.72，P<0.0001）、TGFB2（r=0.47，P<0.0001）、TGFB3（r=0.40，P<0.0001）等呈正相关（图10A）。干扰SLC1A5的肝癌细胞明显下调M2型巨噬细胞极化标志物的表达情况（P<0.05，图10B）；反之，过表达SLC1A5的肝癌细胞则明显促进M2型巨噬细胞极化标志物的表达情况（P<0.05，图10C）。与对照组相比，干扰SLC1A5的肝癌细胞与巨噬细胞共培养上清能明显促进T细胞分泌IFN-γ的能力（P=0.0011，图10D）；而过表达SLC1A5的肝癌细胞与巨噬细胞共培养的上清则显著抑制T细胞分泌IFN-γ的能力（P=0.0019，图10E）。

3 讨论

本研究采用TCGA、GTEx、CCLEs、CPTAC和HPA数据集，综合研究了SLC1A5在33种不同癌症中的表达模式及临床意义。本研究表明，SLC1A5在大多数癌症中都是高表达的，CPTAC数据库和HPA的免疫组化分析在蛋白水平上进一步证实了这一点。与前人研究结果一致，SLC1A5在结直肠癌^［8］、肺癌^［21］和肾透明细胞癌^［22］中显著上调。但是，尚有个别肿瘤如肾嫌色细胞癌中SLC1A5的表达水平较癌旁组织中的表达水平明显降低，提示其在肾嫌色细胞癌中可能具有不同于其它肿瘤的生物学功能。此外，在部分肿瘤如乳腺癌、膀胱尿路上皮癌、前列腺癌中，SLC1A5在癌组织与癌旁组织表达未见明显差异，尤其乳腺癌中，无论SLC1A5 mRNA水平还是蛋白质水平，二者在癌组织及癌旁组织中表达水平均无明显差异，提示上述肿瘤可能不依赖于SLC1A5摄取谷氨酰胺。我们还发现SLC1A5的表达与HNSC、KIRC、LIHC和THCA等多种癌症的肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关^{［23， 24］}。Lu等^［25］报道SLC1A5与胃癌高淋巴结转移、TNM分期等恶性特征相关。然而，本研究结果显示SLC1A5表达水平不能区分胃癌患者不同淋巴结转移状态和癌症分期（数据未显示）。这种差异可能是由于不同肿瘤样本所致，因为之前的研究纳入了更多的晚期胃癌患者。本研究发现了SLC1A5表达与HNSC、KIRC、LIHC和THCA等几种癌症类型的肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关。

此外，我们还证实了SLC1A5的高表达与包括BLCA、BRCA、KIRC、LGG、LIHC、MESO、SARC和UVM在内的多种癌症的不良总生存期相关。SLC1A5高表达的KIRC、LGG、PAAD和THCA患者，其无病生存期明显缩短。与本研究结果一致，最近的一项研究表明SLC1A5的表达可能作为透明细胞肾细胞癌患者的预后指标^［22］；SLC1A5曾被报道与肝细胞癌患者不良总生存期相关^［23］。本研究结果也表明SLC1A5高表达与胰腺腺癌患者生存时间缩短相关，这与既往研究SLC1A5表达是胰腺腺癌预后不良的独立预测因素的结论一致^［24］。这些结果提示SLC1A5作为癌基因在多种肿瘤中显著高表达，其高表达与多种肿瘤患者进展及预后不良相关。

肿瘤微环境由成纤维细胞、免疫细胞、血管细胞和细胞外基质组成，是癌症发生和发展的温床^［26］。根据ESTIMATE评分，多种肿瘤微环境中SLC1A5表达水平与免疫评分呈显著正相关或负相关。肿瘤浸润性免疫细胞在多种肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用^［27］。据报道，SLC1A5的高表达与PDL1、PD1⁺、CD68⁺和CD20⁺免疫细胞显著相关^［16］。本研究结果阐明了SLC1A5在肿瘤中具有更广泛的预测价值，并表明SLC1A5的表达水平与肿瘤浸润性免疫细胞，特别是巨噬细胞的水平密切相关。我们观察到大多数免疫检查点相关基因与SLC1A5共表达，其中大多数与SLC1A5的表达呈正相关。总之，本研究表明SLC1A5在不同肿瘤中的表达与免疫浸润水平及免疫细胞功能密切相关，SLC1A5有望成为免疫治疗的潜在靶点。

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率及死亡率呈逐年增长趋势^［28］。我国是肝癌大国，肝癌发病率和死亡率居全球之首，5年生存率不足15%，严重威胁国民生命健康^［29］。肿瘤微环境作为肿瘤细胞赖以生存和发展的沃土，具有炎症、营养匮乏、缺氧及免疫抑制等特点，既能主导肝癌进展，还能影响免疫治疗的疗效^［30］。肿瘤相关性巨噬细胞是肿瘤微环境中数量最多，功能可塑性最强的一类炎症细胞，占炎症细胞总数的30%~50%^［31］。肿瘤相关性巨噬细胞浸润增加与肝癌的进展及预后密切相关，而抑制肿瘤相关性巨噬细胞向M2型极化被认为可能是抑制肝癌发生发展的关键环节之一^［32］。本研究结果显示，SLC1A5的表达水平与包括肝癌在内的多种肿瘤的肿瘤相关性巨噬细胞，尤其是M2巨噬细胞浸润水平呈正相关。此外，SLC1A5高表达且M2巨噬细胞浸润增加的肝癌患者生存期最差，表明SLC1A5和M2巨噬细胞浸润的综合评估可以更好地预测肝癌患者的预后。为了进一步明确SLC1A5在肝癌进展中的生物学功能，我们分别构建稳定过表达SLC1A5的肝癌细胞株及干扰SLC1A5的肝癌细胞株，通过体内外实验验证过表达SLC1A5能明显促进肝癌进展。

IFN-γ和Toll样受体配体如脂多糖等微生物成分能刺激巨噬细胞并诱导其活化成促炎M1型巨噬细胞，其能通过产生一氧化氮合酶活性氧、肿瘤坏死因子-α以及白介素12（IL-12）等发挥抗肿瘤作用^［33］。而刺激因子如IL-4、IL-10、IL-13等能诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，其通常以过表达IL-10、TGFB1等为特征，通过分泌多种细胞因子与肿瘤微环境中的多种细胞相互作用，抑制T细胞的功能，使肿瘤微环境表现为免疫抑制状态，从而发挥抗炎、促癌的作用^［34］。为了进一步明确SLC1A5与肝癌巨噬细胞M2型极化的关系，我们利用TCGA肝癌数据集（TCGA-LIHC，训练集）及ICGC-LIRI-JP（验证集）肝癌数据集表达谱数据，分析SLC1A5与M2型巨噬细胞分子标志物的相关性，训练集及验证集结果均显示SLC1A5与M2型巨噬细胞分子标志物IL-10、TGFB1、TGFB2、TGFB3等的表达呈显著正相关，这就提示肝癌中SLC1A5可能参与调控巨噬细胞的M2极化。本研究分别将M0巨噬细胞与干扰或者过表达SLC1A5的肝癌细胞共培养，共培养结果提示过表达SLC1A5能明显促进巨噬细胞M2型极化。同时，分别将M0巨噬细胞与干扰或者过表达SLC1A5的肝癌细胞共培养，取共培养体系的上清处理活化的T细胞，检测T细胞IFN-γ的分泌能力，结果提示与对照组相比，过表达SLC1A5肝癌细胞与M0巨噬细胞共培养的培养基能显著抑制T细胞IFN-γ的分泌能力，而干扰SLC1A5肝癌细胞与M0巨噬细胞共培养的培养基能显著促进T细胞IFN-γ的分泌能力，提示SLC1A5通过调控巨噬细胞M2型极化抑制T细胞的杀伤功能。

综上所述，对SLC1A5的泛癌分析表明，在33种泛癌种中，SLC1A5的表达与临床分期、预后及免疫细胞浸润水平有显著相关性，这有助于从临床肿瘤样本的角度确定SLC1A5在肿瘤发生发展中所起的重要作用。此外，本研究表明，在肝癌中，SLC1A5与肝癌中巨噬细胞的浸润和M2极化密切相关，且过表达SLC1A5通过促进M2型巨噬细胞极化抑制T细胞的杀伤功能，并促进肝癌进展。基于此，我们有理由推测开发靶向SLC1A5的抑制剂可能会提高包括肝癌在内的多种肿瘤的免疫治疗疗效。

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