槲皮素通过调控TP53基因抑制肾透明细胞癌的增殖和迁移

Quercetin inhibits proliferation and migration of clear cell renal cell carcinoma cells by regulating TP53 gene

摘要

目的 筛选槲皮素治疗肾透明细胞癌（ccRCC）的潜在分子靶点。 方法 运用网络药理学方法从多个数据库中筛选槲皮素的治疗靶点，运用孟德尔随机化方法从4907种血浆蛋白中筛选与ccRCC显著相关的靶点，构建药物-疾病网络模型，筛选出潜在的关键靶点，运用生物信息学技术评估这些靶点的作用，培养ccRCC细胞并用不用浓度槲皮素处理，行CCK-8实验、创伤愈合实验、RT-qPCR和Western blotting对筛选靶点进行验证。 结果 网络药理学和孟德尔随机化综合分析筛选出了TP53（OR=3.325，95% CI：1.805-6.124，P=0.0001）、ARF4（OR=0.173，95% CI：0.065-0.456，P=0.0003）和DPP4（OR=0.463，95% CI：0.302-0.711，P=0.0004）3个槲皮素治疗ccRCC的核心靶点。生物信息学分析表明TP53在肾透明细胞癌中表达增高（P<0.001）；生存分析显示高表达TP53的肾癌患者预后更差（P<0.001）；分子对接显示槲皮素与TP53的结合能为-5.83 kcal/mol；CCK-8实验和创伤愈合实验显示槲皮素在体外抑制786-O细胞的增殖和迁移（P<0.05）；RT-qPCR和Western blotting显示槲皮素在体外抑制TP53 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）。 结论 TP53可能是槲皮素治疗ccRCC的关键靶点，为槲皮素治疗肾透明细胞癌的分子机制研究奠定了基础。

Abstract

Objective To identify potential molecular targets of quercetin in the treatment of clear cell renal carcinoma (ccRCC). Methods The therapeutic targets of quercetin were screened from multiple databases by network pharmacology analysis, and the targets significantly correlated with ccRCC were screened from 4907 plasma proteins using a Mendelian randomization method. The drug-disease network model was constructed to screen the potential key targets. The functions of these targets were evaluated via bioinformatics analysis, and the screened targets were verified in cultured ccRCC cells. Results Network pharmacology analysis combined with Mendelian randomization identified TP53 (OR=3.325, 95% CI: 1.805-6.124, P=0.0001), ARF4 (OR=0.173, 95% CI: 0.065-0.456, P=0.0003), and DPP4 (OR=0.463, 95% CI: 0.302-0.711, P=0.0004) as the core targets in quercetin treatment of ccRCC. Bioinformatics analysis showed that TP53 was highly expressed in ccRCC, and patients with high TP53 expressions had worse survival outcomes. Molecular docking studies showed that the binding energy between quercetin and TP53 was -5.83 kcal/mol. In cultured 786-O cells, CCK-8 assay and wound healing assay showed that treatment with quercetin significantly inhibited cell proliferation and migration. Quercetin treatment also strongly suppressed the expression of TP53 at both the mRNA and protein levels in 786-O cells as shown by RT-qPCR and Western blotting. Conclusion TP53 may be the key target of quercetin in the treatment of ccRCC, which sheds light on potential molecular mechanism that mediate the therapeutic effect of quercetin.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / 肾透明细胞癌 / 网络药理学 / 孟德尔随机化 / TP53基因 / 分子靶点

Key words

quercetin / renal clear cell carcinoma / network pharmacology / Mendelian randomization / TP53 gene / molecular targets

肾透明细胞癌（ccRCC）是一种常见且高度恶性的泌尿系统肿瘤，是肾细胞癌（RCC）的主要亚型，约占所有肾细胞癌病例的80%。相比于其他类型的肾癌，肾透明细胞癌患者具有更高的肿瘤复发率和转移率^［1］。根据最新的癌症统计报告显示，全球每年约有140 000例肾透明细胞癌患者因病情恶化而死亡^［2-5］。近年来，研究人员致力于探索新的生物标志物和有效的治疗药物，以期改善肾透明细胞癌治疗效果。

槲皮素是一种广泛存在于水果、蔬菜和谷物中的天然黄酮类化合物。研究表明，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌等多方面的功效^［6-8］。近年来，槲皮素的抗癌作用得到了广泛研究。其能够通过多种途径抑制癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡并抑制肿瘤血管生成。通过调控Bcl-2/Bax蛋白比率和激活半胱天冬酶途径来诱导癌细胞凋亡，并在乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌等多种癌症类型中显示出抗癌效果^{［9， 10］}。然而，对于槲皮素在肾透明细胞癌中的作用以及分子机制仍然知之甚少。

本研究采用网络药理学和孟德尔随机化方法筛选槲皮素治疗肾透明细胞癌的作用靶点。网络药理学通过整合和分析多种数据库数据，模拟并深入解析药物、疾病与靶点之间的关系 。孟德尔随机化作为一种流行病学方法，利用单核苷酸多态性（SNP）作为暴露相关工具变量（IV），评估暴露与疾病之间的因果关系。本研究结合这两种方法，筛选出槲皮素的潜在治疗靶点，并进行生物信息学分析和体外细胞实验验证，以期揭示槲皮素治疗肾透明细胞癌的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

肾透明细胞癌细胞株786-O（中国科学院上海细胞库）；10%胎牛血清（Clark）；RPMI 1640培养基（Gibco）；CCK-8试剂盒（碧云天）；槲皮素试剂（Sigma）；TP53抗体、GAPDH抗体（ABclonal）；HRP标记羊抗兔IgG二抗（联科生物）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（南京诺唯赞）；引物合成（生工生物）。

1.2 细胞培养

肾透明细胞癌细胞系786-O培养在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，并放置在37 ℃含5%CO₂的细胞培养箱中培养。

1.3 CCK-8实验

将肾透明细胞癌细胞在6孔板中培养24 h，用不同浓度槲皮素（0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μmol/L）处理。继续培养24 h后，将5000个处理过的细胞转移到96孔板中。24 h后向每孔加入10 µL CCK-8试剂，然后放入37 ℃培养箱中继续孵育3 h。最后，使用酶标仪（BioRad Laboratories Inc）测量96孔板中细胞的吸光度A_{450 nm}。

1.4 创伤愈合实验

将细胞培养在6孔板中，当6孔板中的ccRCC细胞密度达到90%以上时，用10 µL移液器枪头在6孔板内划伤细胞，以产生厚而均匀的划痕。用PBS洗去漂浮的死细胞，并用血清缺乏的基础培养基代替以继续培养。在0 h和12 h后对划痕进行成像和分析，在光学显微镜上监测伤口愈合情况。

1.5 实时荧光定量PCR检测

使用PCR提取试剂盒提取不同浓度槲皮素（0、50、100、150、200 μmol/L）处理后的肾透明细胞癌细胞的总RNA。PCR中使用的引物序列如下：TP53正向引物5'-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3'反向引物5'-T CCGTCCCAGTAGATTACCAC-3'；GAPDH正向引物，5'-CAGCCTCAAGATCAGCA-3'，反向引物5'-TG TGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。通过2^-ΔΔct方法计算mRNA相对表达量，实验重复3次。

1.6 Western blotting检测

在6孔板中培养的肾透明细胞癌细胞经过24 h不同浓度槲皮素（0、50、100、150、200 μmol/L）处理后，使用胰酶进行消化。将消化下来的细胞在低温条件下使用RIPA裂解液进行裂解，以提取蛋白质。通过BCA试剂盒测定提取蛋白质的浓度。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离变性蛋白质，并将分离后的蛋白质转移到PVDF膜上。将带有蛋白质的PVDF膜置于5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h。根据蛋白质的相对分子质量，将膜条切割并分别置于不同的一抗溶液中，稀释比例为1∶1000，4℃冰箱中摇床孵育过夜。第2天，使用TBST清洗膜条以去除未结合的一抗，并在室温下孵育HRP标记的二抗2 h，稀释比例为1∶5000。使用TBST洗去未结合的二抗后，滴加曝光液进行免疫印迹反应。

1.7 槲皮素靶基因获取

利用TCMSP（http：//tcmspw.com/）^［11］、PharmMapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）^［12］、SwissTarget Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）^［13］、Drugbank（https：//go.drugbank.com/）^［14］、Binding database（http：//www.bindingdb.org/bind/index.jsp）^［15］、STITCH（http：//stitch.embl.de/cgi/input.pl？UserId=MxcokIPgQVMy&sessionId=O32YjbzG5Gio）等数据库检索槲皮素所含的有效化学成分，获取对应靶点，并利用UniProt数据库（http：//www.uniprot.org）将所有靶标转换为官方基因符号。

1.8 数据来源

1.8.1 血浆蛋白暴露数据获取

Protein Quantitative Trait Loci（pQTL）是指将蛋白质表达作为表型来研究遗传变异与基因表达之间的相关性。pQTL数据来自deCODE 数据库（https：//www.decode.com/summarydata/），该数据库包含4907种蛋白质，来源于血浆蛋白质组与遗传学和疾病的大规模整合。该数据集主要用于筛选与肾透明细胞癌相关的潜在靶点。

1.8.2 肾透明细胞癌结局数据集

利用GWAS数据库（https：//gwas.mrcieu.ac.uk/）中肾透明细胞癌的数据，其中包括疾病组971例和对照组217，821例。

1.9 双样本孟德尔随机化

使用 Two Sample MR包进行双样本孟德尔随机化分析。deCODE数据库中的蛋白表达水平作为暴露变量，而肾透明细胞癌被视为结果变量。采用Wald比率法评估单个SNP暴露的因果效应，而使用逆方差加权IVW方法评估两个或多个SNP暴露。进行异质性检验、多效性检验、留一法分析评估敏感性。

1.10 差异表达分析

对来自TCGA中肾透明细胞癌的RNAseq数据进行了名称转换和log2校正。使用R软件ggplot2包、limma包和beeswarm包对两组中基因的表达情况进行了统计分析和结果可视化。

1.11 分子对接

在Uniprot和RCSB PDB（https：//www.rcsb.org）中获取靶蛋白的结构文件，Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取主要化合物的三维结构，应用AutoDock软件^［16］进行分子对接，应用PyMOL对分子对接^［17］结果进行分析和绘图。

1.12 统计学分析

采用GraphPadprism8.0软件和R软件对实验数据进行统计学分析，所用数据用均数±标准差表示。两组之间的比较采用t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素靶点信息获取

通过TCMSP、PharmMapper、Swiss Target Predic-tion、Drugbank、Stitch和Binding database数据库获得槲皮素潜在靶点，通过筛选去重整合共获得靶点361个（图1）。

2.2 血浆蛋白与肾透明细胞癌的MR分析

有26个血浆蛋白质与肾透明细胞癌有因果关系；其中，有5个血浆蛋白与肾透明细胞癌呈正相关，21个血浆蛋白与肾透明细胞癌呈负相关（表1）。

2.3 槲皮素治疗肾透明细胞癌靶基因筛选

对361个槲皮素作用靶点和26个肾透明细胞癌相关的血浆蛋白靶点使用Venny2.1取交集，获得3个槲皮素治疗肾透明细胞癌的预测靶点，分别为TP53、ARF4和DPP4（图2）。

2.4 槲皮素治疗肾透明细胞癌核心靶基因孟德尔随机化分析

通过IVW、MR Egger回归法、加权中位数法、基于众数的简单估计、基于众数的加权估计5种MR分析方法进行两样本孟德尔随机化分析（图 3A~F）。TP53是肾透明细胞癌发病的危险因素，而ARF4和DPP4是肾透明细胞癌发病的保护性因素（图3G）。

2.5 槲皮素治疗肾透明细胞癌核心靶基因敏感性分析

对TP53、ARF4和DPP4这3个蛋白进行异质性检验（表2）。漏斗图显示这3个蛋白的工具变量分布均匀，没有明显的异质性，与计算结果一致。接下来对TP53、ARF4和DPP4和ccRCC进行多效性检验（图4A~C，表3）。所有结果的beta值均在0的一侧，说明单个SNP对孟德尔随机化结果的影响很小，结果保持稳定（图4D~F）。

2.6 生物信息学验证

TP53在多种肿瘤中的表达增高，在ccRCC中表达增高（P<0.001，图5A、B）；肿瘤组与癌旁组织配对表达也显示了同样的结果（图5C）；同时TP53在三、四期ccRCC中的表达水平高于一、二期（图5D、E）； ROC曲线显示TP53对ccRCC具有一定诊断价值，曲线下面积AUC=0.833（图5F）；免疫组织化学染色显示TP53在肾透明细胞癌组织中的表达水平要明显高于正常肾组织（图5G）。

2.7 细胞实验与分子对接验证

CCK-8实验显示，槲皮素在体外抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增殖，随着槲皮素浓度的增加，细胞增殖能力逐渐减弱（图6 A）。创伤愈合实验显示槲皮素在体外可以抑制肾透明细胞癌786-O细胞的增殖和迁移能力，并且随着槲皮素浓度增高抑制能力也得到了增强（图6 B）。将槲皮素的活性成分与TP53蛋白进行分子对接验证，显示结合能为-5.83 kcal/mol（图6C）。利用RT-qPCR技术检测经过不同浓度槲皮素处理后肾透明细胞癌细胞系中TP53 mRNA的表达水平（图6D），结果显示经过不同浓度槲皮素处理后肾透明细胞癌细胞中TP53 mRNA的表达水平降低，并且随着槲皮素浓度的提高TP53 mRNA的表达下降更为明显，表现出了一定的剂量依赖性（P<0.05）。经过不同浓度槲皮素处理后肾透明细胞癌细胞中TP53蛋白表达水平结果显示，随着槲皮素浓度升高，TP53蛋白表达降低（P<0.05，图6E）。

3 讨论

ccRCC作为肾脏最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制和有效治疗手段一直是研究的热点。近年来，天然产物在肿瘤治疗中的潜力逐渐受到关注，其中槲皮素以其广泛的生物活性和良好的安全性受到重视^［18］。本研究通过网络药理学与孟德尔随机化分析，探讨了槲皮素治疗肾透明细胞癌的分子靶点，为槲皮素在肾癌治疗中的应用提供了理论依据。

通过网络药理学分析，本研究获得了槲皮素的361个潜在靶点，这些靶点涉及多个生物过程和信号通路，表明槲皮素具有多靶点、多途径的药理作用^［19］。同时，孟德尔随机化分析从大量血浆蛋白中筛选出与肾透明细胞癌具有因果关系的26个蛋白，这些蛋白可能是肾癌发病的重要因素^［20］。本研究通过交集分析确定了TP53、ARF4和DPP4三个槲皮素治疗肾透明细胞癌的预测靶点。孟德尔随机化分析表明，TP53是肾透明细胞癌发病的危险因素，而ARF4和DPP4则是保护性因素。这一发现为槲皮素在肾癌治疗中的作用机制提供了新的视角^{［21， 22］}。生物信息学验证结果显示，TP53在肾透明细胞癌中的表达显著增高，且其表达水平与肿瘤分期呈正相关，表明TP53在肾癌的发病和进展中扮演重要角色^［23］。同时，ROC曲线分析显示TP53对肾透明细胞癌具有一定的诊断价值，进一步强调了其在肾癌研究中的重要性。分子对接验证显示，槲皮素的活性成分与TP53蛋白的结合能较低，表明它们之间具有良好的结合性。这一结果从分子层面解释了槲皮素可能通过作用于TP53来发挥抗肾癌作用^［24］。体外实验也表明，槲皮素能够有效抑制肾透明细胞癌细胞的增殖与迁移，qPCR和Western blotting结果表明槲皮素在体外可以抑制TP53的表达，并且这种抑制作用随着槲皮素浓度的增加而增强。这一发现与先前的研究一致，进一步证实了槲皮素可能是通过抑制TP53的表达来发挥抗癌作用^［25］。TP53在癌症生物学中的作用是多方面的，其抑癌和致癌功能取决于其表达水平和突变状态。TP53在不同类型的RCC中的突变率存在差异，生存分析表明，TP53/p53突变与肾癌患者生存率降低相关^［26］。Uhlman 等^［27］的研究发现，在175例肾肿瘤中，有49例（28%）出现p53 突变，且TP53表达与高肿瘤分级和分期有关。转移性病灶中的TP53阳性率高达85%，而原发肿瘤仅为36%。TP53免疫染色与无远处转移患者的生存率低密切相关，是非转移性RCC患者生存的独立预测因子。Shvarts等^［28］使用TP53单克隆抗体对RCC患者进行染色，发现TP53是局限性RCC患者肿瘤复发的重要预测因子，TP53表达增加与 RCC总生存期降低和疾病进展更快有关。 TP53表达增加与MDM2表达增加密切相关，并且TP53和MDM2表达增加的肿瘤患者的总生存期可能最差，然而，RCC中TP53表达的增加似乎与突变无关，更多是与MDM2的上调相关^［29］。总之，虽然TP53表达与 RCC的预后不良相关，但其机制可能更复杂，涉及突变型和野生型TP53以及 MDM2的作用。本研究结果表明TP53是肾透明细胞癌的危险因素；生物信息学分析也表明，TP53在肾透明细胞癌中表达增高可能与不良预后相关；网络药理学表明槲皮素可能是通过作用于TP53而发挥抗肿瘤作用的；体外细胞实验也表明槲皮素可以降低TP53的表达水平。因此，TP53可能是ccRCC 的潜在治疗靶点，但需要进一步研究以明确其具体作用和机制。

综上所述，本研究通过网络药理学与孟德尔随机化分析，揭示了槲皮素治疗肾透明细胞癌的潜在分子靶点，并初步验证了这些靶点的生物学功能和与槲皮素的相互作用。这些发现为槲皮素在肾癌治疗中的应用提供了理论基础和实验依据，也为进一步深入研究槲皮素的抗癌机制和治疗策略提供了新的思路。然而，本研究仅为初步探讨，未来仍需通过更多实验验证槲皮素对这些靶点的作用机制，并评估其在肾癌治疗中的实际效果。此外，槲皮素在体内的药代动力学、安全性以及与其他药物的相互作用等问题也需进一步研究。

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