百蕊草通过调节肠道菌群和调控EGFR/PI3K/Akt信号通路改善小鼠抗生素相关性腹泻

Thesium chinense Turcz. alleviates antibiotic-associated diarrhea in mice by modulating gut microbiota structure and regulating the EGFR/PI3K/Akt signaling pathway

摘要

目的 基于网络药理学与16S rRNA高通量测序探究百蕊草（TCT）治疗抗生素相关性腹泻（AAD）的作用机制。 方法 通过网络药理学收集百蕊草与AAD的共有靶点与基因，构建蛋白质相互作用网络，使用KEGG通路富集分析筛选关键信号通路，使用AutoDock Vina进行分子对接验证，并使用GROMACS进行分子动力学模拟以验证活性成分与核心靶点的静态及动态结合变化。动物实验部分采用灌胃盐酸林可霉素建立AAD小鼠模型，40只KM小鼠随机分为空白对照组、自然恢复组（NR）、TCT低剂量组（TCT-L）、TCT高剂量组（TCT-H），雌雄各半（n=10）。实验期间每天分别灌胃给予1%羧甲基纤维素钠和1.5 g/kg和3 g/kg的百蕊草凝胶溶液，观察并记录小鼠体质量变化和腹泻情况。使用HE染色观察各组小鼠结肠病理变化，使用ELISA法检测炎症因子IL-6和TNF-α含量，使用16S rRNA测序技术检测小鼠肠道菌群的变化，采用Western blotting检测各组小鼠EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达。 结果 网络药理学筛选得到66个百蕊草活性成分，并预测得到998个相关靶点，与1304个AAD靶点基因取交集得到68个潜在靶点，其中核心靶点有EGFR、STAT3、PIK3CA等。KEGG富集分析提示百蕊草主要通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。分子对接结果显示核心靶点EGFR与coniferin结合自由能最低，分子动力学模拟结果显示EGFR与coniferin在10 ns时保持稳定的构象，Gibbs自由能结果显示，当蛋白质回旋半径值为3.11~3.15且均方根偏差值为0.35~0.5时，EGFR与coniferin复合物处于相对稳定的构象状态。动物实验显示，百蕊草可改善小鼠结肠组织形态，减少炎症因子分布，降低结肠组织中TNF-α和IL-6水平（P<0.001）；提高肠道菌群多样性（P<0.05），调节关键菌群如联合乳杆菌属、拟杆菌属等的丰度；降低结肠组织p-EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白水平（P<0.01）。 结论 百蕊草能通过调节肠道菌群结构，调控EGFR/PI3K/Akt信号通路，降低TNF-α和IL-6炎症因子水平，达到治疗AAD的作用。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Thesium chinense Turcz. (TCT) for antibiotic-associated diarrhea (AAD). Methods Network pharmacology, KEGG pathway enrichment analysis and molecular docking were used to identify the shared targets and genes of TCT and AAD, the key signaling pathways and the binding between the active components in TCT and the core protein targets. In a Kunming mouse model of AAD established by intragastric administration of lincomycin hydrochloride, the effects of daily gavage of 1% carboxymethyl cellulose sodium or TCT gel solutions at 1.5 g/kg and 3 g/kg (n=10) on body weight and diarrhea were observed. HE staining, ELISA, 16S rRNA sequencing, and Western blotting were used to examine pathologies, expression levels of IL-6 and TNF-α, changes in gut microbiota, and protein expressions of EGFR, p-EGFR, PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt in the colon tissues of the mice. Results We identified a total of 66 active components of TCT and 68 core targets including EGFR, STAT3 and PIK3CA. KEGG pathway enrichment analysis suggested that the therapeutic effects of TCT was mediated primarily through the PI3K/Akt signaling pathway. Molecular docking showed that EGFR had the highest binding affinity with coniferin, and the EGFR-coniferin complex maintained a stable conformation at 10 ns, whose stability was also confirmed by Gibbs free energy analysis. In the mouse models of AAD, treatment with TCT significantly improved colonic tissue morphology, decreased colonic levels of TNF-α and IL-6, increased gut microbiota diversity, and modulated the relative abundances of the key genera including Lactobacillus and Bacteroides. TCT treatment also markedly reduced protein expressions of p-EGFR, p-PI3K and p-Akt in the colon tissues of the mice. Conclusion TCT can alleviate AAD in mice by modulating gut microbiota composition, regulating the EGFR/PI3K/Akt signaling pathway, and reducing TNF‑α and IL-6 expressions.

Graphical abstract

关键词

百蕊草 / 抗生素相关性腹泻 / 网络药理学 / 分子动力学模拟 / 16S rRNA基因测序 / EGFR/PI3K/Akt信号通路

Key words

Thesium chinense Turcz. / antibiotic-associated diarrhea / network pharmacology / molecular dynamics simulation / 16S rRNA gene sequencing / EGFR/PI3K/Akt signaling pathway

自青霉素发现以来，抗生素为全球的细菌感染相关性疾病提供了有效的治疗方法，但抗生素的滥用成为了一个全球性的问题^［1］。中国是最大的抗生素使用国，其抗生素相关性腹泻的发病率为5%~30% ^{［2， 3］}。抗生素相关性腹泻（AAD）是由于抗生素的使用导致肠道菌群紊乱，降低了短链脂肪酸的含量，导致未吸收碳水化合物增加^［4］。在中医理论中，AAD的病因归结于抗生素的使用导致胃肠道正气亏虚，脾胃失调、水谷不化，湿浊内生，进而导致腹泻^［5］。中医临床上将其病机分类为湿热型、寒湿型、脾胃虚弱型、及脾肾阳虚型，其中湿热型AAD患者多因细菌、病毒等外邪侵袭，导致湿热内生 ^{［6， 7］}。中医在治疗AAD时注重整体的祛邪扶正，常采用具有广谱抗菌作用的中药，在杀灭病原菌的同时，可通过调节肠道菌群恢复肠道微生态平衡，降低肠道炎症反应，修复肠黏膜屏障，调节免疫，增强机体防御能力^［8］。百蕊草（TCT）性寒，味辛、微苦、涩，具清热解毒、补肾涩精之功效，有着“植物抗生素”的美誉 ^［9］。有研究表明，百蕊草醇提物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用^［10］。百蕊草抗炎、抗氧化的作用也被用于呼吸道疾病的防治中^［11］，但其在肠道菌群的作用方面还未被深入探讨。

网络药理学聚焦于基因网络、药物相互作用和疾病之间的关系，以深入理解活性化合物的药理作用机制^［12］。分子动力学模拟通过计算机模拟并运用牛顿力学，动态模拟小分子与蛋白质在不同条件下的结合行为，以弥补分子对接仅能体现分子在某个特定时间点的结合状态，而无法反映分子结合过程中的动态行为、稳定性和灵活性的问题^{［13， 14］}。16S rRNA测序用于分析肠道微生物群的多样性和群落结构变化，揭示不同处理组在微生物层面的影响机制，为探讨药物对肠道健康的作用提供微生物学依据。尽管既往已有研究在网络药理学框架下对百蕊草的活性成分及相关分子机制进行了探索，并在肝损伤等方面获得了初步成果^［15］，然而目前此类研究缺乏多维度实验验证及对复杂系统性疾病的全面解析。本研究通过网络药理学、分子对接和分子动力学模拟预测了百蕊草治疗AAD的潜在作用靶点及信号通路，并对预测结果进行了验证；通过盐酸林可霉素诱导AAD小鼠模型，结合16S rRNA高通量测序技术，深入分析百蕊草对肠道微生物群落组成和多样性的调节作用，旨在为百蕊草的临床应用提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雌雄各半的7周龄SPF级KM小鼠，购自杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK（浙）2024-0004。动物饲养于SPF级实验动物房中，温度保持在20±2 ℃，12 h黑暗/光照循环。使用标准鼠饲料和水进行动物饲养，动物实验经安徽科技学院实验动物伦理委员会批准（伦理批号：AK2024043）。

1.2 药物制备

百蕊草（Thesium chinense Turcz.）由安徽九华华源药业有限公司提供（2024年），经安徽科技学院中药鉴定领域刘汉珍教授鉴定为檀香科百蕊草。准确称取30 g百蕊草全草，并打碎成粉，将其放入800 mL的65%乙醇溶液中，在65 ℃条件下进行超声提取50 min。随后将提取液减压浓缩，置入100 mL的1%羧甲基纤维素钠中（生药含量0.3 g/mL），混匀，于4℃保存。

1.3 试剂与仪器

盐酸林可霉素（源叶生物），DNA 抽提试剂盒（百泰克），AMPure XP试剂盒（Beckman Coulter），TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（江苏酶免），兔抗小鼠EGFR、兔抗小鼠p-EGFR、兔抗小鼠Akt、兔抗小鼠p-Akt、β-actin、羊抗兔二抗（武汉三鹰），兔抗小鼠PI3K（MERCK），兔抗小鼠p-PI3K（亲科生物研究中心）。

实时荧光定量PCR仪（Roche）；Illumina NovaSeq 6000双端测序平台（Illumina）；多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。

1.4 网络药理学分析

通过文献收集百蕊草相关活性化合物，并使用SwissTargetPrediction数据库及Pharm Mapper数据库对药物潜在靶点进行预测^［16］。从DisGeNET、GeneCards、OMIM等数据库收集与AAD相关的靶点。

将百蕊草与AAD的交集靶点导入STRING数据库中，以构建药物与疾病共同靶点的蛋白质相互作用（PPI）网络。将数据导入Cytoscape 3.7.2软件中，对Degree、Closeness和Betweenness值进行中位筛选，以分析靶点间的相互作用及百蕊草治疗AAD的核心靶点，并以此构建“药物-化合物-疾病-靶点”网络以进行可视化分析，根据Degree值排序获取关键化合物。

采用DAVID工具对百蕊草与AAD共同靶点进行KEGG通路富集分析。

1.5 分子对接与分子动力学模拟验证

采用AutoDock Vina对核心靶点及核心化合物进行分子对接，并利用PyMOL软件将数据可视化，以全面了解活性化合物和靶蛋白之间的相互作用^［17］。采用GROMACS进行分子动力学模拟，其中活性成分使用gaff力场参数，蛋白质使用ff99SB-ILDN力场^［18］。将蛋白质结构置于模拟盒中，并用SPC/E水溶剂化，用Cl^-离子进行中和。随后分别使用最陡下降法和共轭梯度法实现能量最小化，并进行恒压恒温系综和恒体积恒温系综预平衡，最后进行50 ns的动力学模拟。通过均方根偏差（RMSD）分析以验证药物与关键靶点之间的结构稳定性，通过蛋白质的回旋半径（Rg）分析观测复合物的结构紧凑性，通过Gibbs自由能景观图表征动力学模拟过程中的最低能量构象^［19］，从而进一步支持网络药理学预测结果的可靠性。

1.6 结合自由能计算

计算结合自由能可以验证受体-配体复合物中的分子间相互作用强度，并提供各类化学能对复合物稳定性的贡献。分子力学Poisson-Boltzmann表面积方法是定量计算受体-配体结合自由能的一种简单且有效的手段^［20］。本研究通过使用 GROMACS中g_mmpbsa工具来计算受体-配体复合物的结合亲和力^［21］，具体公式如下：

∆G_{bind}=∆G_{complex}-\left(∆G_{receptor}+∆G_{ligand}\right)（1）

∆G_{total}=\Delta G_{gas}+\Delta G_{solv}（2）

∆G_{gas}=\Delta G_{vdwaals}+\Delta G_{ele}（3）

∆G_{solv}=\Delta E_{pb}+\Delta E_{npolar}（4）

1.7 动物分组、造模和给药

小鼠经过1周的适应后，将40只小鼠随机分为空白对照组、自然恢复组（NR）、百蕊草低剂量组（TCT-L）和百蕊草高剂量组（TCT-H），10只/组。对照组每天灌胃生理盐水，其余各组则每天灌胃3 g/kg盐酸林可霉素，连续给药9 d。根据百蕊草在人类临床中的安全使用剂量换算为小鼠的等效剂量，在林可霉素期结束后，对照组和NR组均接受1%羧甲基纤维素钠，TCT-L组和TCT-H组分别给予1.5 g/kg和3 g/kg百蕊草，连续给药12 d后停药。末次给药12 h后使用颈椎脱臼法处死小鼠，收集结肠和粪便并储存在-80 ℃。

1.8 一般情况观察

实验期间，称取小鼠体质量，并监测记录小鼠的行为状态及粪便的特征，并以此评估各组小鼠腹泻的严重程度。具体评分标准如下：干燥且成型的粪便记0分；成型但湿润的软便且精神状态一般记1分；不成形的粪便伴随精神萎靡的情况记3分。

1.9 小鼠组织学观察

收集小鼠的结肠组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡的包埋和切片处理，在HE染色后，观察结肠切片的病理变化。

1.10 小鼠结肠中TNF-α和IL-6水平的测定

将结肠组织在3倍体积的冷PBS缓冲液（pH=7.4）中匀浆后，以3000 r/min在4 ℃离心20 min，收集上清液。通过ELISA试剂盒进行测定，并于450 nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线，计算各组样品TNF-α和IL-6水平。

1.11 微生物DNA提取和16S rRNA基因测序

按照说明书操作，从粪便样本中使用DNA提取试剂盒提取微生物DNA。采用RT-qPCR方法测定最终的DNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性。利用引物341F/805R（341F：5'-CCTACGGGNGG CWGCAG-3'；805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAAT CC-3'）。引物合成公司：杭州联川生物技术股份有限公司对V3-V4可变区进行16S rRNA基因扩增。再使用AMPure XP试剂盒纯化PCR扩增产物，并进行检测和定量分析。纯化后的扩增产物在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。

测序后的数据会过滤低质量的序列和嵌合体序列，得到高质量CleanData。再基于CleanData通过Qiime2的DADA2进行序列降噪，去除高通量测序数据中可能存在的 PCR 扩增与测序错误，获得有代表性的正确生物学序列的丰度表格，进一步进行alpha多样性分析、beta多样性分析、物种组成分析和Lefse分析。

1.12 Western blotting法检测结肠组织EGFE、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达

从小鼠结肠组织中提取并收集总蛋白，测定其浓度。蛋白样品在10%的SDS-PAGE凝胶中分离后，转移至PVDF膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入EGFR（1∶1000）、p-EGFR（Tyr1069，1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-PI3K（Tyr458、Tyr199，1∶1000）、Akt（1∶2000）、p-Akt（Ser473，1∶10000）、β-actin（1∶6000）的特异性一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔二抗（1∶4000），室温孵育1 h。使用ECL化学发光底物进行蛋白检测，条带强度通过ImageJ软件进行分析，蛋白表达水平以β-actin为内参进行归一化。

1.13 统计学分析

采用SPSS26.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学分析

通过文献收集并筛选得到66个TCT有效成分，并预测得到998个相关靶点。通过疾病数据库获得1304个AAD相关靶点。百蕊草与AAD靶标基因取交集得到68个靶点，PPI分析获得54个蛋白和153条边，最终得到5个核心靶点分别是EGFR、STAT3、PIK3CA、PIK3R1、PTPN11。通过Cytoscape3.7.2软件得到“疾病-药物-化合物-基因”网络。KEGG通路富集分析显示，PI3K-Akt信号通路可能是百蕊草治疗AAD的关键通路（图1A~D）。

2.2 分子对接及分子动力学模拟

将5个核心蛋白与“疾病-药物-化合物-基因”网络分析中Degree值排名前10的重要化合物进行分子对接。其中核心蛋白EGFR与coniferin结合自由能最低，为-8.8 kcal/mol。分子对接结果可视化显示，coniferin通过与氨基酸PHE-856形成氢键相互作用，维持和EGFR之间的稳定构象（图1E~F）。选择最具代表性的复合物（EGFR与coniferin）进行50 ns的动态结合模拟，并进行RMSD分析、Rg分析及Gibbs自由能分析（图2）。RMSD分析显示，EGFR与coniferin复合物在10 ns时保持稳定的构象，EGFR与coniferin结合后蛋白质构象变化较小，复合物相互作用稳定。连续RMSD曲线显示，在整个模拟过程中，化合物牢固地附着在EGFR上。较低的蛋白质Rg值表明，在50 ns的模拟过程中配合物的结构紧凑。Gibbs自由能景观图显示，当Rg值为3.11~3.15且RMSD值为0.35~0.5时，EGFR与coniferin复合物处于相对稳定的构象状态。

采用10~50 ns的RMSD轨迹计算EGFR与coniferin复合物的结合自由能，结果表明复合物的平均结合自由能为-30.94 kcal/mol。其中40 ns的平均范德华能为-42.83 kcal/mol，静电能为0 kcal/mol，非极性溶剂化自由能为-0.89 kcal/mol，极性溶剂化自由能为12.77 kcal/mol，非极性溶剂化自由能为-0.88 kcal/mol，极性溶剂化自由能为12.77 kcal/mol。这些能量项的综合作用导致了该复合物的稳定结合。

2.3 百蕊草对小鼠一般情况的影响

在连续3 d灌胃盐酸林可霉素后，小鼠均出现了腹泻症状。腹泻小鼠表现为精神状态不佳、反应迟钝、毛发干枯无光泽、肛门发红，观察粪便发现湿软且不成形。造模结束，小鼠的腹泻评分达到最高值，AAD小鼠模型建立成功。

随后，NR组的小鼠在自然状态下逐渐恢复，TCT组则分别接受不同剂量的百蕊草醇提物治疗。随着给药时间的延长和TCT给药剂量的提高，TCT-H组和TCT-L组的腹泻评分逐渐降低，至第18天，TCT-H组的小鼠腹泻缓解的情况优于NR组（P<0.05）。造模第6天开始，NR组小鼠体质量与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），NR组小鼠体质量增长缓慢。与NR组相比，TCT-L组和TCT-H组小鼠增重率提高（P<0.05，图3）。

2.4 TCT对小鼠结肠结构的影响

在治疗期结束后，对照组肠腺数量丰富，排列紧密，无炎性细胞浸润。NR组肠腺排列疏松，杯状细胞萎缩，粘膜固有层中有较多的炎性细胞浸润。与NR相比，TCT-L组、TCT-H组肠道组织出现的病理现象均有不同程度的缓解，其中TCT-H组肠道组织各层级结构分明，肠腺排列紧密，固有层炎性细胞减少（图4）。

2.5 TCT对小鼠结肠TNF-α和IL-6水平的影响

在TCT给药12 d后，小鼠结肠ELISA检测结果显示，与对照组相比，NR组小鼠结肠TNF-α和IL-6水平升高（P<0.001）。与NR组比较，TCT-L组、TCT-H组结肠组织中TNF-α和IL-6水平降低（P<0.001，图5）。

2.6 TCT对小鼠肠道菌群多样性的影响

2.6.1 Alpha多样性分析

Alpha多样性分析结果显示，NR组小鼠肠道菌群的丰度ACE和Chao指数低于对照组（P<0.01）；在使用百蕊草干预后，小鼠肠道菌群的丰度提升（P<0.05）。NR组小鼠物种多样性Shannon指数低于对照组（P<0.01），TCT-H组与对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。物种等级丰富图显示，TCT-H组相较于NR组小鼠肠道中物种数量及物种丰富度提高，且物种分布均匀，TCT-L组无明显变化（图6）。

2.6.2 Beta多样性分析

PCoA分析结果显示，NR组与对照组相距较远，TCT-L组和TCT-H组坐标明显更接近于对照组（P<0.01，图7A）；NMDS分析中Stress=0.12，差异分析结果可靠（图7B）。

2.7 TCT对菌群组成的影响

小鼠肠道菌群组成分析结果显示，在属水平上，联合乳杆菌属（Ligilactobacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、考拉杆菌属（Phascolarc tobacterium）为优势物种。对照组联合乳杆菌属平均比例为4.04%，NR组升高至26.98%，TCT低剂量治疗后降低至23.66%，TCT高剂量治疗后恢复至21.55%；对照组乳杆菌属平均比例为6.48%，NR组略微降低（6.03%），TCT低剂量治疗后升高至27.14%，TCT高剂量治疗后恢复至14.28%；对照组拟杆菌属平均比例为3.25%，NR组升高至21.01%，TCT低剂量治疗后降低至0.30%，TCT高剂量治疗后恢复至1.70%；对照组考拉杆菌属平均比例为9.43%，NR组降低至0.04%，TCT低剂量治疗后升高至4.18%，TCT高剂量治疗后恢复至8.29%（图7C、D）。

2.8 Lefse分析

当LDA阈值为4时，通过LEfSe分析发现，从门到属水平中NR组变形菌门（Proteobacteria）、γ-变形菌纲 （Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacterales）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拟杆菌属（Bacteroides）的丰度较高；对照组中疣微菌门（Verrucomicrobiota）、疣微菌纲（Verrucomicrobiae）、疣微菌目（Verrucomicrobiales）、小鼠粪菌科（Muribaculaceae）、未分类小鼠粪菌属（Muribaculaceae_unclassified）的丰度较高；TCT-L组中厚壁菌门（Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、乳酸菌科（Lactobacillaceae）、未分类乳杆菌属（HT002）的丰度较高；TCT-H组仅在目到科水平表现出差异，消化链球菌-Tissierellales目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、塔纳菌科（Tannerellaceae）的丰度较高（图8）。

2.9 TCT对AAD小鼠结肠组织EGFR、PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，与对照组相比，NR组的EGFR、PI3K、Akt的磷酸化蛋白表达水平升高（P<0.001）；与NR组相比，TCT-L及TCT-H组EGFR、PI3K、Akt的磷酸化蛋白的表达水平均降低（P<0.01，图9）。

3 讨论

肠道微生物群是一个相互作用的复杂生态系统，其物种组成在维持宿主的代谢和生理功能中起着重要作用^［22］。然而，抗生素的滥用会导致有益菌群的数量和多样性显著下降，进而会破坏肠道菌群的平衡，导致腹泻等一系列不良反应^［23］。本实验发现健康小鼠的优势菌属包括Akkermansia和乳酸杆菌属，它们在维持肠道菌群的稳定性和减少病原微生物的定植方面起着重要作用^{［24， 25］}。然而，随着抗生素的施用，对林可霉素敏感的菌群被抑制，耐药菌株则得以繁殖并占据生态位，导致肠道微生态失衡。这种失衡进一步引发肠道炎症反应加剧，肠道屏障功能受损，进而导致腹泻等临床症状的出现。

多数研究表明中草药在AAD的治疗中发挥重要作用，有研究发现大鼠AAD的发生总是伴随全身炎症，五味子可通过降低AAD大鼠炎症因子水平，改变肠道微生物菌群结构等方面缓解腹泻 ^［26］。百蕊草及其制剂在急性乳腺炎、大叶性肺炎及冠状病毒病等多种炎症模型中的抗炎效果得到了广泛研究^［27］。本实验结果显示，百蕊草能够显著改善AAD小鼠的腹泻症状，并对由AAD引起的肠道损伤具有良好的修复作用，同时减少了炎症细胞的浸润，并抑制了AAD小鼠结肠中TNF-α及IL-6的产生。

本实验通过网络药理学、分子对接及分子动力学模拟验证了百蕊草在AAD治疗中的潜在作用机制。通过PPI网络分析，确定了EGFR为核心靶点，而PI3K-Akt信号通路是百蕊草治疗AAD的潜在通路。既往有研究发现，PI3K-Akt通路的分子特征可能是评估肠道损伤风险的潜在生物标志物^［28］。分子对接和分子动力学模拟显示，EGFR与核心化合物coniferin的结合具有最高的结合分数，其稳定性通过GROMACS分子动力学模拟得到了验证。RMSD分析显示在10 ns时，EGFR与coniferin复合物的构象达到稳定状态，较低的蛋白质Rg值表明复合物的结构紧凑，折叠良好。有学者从辣木中筛选关键化合物与EGFR进行靶向结合，选取5个关键化合物进行了分子动力学模拟实验，其复合物在25 ns时达到稳定状态，RMSD值稳定在0.2~0.6 nm^［29］，与本实验中的复合物表现出同水平的稳定性与结构特性。Gibbs自由能分析揭示了EGFR与百蕊草关键活性物质的稳定构象状态，MM/PBSA 结合自由能分析证明了该复合物在分子层面的相互作用较为稳定。有学者通过对锦葵科植物抗癌的24种关键成分与EGFR进行分子动力学模拟验证，筛选出2个结合稳定的化合物，结合自由能分别为-42.17和-42.68 kcal/mol^［30］，与本实验中复合物结合自由能没有明显差距。

16S rRNA测序结果显示，高剂量百蕊草的干预显著提高了小鼠肠道菌群的alpha多样性指数，并对AAD小鼠紊乱的肠道菌群有所改善，表明其在促进肠道微生态平衡中发挥了积极作用。在属水平上，经百蕊草治疗后AAD小鼠异常升高的联合乳杆菌属及拟杆菌属的丰度有所下降，在对照组中的优势菌属、Akkermansia和考拉杆菌属的丰度有所回升。乳杆菌属在百蕊草治疗后异常升高，在百蕊草的剂量提高后，异常有所恢复。这与既往一项研究^［31］的结果相似，该研究发现西洋参多糖能够显著提高大鼠肠道中乳酸菌属和拟杆菌属的相对丰富度，减轻盐酸林可霉素引起的腹泻和菌群失调等抗生素相关副作用。乳酸菌常被用来改善抗生素导致的肠道菌群失调，有研究显示Lactobacillus rhamnosus GG能够通过下调肠道液体和电解质平衡及肠道屏障功能相关基因和蛋白，预防抗生素诱导的肠道损伤^［32］。其发挥作用的机制可以通过产生乳酸和乙酸等有机酸，或通过为短链脂肪酸产生菌提供更适宜的环境，直接促进肠道中短链脂肪酸的生成^［33］。Lefse分析进一步证实了百蕊草在属水平上显著影响多种细菌群落的丰度分布，尤其是高剂量组对拟杆菌属和乳杆菌属的恢复效应较为显著，提示百蕊草可能通过调节这些关键菌群来缓解AAD的病理状态。

表皮生长因子受体EGFR是细胞表面的一种受体酪氨酸激酶，属于ErbB受体家族^［34］。它主要负责将细胞外信号传递到细胞内，调控包括增殖、分化、迁移和生存多种细胞过程。EGFR在许多组织中广泛表达，且在细胞增殖、修复及免疫反应中发挥重要作用。当细胞外生长因子与细胞表面的EGFR结合后，会诱导EGFR发生二聚化，并通过自磷酸化进一步激活PI3K/Akt信号通路，并传递促炎和促存活信号^［35］。有研究发现，EGFR与AKT1为7-羟基香豆素治疗小鼠溃疡性结肠炎的潜在靶点，但未对其潜在的作用机制进行进一步探讨^［36］。本实验结果表明，百蕊草通过调控EGFR蛋白的磷酸化，抑制PI3K的激活，限制了Akt的进一步磷酸化激活。Akt活性的下降可直接降低下游促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6等）的释放，减弱细胞损伤和炎症反应。这一过程有助于恢复组织稳态，并减少AAD相关的病理性变化。这些结果验证了网络药理学的预测结果，为深入阐明百蕊草治疗AAD的作用机制提供了科学依据。

综上所述，本研究通过网络药理学结合16S rRNA测序，证实百蕊草可通过改善肠道菌群的丰度和多样性、提升益生菌含量、抑制致病菌定植，以及减轻结肠损伤和炎症反应等方面治疗AAD，并通过调节EGFR/PI3K/Akt信号通路发挥其作用。未来百蕊草是否能作为抗生素相关性腹泻的治疗策略有待进一步探讨，这也为临床治疗抗生素相关性腹泻提供了更多可能。

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