双重核酸纸条快速检测单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly毒素基因

A rapid method for detecting prfA and hly toxin genes of Listeria monocytogenes using double nucleic acid colloidal gold strips

摘要

目的 基于聚合酶链反应和胶体金技术相结合的双重核酸试纸条方法快速检测单核细胞增生李斯特菌prfA和hly两种毒素基因。 方法 采用加热煮沸法提取单核细胞增生李斯特菌DNA，以单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly为靶基因，分别用6-FAM标记prfA上游引物5'端，Biotin标记prfA下游引物5'端，Digoxin标记hly上游引物5'端和Biotin标记hly下游引物5'端，建立单核细胞增生李斯特菌的毒素基因检测方法，通过克隆转化、测序分析，克隆阳性对照品，研发试剂盒并对试剂盒特异性、灵敏度、复现性及稳定性进行评价，并通过样品检测对试剂盒进行验证。 结果 水煮法提取的单核细胞增生李斯特菌浓度为148.81±0.97 ng/μL，A₂₆₀/A₂₈₀在1.8~2.0范围内；PCR产物经克隆转化、测序对比，与GenBank数据库中基因序列的同源性均为100%；特异性检测，仅单核细胞增生李斯特菌为阳性结果，与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、蜡样芽胞杆菌无交叉反应；灵敏度检测，最低检测限为10^-2 ng/μL，比琼脂糖凝胶电泳高10倍；复现性检测，不同实验室不同人员分别对核酸试纸条进行验证，结果一致；稳定性检测，在第6、9、12月对核酸试纸条进行验证，稳定性较好。样品检测结果显示，本试剂盒可准确快速的检出样品中单核细胞增生李斯特菌。 结论 本剂盒可同时检测单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly毒素基因，具有特异性强、灵敏度高、复现性好、稳定性好等优点，对保障食品安全具有现实意义。

Abstract

Objective To detect prfA and hly toxin genes of Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction (PCR) and colloidal gold technology. Methods L. monocytogenes DNA was extracted by boiling method. With prfA and hly of L. monocytogenes as the target genes, the 5' ends of upstream and downstream primers of prfA gene were labeled with 6-FAM and biotin, and the 5' ends of upstream and downstream primers of hly gene were labeled with digoxin and biotin, respectively, to establish the toxin gene detection method. Using cloning transformation, sequencing analysis, cloning of positive control products, the detection kid was developed and its specificity, sensitivity, reproducibility and stability were tested, followed by verification with sample testing. Results The concentration of L. monocytogenes DNA extracted by boiling method was 148.81±0.97 ng/μL, and the A₂₆₀/A₂₈₀ ratio ranged from 1.8 to 2.0. The PCR products showed a 100% homology with the gene sequences in GenBank database after cloning, transformation and sequencing. The colloidal gold strip yielded positive results only for L. monocytogenes samples without cross-reactions with Staphylococcus aureus, Escherichia coli or Bacillus cereus, and its minimum detection limit was 10^-2 ng/μL, demonstrating a 10-fold greater sensitivity of the test than agarose gel electrophoresis. The test also showed good reproducibility of the results when performed by different operators with good stability of the test strips after storage for 6 to 12 months. The test results showed that this kit could accurately and quickly detect L.monocytogenes in the test samples. Conclusion The detection kit developed in this study can simultaneously detect prfA and hly toxin genes of L. monocytogenes with good specificity, sensitivity, reproducibility and stability for use in food safety inspection.

Graphical abstract

关键词

单核细胞增生李斯特菌 / prfA / hly / 双重核酸试纸条

Key words

Listeria monocytogenes / prfA / hly / double nucleic acid test strip

单核细胞增生李斯特菌（LM）是一种常见的食源性人畜共患病病原菌，易污染生肉、蛋、奶等多种食品^［1］。据研究报道显示^［2］，单核细胞增生李斯特菌感染的致病死率高达20%~30%，严重威胁人类健康。单核细胞增生李斯特菌的致病力与4个毒力岛（LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3、LIPI-4）^［3］密切相关，致病性单核细胞增生李斯特菌均存在LIPI-1，主要由prfA、hly、plcA、plcB、mpl和actA 6个基因组成，主导基因为prfA^［4］。hly基因编码的溶血素O是单核细胞增生李斯特菌的主要毒力因子之一^［5］。所以同时检测prfA基因和hly基因有助于快速检测致病性单核细胞增生李斯特菌，对保障消费者生命健康和公共卫生安全具有重要意义。

目前国内外对单核细胞增生李斯特菌的检测方法主要是传统培养法^［6］、分子生物学法^［7］、免疫法^［8］和质谱法^［9］等，其中传统培养法被誉为病原菌检出的“金标准”^［10］，但该方法操作复杂，用时长，且对操作人员的专业能力要求高。本研究研发的双重核酸试纸条试剂盒可实现快速可视化检测单核细胞增生李斯特菌，为监测单核细胞增生李斯特菌引起的食源性疾病提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

单核细胞增生李斯特菌标准菌株（ATCC19115）购自广东环凯微生物有限公司，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和蜡样芽胞杆菌均为北华大学医学技术学院病原微生物室保存菌种。

胶体金溶液（上海华蓝化学科技有限公司），链霉亲和素（北京金泰宏达生物科技有限公司），生物素化血清白蛋白（北京博尔西科技有限公司），兔抗6-FAM多克隆抗体、兔抗Digoxin多克隆抗体（上海生工生物工程股份有限公司），2×Taq PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司），引物自行设计，由上海生工合成并标记。

微量核酸蛋白测定仪DS-11FX+（Denovix）、PCR扩增仪ETC-821（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）、高速低温冷冻离心机Micro 21R（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株复苏及分离培养

在紫外照射灯照射30 min后的生物安全柜中，将菌株在血平板上进行复苏及分离培养。

1.2.2 水煮法提取菌株DNA

取ddH₂O 200 μL于1.5 mL EP管中，用接种环挑取3个单个菌落进行研磨配制成菌悬液，并用封口膜封好EP管孔，金属浴100 ℃ 10 min，4 ℃冷却30 min，4 ℃ 12 000 ×g离心10 min，弃沉淀，上清即基因组DNA，用微量核酸蛋白测定仪检测浓度和A_{260 nm}/A_{280 nm}值。

1.2.3 引物设计和标记

将GenBank中单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly基因序列作为靶基因，在NCBI primer-blast设计引物，其序列如下：

1.2.4 PCR反应体系、条件及电泳

反应体系（10 μL）：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，引物（F prfA、R prfA、 F hly、 R hly）各0.25 μL，DNA模板（10 ng/μL）0.5 μL，ddH₂O 3.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V，30 min，紫外凝胶成像仪观察结果。

1.2.5 阳性标准品的克隆和测序

PCR产物纯化后，与pGM-T载体25 ℃连接10 min，连接产物转入Top10感受态细胞中，37 ℃摇菌2.5 h，6000 r/min离心3 min，将菌液混匀后取50 μL涂布于可筛选蓝白斑的LB平板上，37 ℃培养16 h，挑取白色单个菌落于含有Amp LB液体培养基中增菌16 h，避光，提取质粒DNA进行PCR验证，PCR反应体系同1.2.4，验证后将质粒DNA送至上海生工生物科技有限公司进行双向测序，采用DNAMAN软件将测序结果与NCBI数据库中获取的基因序列进行比对分析。

1.2.6 制备双重核酸试纸条最佳条件的确定

胶体金溶液的制备确定标记链霉亲和素的最佳标记量；同时确定质控线（C线）的最佳标记量和prfA检测线（T₁）与hly检测线（T₂）的最佳包被量。

1.2.7 双重核酸试纸条的组装及结果判定

根据试纸条卡壳的尺寸，裁剪标准大小的PVC底板、NC膜、金标垫、样品垫、吸水纸进行组装，在1.5 mL的EP管中加入94 μL曲拉通溶液和6 μL PCR产物，混合后滴加在样品垫上，10 min观察结果。结果判定：若C线、T₁线、T₂线均出现红色线为prfA和hly双重毒素基因阳性结果，若C线和T₁线出现红色线，而T₂线未出现红色线为prfA基因阳性结果，若C线和T₂线出现红色线而T₁线未出现红色线为hly基因阳性结果，若C线出现红色线，而T₁、T₂线未出现红色线为阴性结果，若C线未出现红色线，则为该试纸条失效，应重新实验。

1.2.8 双重毒素检测试剂盒的设计

试剂盒组成见表2，20次用量。

1.2.9 双重毒力基因检测试剂盒特异性评价

提取单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和蜡样芽胞杆菌DNA，稀释至10 ng/μL，按照1.2.4进行PCR扩增，用1.5%琼脂糖凝胶电泳对比验证双重核酸试纸条特异性。

1.2.10 双重毒力基因检测试剂盒灵敏度评价

将单核细胞增生李斯特菌的DNA用ddH₂O进行倍比稀释，梯度依次为10¹~10^-4 ng/μL，以稀释的每个浓度为模板进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳对比验证电泳和核酸试纸条的最低检测限。

1.2.11 双重毒力基因检测试剂盒复现性评价

在3个不同的实验室由3个不同的操作人员分别进行实验，按照1.2.4中进行PCR扩增，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行对比验证双重核酸试纸条复现性。

1.2.12 双重毒力基因检测试剂盒稳定性评价

在第6、9、12个月用双重核酸试纸条进行稳定性验证，按照1.2.4进行PCR扩增，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳对比验证双重核酸试纸条稳定性。

1.2.13 人工污染模拟样品检测^［11］

称取25 g猪肉样品于225 mL的培养液中制备猪肉混合液，取1.5×10⁹ CFU/mL单核细胞增生李斯特菌菌悬液，依次用混合液稀释至1.5×10⁸~1.5×10¹ CFU/mL系列梯度，每个稀释度分别取1 mL提取DNA并作为模板用双重核酸试纸条进行检测。同时对每个稀释度的猪肉混合液进行PCR扩增，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳对比验证。

1.2.14 实际样品检测

选取4种生牛奶、生牛肉、熟肉制品、速冻水产品、凉拌蔬菜、冷冻饮品和西瓜共10个样品，对生牛肉、熟肉制品、速冻水产品、凉拌蔬菜和西瓜均取样25 g，4种生牛奶和冷冻饮品取样25 mL加入225 mL的培养液中，37 ℃培养24 h。取增菌液1 mL提取DNA，采用研发的双重核酸试纸条进行检测，同时采用国标法GB4789.30-2016^［12］中的第一法进行检测，比较两种方法的检测结果。

2 结果

2.1 菌株复苏及分离培养

将单核细胞增生李斯特菌复苏及分离培养后，可见圆形、不透明、灰白色菌落。

2.2 水煮法提取DNA结果

水煮法提取的单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和蜡样芽胞杆菌DNA浓度依次为148.81±0.97 ng/μL、193.27±1.82 ng/μL、153.47±0.41 ng/μL、103.77±1.87 ng/μL，A_{260 nm}/A_{280 nm}均在1.8~2.0之间，浓度和纯度均较好，符合后续实验要求。

2.3 阳性标准品克隆转化及测序结果

经蓝白班筛选后，挑取白色菌落进行增菌后提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，prfA和hly为引物进行PCR反应，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，结果均可见明亮而单一的条带（图1）。将prfA质粒和hly质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果经NCBI比对后同源性均为100%（图2、3），可将prfA质粒和hly质粒混合液作为双重毒力基因检测试剂盒的阳性标准品。

2.4 制备双重核酸试纸条最佳条件的确定

200 μL的胶体金溶液标记1 g/L链霉亲和素最适添加量为6 µL，质控线C线浓度为2.0 mg/mL，prfA检测线（T₁）兔抗6-FAM多克隆抗体浓度为0.55 mg/mL，hly检测线（T₂）Digoxin浓度为0.2 mg/mL时，呈现明亮清晰的红色线，显色结果最好。

2.5 双重毒力基因检测试剂盒特异性检测

在同等条件下，对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和蜡样芽胞杆菌几种常见的食品污染菌进行特异性检测，仅单核细胞增生李斯特菌出现明显清晰的3条红色线，其余只出现1条质控线（图4），与1.5%琼脂糖凝胶验证结果一致（图5），引物无交叉反应，试剂盒特异性良好。

2.6 双重毒力基因检测试剂盒灵敏度检测

将单核细胞增生李斯特菌DNA浓度进行倍比稀释，当DNA浓度为10^-1 ng/μL时，1.5%琼脂糖凝胶电泳和双重核酸试纸条均可观察到条带，但当DNA浓度为10^-2 ng/μL时，双重核酸试纸条仍可观察到3条红色线（图6），而电泳没有观察到条带（图7），双重核酸试纸条的最低检测限比琼脂糖凝胶电泳高10倍。

2.7 双重毒力基因检测试剂盒复现性检测

分别在3个实验室由不同的操作人员对试剂盒复现性进行检测，结果为单核细胞增生李斯特菌的质控线、检测线T₁和检测线T₂均出现红色线，空白对照只出现1条红色质控线（图8），与1.5%琼脂糖凝胶电泳一致（图9），试剂盒复现性良好。

2.8 双重毒力基因检测试剂盒稳定性检测

分别在第6、9、12个月对试剂盒稳定性进行检测，结果显示单核细胞增生李斯特菌的质控线、检测线T₁和检测线T₂均出现红色线，空白对照只出现一条红色质控线（图10），与1.5%琼脂糖凝胶电泳一致（图11），试剂盒稳定性良好。

2.9 样品检测

2.9.1 人工污染模拟单核细胞增生李斯特菌的样品检测

使用本研究研发的双重核酸试纸条试剂盒对人工污染的单核细胞增生李斯特菌的猪肉样品进行检测。结果显示，双重核酸试纸条试剂盒对猪肉样品的检测限为1.5×10⁴ CFU/mL（图12），琼脂糖凝胶电泳的检测限为1.5×10⁵ CFU/mL（图13），表明本研究研发的双重核酸试纸条试剂盒可有效鉴别单核细胞增生李斯特菌。

2.9.2 食品中单核细胞增生李斯特菌的实际检测

分别对选取的10个样品营养肉汤增菌液进行DNA提取，以单核细胞增生李斯特菌为阳性对照，采用本研究研发的双重核酸试纸条试剂盒进行检测，同时采用国标法检测，结果显示，其中一种生牛奶和速冻水产品检测出含有单核细胞增生李斯特菌（图14、15）。双重核酸试纸条试剂盒与国标法检测结果一致。

3 讨论

单核细胞增生李斯特菌是一种重要的食源性致病菌，近年来，国内感染单核细胞增生李斯特菌的检出率呈上升趋势^［13］，世界卫生组织将其列为仅次于大肠埃希菌、沙门菌和志贺菌的重要食源性致病菌，有研究^［14］分析了2007~2017年发表的肉制品中单核细胞增生李斯特菌检出情况的相关文献，发现单核细胞增生李斯特菌在保质期短的冷藏即食熟肉制品中的检出率远高于欧盟标准，感染风险较高。而随着当今社会人们生活节奏的加快，方便快捷的冷藏开袋即食熟肉制品已成为首选，伴随而来的是食源性疾病的爆发率逐年升高^{［15， 16］}，常导致轻症患者出现流感症状，重症患者则出现菌血症、败血症、脑膜炎甚至死亡^［17］，因此，建立一种快速、准确、灵敏、便捷和成本低的方法快速检测致病性单核细胞增生李斯特菌毒力基因势在必行。

目前，对于单核细胞增生李斯特菌的检测方法“金标准”是传统培养法，但该方法操作复杂，用时长，且对操作人员专业能力要求高；即使分离出菌株，也无法判断菌株是否具有致病性。所以研究人员进一步使用分子生物学方法鉴定菌株致病基因，如PCR技术和实时荧光定量PCR技术等，PCR技术具有特异性强、灵敏度高和准确性好等优点，但操作过程易污染且不能可视化结果。马力等^［18］利用实时荧光定量PCR技术检测单核细胞增生李斯特菌，具有不易污染和定量分析等优势，但成本较高，酶活性容易被各种食品基质成分所影响，造成假阳性结果。Suebwongsa等^［19］使用质谱法快速检测食源性病原体，虽高灵敏度、高精密度、高通量，但所需的仪器设备昂贵，不适于基层检测。免疫学方法利用抗原抗体特异性结合的原理可对致病菌进行定性分析，因其简单快捷的特点在检测致病菌方面有广泛应用。酶联免疫吸附试验相较于其他技术操作简单，特异性强，灵敏度高，可同时对大量样本检测，但对单克隆抗体的特异性要求高且制备繁琐，成品试剂盒的成本高^［20］。有研究等^［21］使用免疫捕获法用聚乙二醇介导的氨苄青霉素功能化磁珠捕获单核细胞增生李斯特菌，虽高灵敏度、高精密度，但对靶标的特异性要求高，否则容易捕获到许多杂菌。生物传感器是近些年的新兴技术，包括电化学式生物传感器和光学式生物传感器等多种类型，可进行定性和定量检测，且准确度高，但该技术读取荧光时需要大型仪器，对实验室环境要求较高^［22］。

胶体金技术具有快速简便、价格低廉和稳定性好等优点，几分钟内就能获得可视化结果。所以本研究建立基于PCR和胶体金技术相结合的双重核酸试纸条方法快速检测单核细胞增生李斯特菌prfA和hly两种毒素基因并研发试剂盒，可同时获得特异性强、灵敏度高、准确性和稳定性好的可视化结果，试剂盒包括五个部分，分别是DNA提取试剂、PCR反应管、阳性标准液、阴性标准液和双重核酸试纸条。本试剂盒中的DNA采用水煮法提取，仅需经过高温变性，低温溶解两步即可获取浓度和纯度均较好的DNA；PCR检测试剂共10 μL，其中包括2×Taq PCR Master Mix 5 μL，引物（F prfA、R prfA F hly R hly）各0.25 μL，ddH₂O 3.5 μL混匀组成预混液。检测时，按标本数取出对应的含有预混液的PCR管，仅需0.5 μL DNA模板即可实现PCR扩增，无需考虑反复预混液冻融问题；可视化双重核酸试纸条可同时检测出单核细胞增生李斯特菌的prfA和hly毒力基因，时间短，仅需10 min即可获得可视化结果，与电泳相比，节省了配胶、胶凝固和电泳的时间，至少缩短了40 min。目前PCR结合试纸条方法已在多个领域中被使用，如鉴别中药材伪品^［23］，检测食品安全^［24］，鉴定病原微生物感染^［25］等。

综上所述，本研究研发的双重核酸试纸条具有特异性强、灵敏度高、准确性好及稳定性好的特点，对检测环境要求不高，通过对不同样品的对比，双重核酸试纸条法与国标法GB4789.30-2016检测结果一致，因此该方法适合执法部门和检测人员的快速检测，本试剂盒的研发对规范食品生产安全、保障人民生命健康具有重要意义。

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基金资助

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