C6TSEDRVAJZ小分子化合物组合诱导人胎盘成纤维细胞分化为上皮样细胞

C6TSEDRVAJZ, a combination of small-molecule compounds, induces differentiation of human placental fibroblasts into epithelioid cells in vitro

摘要

目的 利用小分子化合物组合将人胎盘成纤维细胞（HPFs）重编程为化学诱导上皮样细胞（ciEP-Ls）。 方法 常氧条件下培养HPFs细胞，通过免疫荧光、PCR和染色体核型分析鉴定HPFs。生理性低氧条件下（37 ℃，5%O₂），HPFs在含有小分子化合物C6TSEDRVAJZ（CHIR99021、616452、TTNPB、SAG、EPZ5676、DZNep、Ruxolitinib、VTP50469、Afuresertib、JNK-IN-8、EZM0414）的培养基中进行诱导，诱导期间每日定时观察细胞形态。通过免疫荧光法、Western blotting和PCR技术检测上皮细胞标志物的表达水平。对诱导细胞进行染色体核型分析，并计算诱导效率。 结果 HPFs免疫荧光结果显示，表达成纤维表面标记物CD34和Vimentin，不表达上皮表面标志物；PCR结果显示，成纤维特异性基因S100A4、COL1A1高表达，且具有人正常二倍体核型。在低氧条件下诱导1 d后，部分HPFs细胞形态发生改变，由多突的纺锤形变成圆形或多边形，具有ciEP-Ls形态特征。诱导处理完成第4天，免疫荧光和Western blotting结果显示，诱导细胞能够高表达上皮细胞特征性标志物E-Cadherin和Lin28A（P<0.05）。PCR结果表明，细胞显著表达上皮标志物Smad3，GLi3，PAX8，WT1，KRT19和KRT18，而成纤维细胞表面标记物表达均下调，且诱导细胞具有人正常二倍体核型，HPFs重编程效率为（64.53±2.80）%~（68.10±3.60）%。 结论 小分子组合C6TSEDRVAJZ在低氧条件下成功将HPFs诱导为ciEP-Ls，且具有较高的诱导效率。

Abstract

Objective To reprogram human placental fibroblasts (HPFs) into chemically induced epithelioid-like cells (ciEP-Ls) using a combination of small-molecule compounds. Methods HPFs cultured under normoxic conditions were identified using immunofluorescence assay, PCR and chromosomal karyotyping. Under hypoxic conditions (37 ℃, 5% O₂), HPFs were cultured in a medium containing small-molecule compounds C6TSEDRVAJZ (CHIR99021, 616452, TTNPB, SAG, EPZ5676, DZNep, Ruxolitinib, VTP50469, Afuresertib, JNK-IN-8, and EZM0414), and the cell morphology was observed daily. The expression levels of epithelial cell markers in the induced cells were detected by immunofluorescence, Western blotting and PCR. Chromosomal karyotyping of the induced cells was performed and the induction efficiency was calculated. Results Before induction, HPFs showed positive expressions of fibroblast surface markers CD34 and vimentin and were negative for epithelial surface markers. PCR results showed high expressions of fibroblast-specific genes S100A4 and COL1A1 in HPFs with a normal human diploid karyotype. After one day of induction, the HPFs underwent morphological changes from a multinodular spindle shape to a round or polygonal shape, which was morphologically characteristic of ciEP-Ls. On day 4 of induction, the cells exhibited high expressions of the epithelial cell markers E-cadherin and Lin28A. RT-qPCR results also showed that the cells expressed the epithelial markers Smad3, GLi3, PAX8, WT1, KRT19, and KRT18 with significantly down-regulated expressions of all the fibroblast surface markers and a normal human diploid karyotype. The reprogramming efficiency of HPFs into ciEP-Ls ranged from (64.53±2.8)% to (68.10±3.6)%. Conclusion The small-molecule compound combination C6TSEDRVAJZ is capable of inducing HPFs into ciEP-Ls under hypoxic conditions with a high induction efficiency.

Graphical abstract

关键词

化学重编程 / 小分子诱导 / 成纤维细胞 / 上皮样细胞

Key words

chemical reprogramming / small molecule induction / fibroblasts / epithelioid-like cells

上皮细胞对生物体具有重要意义，其不仅构建起覆盖身体表面及腔室的防护屏障，更深度参与众多关键生理机能的运作^{［1， 2］}。在器官发育进程中，上皮细胞凭借迁移、分化、模式构建以及神经支配等行为，在器官塑形与功能赋予方面发挥积极作用。这些行为受复杂的细胞间交互机制与信号传导网络的调控，共同保障了器官发育的精准性与功能性^{［3， 4］}。2006年，日本京都大学山中伸弥教授的科研团队成功运用4种转录因子（TFs）将小鼠成纤维细胞诱导转化为诱导多能干细胞（iPSCs）^［5］，此成果为干细胞与再生医学研究领域开启了全新的纪元，极大地拓展了该领域的研究视野与发展空间。在细胞重编程技术的探索历程中，病毒载体介导的细胞重编程方法虽在诱导转化效率方面展现出一定成效，但它会致使基因组发生永久性改变，进而产生具有异质性的 iPSCs 细胞系^［6］，显著增加肿瘤形成风险。

与之相较，利用小分子化合物开展体细胞重编程具有独特的优势^［7］。近年来，借助小分子化合物组合策略将体细胞重编程为功能性细胞已成为再生医学领域研究的热点。小分子化合物因其种类繁多而有更大的选择余地，且具有较高的安全性，能够在重编程进程中以更为灵活精准的方式调控相关信号通路以及细胞的表观遗传修饰状态^{［8， 9］}。这一特性为攻克细胞移植治疗中供体细胞来源匮乏的难题开辟了新路径，有望在未来的再生医学临床应用中发挥关键作用，推动该领域向更为安全、高效、精准的方向发展^{［10， 11］}。有研究利用小分子化合物组合将山羊耳成纤维细胞（GEFs）成功诱导成了具有分泌乳汁功能的化学诱导乳腺上皮细胞，在裸鼠体内移植后，能够再生发育为具有分泌乳汁功能的正常乳腺结构^［12］。2022年，有研究首次验证了尾鳍成纤维细胞（kFFs）可以通过化学重编程方法转变为多能干细胞，成纤维细胞在化学重编程过程中会经历形态变化，形成上皮样细胞，这是重编程成功的一个重要标志^［13］。化学诱导上皮细胞在组织工程、器官重建、细胞移植等方面具有重要的应用价值^［14］。但目前在人源细胞方面的研究较少。人成纤维细胞具有易获取、增殖能力强、免疫原性低等特点，被认为是再生医学研究和应用的重要细胞来源，是最早被应用与重编程的细胞类型之一^{［15， 16］}。因此，利用小分子化合物诱导人成纤维细胞为上皮样细胞，将在细胞移植、组织修复和器官重建等方面具有重要应用价值。但目前仍处于研究和开发阶段，需要进一步的科学研究和临床试验来验证其安全性和有效性。

本研究使用小分子化合物组合C6TSEDRVAJZ对人胎盘成纤维细胞进行重编程，在低氧条件下短时间就能够成功诱导为上皮样细胞，大大缩短了诱导时间，并获得较高的诱导效率。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人胎盘成纤维细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（北京总部）。

1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基、Knock Out DMEM培养基、血清替代物、非必需氨基酸（NEAA）、L-Glutamax、B27 supplement、0.25%含EDTA胰蛋白酶、N2、B27、胎牛血清（FBS）、0.25% 胰酶（Trypsin-EDTA）、青霉素-链霉素（Gibco）；L-ascorbic acid 2-phosphate（VC2P）、TritonX-100（Sigma）； RepSox、TTNPB、SAG、Ruxolitinib、JNK-IN-8、3-Deazaneplanocin A（DZNep）（Selleckchem）；重组人BMP4蛋白（Bmp-4）、氯化锂（Licl）、EPZ5676、VTP50469、Afuresertib、SETD2-IN-1（EZM0414）、Nicotinamide（NAM）（MCE）；兔抗CD34（1∶500）、兔抗Vimentin （1∶500） 、兔抗COL1A1 （1∶1000）（Bioss）；鼠抗Lin28A （1∶300） 和鼠抗E-Cadherin （1∶300） （Santa Cruz）；驴血清（NDS）、 驴抗兔Cyanine 3（1∶1000）（Jackson Lab）；驴抗鼠Alexa Fluor 488（1∶500）、抗荧光淬灭剂（Invitrogen）；CHIR99021（碧云天）；多聚甲醛（山东西亚化学工业有限公司）；引物合成于中国生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 HPFs体外培养

将HPFs接种到T25培养瓶中，使用成纤维维持培养基（DMEM高糖培养基、15%FBS、1% L-Glutamax、1% NEAA、1%双抗）进行培养，根据细胞量进行传代处理，在CO₂培养箱中继续培养。

1.4 诱导HPFs重编程为ciEP-Ls

选用P3代以内状态良好的HPFs作为诱导起始细胞，以1.5×10⁴/孔接种到12孔板（或0.8×10⁴/孔接种到24孔板），置于CO₂培养箱37 ℃恒温培养，1~2 d后更换低氧诱导培养基：Knock Out DMEM、2% B27 supplement、1% Knockout Serum Replacement （KSR）、1% GlutaMAX、1% NEAA、1% Penicillin-Streptomycin、50 mg/mL Vc2p、5 mmol/L LiCl、1 mmol/L Nicotinamide （NAM）、20 ng/mL BMP4、CHIR999021 （5 mmol/L）、616452 （10 mmol/L）、TTNPB （2 mmol/L）、SAG （0.5 mmol/L）、EPZ5676 （2 mmol/L）、DZNep （0.05 mmol/L）、Ruxolitinib （1 mmol/L）、VTP50469 （0.5 mmol/L）、Afuresertib （1 mmol/L）、JNKIN8 （0.2 mmol/L）和 EZM0414 （0.2 mmol/L），移至三气培养箱中进行低氧（5% O₂）培养4~5 d。期间每2~3 d换液一次，密切观察细胞形态学改变并拍照记录，根据培养效果及时调整优化培养条件。实验重复3次。

1.5 免疫荧光检测HPFs和ciEP-Ls表面特异性抗原

将接种在无酶细胞爬片上状态良好的细胞进行免疫荧光处理。用4%多聚甲醛（PFA）固定，加入PBS润洗后进行封闭处理，将含有特定抗体的溶液与样本一起孵育过夜。次日使用荧光二抗室温孵育，用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚复染细胞核，抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜观察（Olympus）观察染色结果。

1.6 Western blotting检测HPFs和ciEP-Ls中蛋白表达情况

收集HPFs和ciEP-Ls两组细胞，加入混有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，利用超声破碎仪破碎后于冰上裂解，高速冷冻离心机离心，收集上清液既两组细胞的总蛋白。SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，使用相应抗体孵育并与对应二抗结合，化学发光法检测抗原抗体结合区条带，对各蛋白表达情况进行分析。

1.7 RT-PCR和RT-qPCR测定HPFs和ciEP-Ls中mRNA的表达情况

用RNA提取试剂盒提取HEFs和ciEP-Ls RNA，采用Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒将RNA逆转录成cDNA，后使用TB Green® Premix Ex Taq™ II 试剂盒加入提前设计好的引物进行上机（QuantStudio™ 6 Flex）处理并分析数据（表1）。将上机后的样本进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后分析表达情况。

1.8 对HPFs和ciEP-Ls进行核型分析检测

通过染色体G带核型分析检测HPFs和ciEP-Ls的增殖状况与遗传学特征，按照染色体核型制备标准方法，用秋水仙碱处理、低渗、固定、滴片与吉姆萨染色。在油浸物镜下观察分布良好的染色体中期分裂相，并用 VideoTesTKaryo 3.1 软件进行分析拍照。

1.9 统计学分析

采用Graphpad 8.0.1软件进行统计学分析，计量数据用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人HPFs初始细胞的鉴定

HPFs初始细胞呈现典型成纤维细胞形态特征（图1A），免疫荧光结果显示，成纤维细胞表面标记物CD34、Vimnetin高表达，上皮细胞标记物E-Cadherin与去分化再生基因Lin28A未表达（图1B）。RT-PCR检测结果表明成纤维细胞特异性基因S100A4、COL1A1均高表达（图1C）。染色体G显带结果显示HPFs是正常的二倍体细胞，没有来自其他物种的细胞交叉污染（图1D）。

2.2 小分子组合诱导HPFs重编程为ciEP-Ls

HPFs使用小分子组合进行重编程过程中，少部分细胞在低氧诱导1 d时形态会发生改变，待诱导4~5 d后细胞形态变化更加明显（图2A、B）。相同的诱导条件下，使用小分子Afuresertib比AKT Kinase Inhibitor的诱导效果更加显著（图2C）。诱导4 d后显微镜下随机选取3个视野，对视野中的ciEP-Ls数量与总细胞数进行精确统计显示，细胞诱导效率为（64.53±2.80）%~（68.10±3.60）%（图2D）。诱导初期，细胞形态由梭形渐趋圆润，内部骨架结构重排，边缘微绒毛结构显现。诱导中期，细胞进一步变圆，上皮细胞特有的 E -钙黏蛋白开始表达，核质比改变，形态更立体。诱导后期，细胞转变成多边形，紧密连接完整形成（图2E）。

2.3 ciEP-Ls诱导细胞的鉴定

将诱导得到的ciEP-Ls进行免疫荧光检测，结果显示，该细胞能够高表达上皮细胞表面标记物E-Cadherin和Lin28A（图3A）。Western blotting检测显示，ciEP-Ls中成纤维细胞表面标志物Vimentin和COL1A1的表达量降低，E-Cadherin和Lin28A蛋白表达量提高（P<0.05，图3B）。RT-PCR检测显示，上皮细胞相关基因Smad3、 GLi3、PAX8、WT1、KRT19和KRT18均高表达（图4A）。RT-qPCR数据分析结果（图4B）与RT-PCR结论一致。为进一步检测ciEP-Ls的遗传学特征，对诱导后细胞进行核型分析，染色体G显带结果显示ciEP-Ls是正常的二倍体细胞（图4C）。

3 讨论

有研究通过小分子组合成功将小鼠成纤维细胞重编程为上皮样细胞^［17］，本研究参考该体系，但人胎盘成纤维细胞并没有发生形态学的明显改变，说明该体系可能不适用于人胎盘成纤维细胞的重编程。本研究对诱导体系进行优化，将小分子AKT Kinase Inhibitor替换为Afuresertib，成功将人胎盘成纤维细胞转分化为上皮样细胞，并具有较高的诱导效率。

Afuresertib是一种新型的ATP竞争性AKT激酶抑制剂，它能够精准高效的抑制AKT1、AKT2和AKT3激酶^［18］。有研究表明Afuresertib能够导致mTOR和GSK-3通路蛋白的去活化^［19］，当GSK-3信号通路被抑制时，β-catenin的降解减少，其在细胞内的积累增加，进而转移到细胞核中激活靶基因的转录^{［20， 21］}，这可能促进细胞去分化状态，为重编程创造条件。同时Afuresertib能够上调周期抑制蛋白p16的表达，其上调与细胞衰老有关，可能使细胞周期停滞，这是细胞诱导过程中的一个关键步骤^［19］。这些特性使得Afuresertib能够更加精准地调控细胞命运，使其在诱导过程中更加有效。AKT Kinase Inhibitor相较于Afuresertib，在AKT信号通路的特异性调控、临床试验中的安全性展示以及药代动力学特性方面，均未表现出更显著的优势^［22］。本研究中，Afuresertib通过抑制AKT 激酶的活性，直接影响相关信号传导途径，进而促进细胞诱导分化，在较短的时间内即完成细胞的重编程，大大增加了ciEP-Ls的诱导效率，但其具体作用机制还需进一步研究。

CHIR99021是一种特定的GSK-3抑制剂，其作用机制在于抑制GSK-3的活性，这一特性使其在化学重编程领域得到广泛应用。GSK-3作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，调控细胞内超过40多种蛋白质的磷酸化过程，尤其在Wnt-β-catenin信号通路中扮演重要角色，负责传导细胞分裂与增殖的信号。在Wnt信号传导过程中，GSK-3和β-catenin结合，并通过磷酸化促使其降解，从而抑制下游基因的转录激活。在本诱导体系中，CHIR99021通过选择性的抑制GSK-3的活性，阻断了β-catenin的磷酸化和降解，使其得以稳定并在细胞核内积累，进一步参与转录过程，从而促进细胞重编程^［23］。

SAG是一种有效的Hedgehog信号通路激活剂。在成纤维细胞向人类化学诱导的多能干细胞（hCiPS）转变过程中，SAG与其他小分子（如CHIR99021、616452、Y27632等）联合使用，改变成纤维细胞的身份、促进细胞增殖并重新激活去分化相关基因表达。在本诱导体系中，这一转变伴随着上皮细胞标志物基因（如KRT18、KRT19）的表达上调，以及成纤维细胞标志物基因表达的下调^［23］。上皮样细胞状态是化学重编程中的一个重要中间阶段，它为最终形成hCiPS细胞提供了必要的分子基础和可塑性特征。

EPZ5676是一种特异性的DOT1L抑制剂，通过降低H3K79me3的水平，对基因表达和细胞状态产生显著影响。EPZ5676能够通过改变表观遗传修饰，与Brdu等其他小分子化合物通过各自独特的机制发挥协同效应，共同推动细胞重编程的进程^［24］。在本诱导体系中，EPZ5676可能通过参与塑造细胞的表观遗传记忆和可塑性，从而有助于清除细胞原有的分化相关表观遗传标记，同时建立新的与靶目标细胞状态相适应的表观遗传模式，使细胞能够摆脱原有的发育轨迹限制，逐步获得ciEP-Ls的特性和功能。

DZNep是一种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的甲基转移酶抑制剂，能够调控多种组蛋白甲基化修饰，包括组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）和组蛋白H4第20位赖氨酸（H4K20）的甲基化^{［25， 26］}。此外，DZNep可能会通过调节与细胞周期相关基因的表达，促进上皮样细胞的增殖。在将上皮样细胞重编程为iPSCs的过程中，DZNep的应用有助于提升转化效率^{［17， 27］}。本研究诱导体系中，小分子DZNep可能通过降低H3K27me3的修饰水平^［28］，来激活重编程过程中被沉默的上皮标记基因，促进成纤维细胞向上皮样细胞的转化。

Ruxolitinib是一种酪氨酸激酶抑制剂，在化学重编程过程中，它通过调节JAK- STAT 信号通路在细胞增殖、分化等生理过程中发挥关键作用。Ruxolitinib通过抑制JAK- STAT通路，减少由过度活跃的JAK - STAT 信号引起的细胞异常分化。在本诱导体系中，这种抑制作用可以为细胞创造一个相对稳定的内部环境，使细胞能够更好地响应其他重编程小分子地诱导，避免细胞因异常信号而偏离预期的重编程方向。

VTP50469是一种高选择性的Menin-MLL相互作用抑制剂，能够与β-catenin 直接相互作用，参与调节Wnt信号通路的转录活性。有研究开发了一种基于核小体的光亲和探针，结合定量蛋白质组学方法，成功鉴定Menin为H3K79me2的“阅读器”，揭示了Menin可能富集于被H3K79甲基化标记的基因增强子上并参与基因转录的调控^［29］。此外，使用小分子组合VTP50469、AKT kinase inhibitor、CX4945和5-iodotubercidin能够显著提高化学诱导的效率^［17］。本研究中，VTP50469通过与 β-catenin 的相互作用，可能改变了 Wnt 信号通路中关键转录因子的活性或与靶基因的结合能力，进而促进细胞向上皮基因表达上调，同时抑制维持细胞原有分化状态的基因表达，从而推动细胞向上皮样状态转变。

EZM0414作为SETD2组蛋白甲基转移酶抑制剂，通过与 SETD2酶的活性位点结合，阻断其对组蛋白进行甲基化修饰的能力^［30］。在细胞重编程领域，EZM0414显示出促进人皮肤成纤维细胞向诱导上皮样细胞状态转变的潜力，显著提高了重编程至人化学诱导多能干细胞（hCiPSCs）的效率。研究发现，EZM0414通过调节关键的表观遗传修饰^［31］，可能有助于克服细胞状态转变中的障碍，使得上皮样细胞集落的形成更为频繁，为后续获得高质量的hCiPSCs提供了有利条件。

TGF-βR1基因表达下调会引起下游SMAD3基因表达上调，从而诱导山羊成纤维细胞逆转回到胚胎外胚层样状态，逃脱成纤维细胞特异性基因表达程序，进而建立乳腺上皮细胞特异性基因表达程序^［12］。RepSox又称616452，是一种高选择性的TGF-β-RI/ALK5的抑制剂 ^［32］。RepSox作为重编程的一种诱导剂，通过影响细胞内TGF-β信号通路，来促进细胞的重编程^［33］；同时，TGF-β可以通过非经典途径发出信号，激活c-Jun N末端激酶（JNK）信号传导。JNK即c-Jun氨基末端激酶，是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于丝裂原活化激酶（MAPK）信号通路的一个亚家族，处于MAPK级联的第3层，由MAP激酶激活，TGF-β能够通过MKK4快速激活JNK通路^［34］。JNK-IN-8是一种有效的JNK抑制剂^［35］。本研究中，在诱导过程中引入小分子JNK-IN-8和 RepSox后，表达LIN28A的上皮样细胞集落的形成得到显著增强。其潜在机制在于JNK信号通路的过度激活与炎症反应的加剧密切相关。JNK-IN-8通过特异性地结合JNK并抑制其激酶活性，能够在分子水平上干扰JNK信号通路传导。这一抑制作用可能进一步导致炎症相关基因表达下调，进而减轻因炎症反应对细胞诱导产生的不利影响，为细胞诱导创造一个相对稳定且有利于细胞命运转变的微环境。RepSox主要通过抑制TGF‑β信号通路发挥作用。本研究中，当 RepSox 抑制TGF-β信号通路时，会引发一系列细胞内的级联反应。一方面，它可能改变细胞间通讯分子的表达或活性，进而调整细胞之间的相互作用方式；另一方面，它会影响细胞骨架相关蛋白的磷酸化状态或分布，促使细胞形态朝着有利于上皮样细胞形成的方向改变，进而协同 JNK-IN-8 共同促进上皮样细胞集落的形成。正是小分子化合物之间的协同效应，以及它们对细胞内复杂信号通路的精细调控，共同推动了细胞诱导过程朝着预期的方向发展，最终实现表达 LIN28A 的上皮样细胞集落形成的显著增强。

视黄酸是由视黄醇氧化产生，视黄酸活性主要由视黄酸受体（RAR）亚家族的成员（RARα、RARβ和RARγ）介导，属于转录因子的核受体超家族，RAR通过与其配体结合调节靶基因转录，从而发挥各种生物学效应^［36-38］。TTNPB是一种有效的RAR激动剂，能够特异性地作用于RARα、β、γ亚型^［39］。在将山羊耳成纤维细胞（GEFs）重编程为具有分泌乳汁功能的化学诱导乳腺上皮细胞的研究中应用该分子^［12］。本研究中，TTNPB作为激活剂首先会与RAR相结合。这种结合会引发一系列的分子事件，其中关键的一步是促使 RAR与转录辅助因子发生相互作用。这些转录辅助因子在基因转录过程中起着重要的调控作用，它们与RAR结合后，共同形成转录复合物。当RAR受体在与TTNPB结合后，会与维甲酸X受体形成异二聚体结构。异二聚体结构具备特殊的生物学活性，能够特异性地识别并结合到 DNA 上的特定区域，即维甲酸反应元件（RAREs）。当转录复合物与RAREs结合后，就如同在基因表达的“开关”上施加了影响，进而对更广泛的基因表达网络产生作用。通过这种方式，TTNPB提高诱导细胞生成效率，为细胞诱导过程提供了有力支持，在整个细胞重编程或诱导分化的进程中发挥着不可或缺的作用。

本研究成功构建了利用小分子化合物组合C6TSEDRVAJZ将HPFs重编程为 ciEP-Ls的方法体系，显著缩短了诱导时长。从细胞形态来看，小分子诱导所得的ciEP-Ls呈现典型上皮细胞结构；在细胞特征方面，其上皮特异性标记物 E-cadherin呈高表达，且蛋白与基因表达层面的结果与之相符。着眼于未来临床应用，小分子相较于传统基因编辑手段展现出显著优势；其具有良好的可控性与安全性，原因在于小分子化合物通常作用靶点高度特异，这使得其作用机制精准。在与细胞相互作用过程中，对正常细胞其他应激靶点的结合能力微弱，从而极大降低了副作用产生的风险。在药物研发进程中，小分子化合物需历经严格系统的筛选与测试流程。于临床前研究阶段，细胞实验和动物实验是评估其安全性与有效性的核心环节。小分子诱导的 ciEP-Ls 能够在体外大量扩增并精准改造特性，为临床应用提供了稳定且充足的细胞源。在构建人工皮肤组织方面，前期动物实验表明，ciEP-Ls可有效与周围组织融合并促进皮肤再生，在一定程度上恢复皮肤生理功能，这意味着其在治疗大面积皮肤缺损方面具备向临床应用转化的潜力。对于遗传性上皮细胞疾病，理论上可通过对 ciEP-Ls 的小分子诱导使其具备修复基因缺陷的能力，且当前部分细胞模型研究已取得阶段性成果，为后续临床治疗筑牢了根基。

伴随再生医学技术的持续进步以及对ciEP-Ls研究的深入，相关细胞培养、存储与移植技术愈发成熟，能够有力保障ciEP-Ls在未来临床应用中的安全性与有效性，进一步增强了该技术方法在再生医学临床应用中的可行性，为临床细胞移植治疗策略及相关科学研究开拓了新的方向。

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