过表达HDAC1通过诱导SP1去乙酰化改善类固醇诱导的小鼠骨细胞凋亡

HDAC1 overexpression inhibits steroid-induced apoptosis of mouse osteocyte-like MLO-Y4 cells by inducing SP1 deacetylation

摘要

目的 探究组蛋白脱乙酰基酶1（HDAC1）通过特异性蛋白1（SP1）调控激素性股骨头坏死（SONFH）的作用机制。 方法 将小鼠骨样细胞MLY-O4分为对照组、曲古抑菌素（TSA）组、类固醇组、类固醇+oe-NC组、类固醇+oe-HDAC1组、oe-NC组、oe-HDAC1组。对照组细胞正常培养，不接受试剂诱导及细胞转染；TSA组细胞接受400 nmol/L TSA处理24 h；类固醇组接受1 μmol/L地塞米松诱导24 h；类固醇+oe-NC组或类固醇+oe-HDAC1组接受oe-NC或oe-HDAC1转染，通过LipoHigh 脂质体高效转染试剂行细胞转染，转染48 h后进行类固醇诱导。oe-NC组或oe-HDAC1组接受oe-NC或oe-HDAC1转染。观察各组细胞在HDAC、HDAC1蛋白、SP1蛋白、凋亡相关蛋白（裂解capase-3及Bax）、乙酰化水平、细胞增殖、细胞凋亡方面的差异，采用通过免疫共沉淀验证HDAC1与SP1的相互作用。 结果 类固醇组与对照组相比细胞凋亡率升高，HDAC1下调，裂解caspase-3及Bax上调，细胞增殖显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。TSA组、类固醇组与对照组相比，乙酰化水平显著升高，SP1蛋白显著上调，类固醇+oc-HDAC1组与类固醇+oe-NC组相比，乙酰化水平降低，HDAC1上调，SP1、裂解caspase-3、Bax下调，细胞增殖增强，细胞凋亡降低（P<0.05）。oe-NC组及oe-HDAC1组Input样本存在HDAC1蛋白条带，表明两组样本均可表达HDAC1，两组IgG抗体上并未检测出HDAC1蛋白，而两组SP1抗体上均存在HDAC1，表明HDAC1可与SP1相互作用。 结论 HDAC1通过介导去乙酰化修饰抑制SP1表达，从而抑制类固醇诱导的骨细胞凋亡，并促进骨细胞增殖。

Abstract

Objective To explore the mechanism by which histone deacetylase 1 (HDAC1) regulates steroid-induced apoptosis of mouse osteocyte-like MLO-Y4 cells. Methods MLY-O4 cells were treated with 400 nmol/L trichostatin A (TSA) or 1 mmol/L dexamethasone for 24 h or transfected with a HDAC1-overexpressing vector prior to TSA or dexamethasone treatment. The changes in the expressions of HDAC1, SP1, cleaved caspase-3 and Bax, SP1 acetylation level, cell proliferation, and cell apoptosis were examined. The interaction between HDAC1 and SP1 was determined with immunoprecipitation assay and Western blotting. Results Treatment with dexamethasone significantly increased cell apoptosis, enhanced the expressions of cleaved caspase-3 and Bax, reduced HDAC1 expression, and suppressed proliferation of MLO-Y4 cells. Both TSA and dexamethasone obviously increased SP1 acetylation level and the expression of SP1 in MLO-Y4 cells. HDAC1 overexpression in the cells significantly attenuated the effect of TSA and dexamethasone, promoted cell proliferation, lowered the expressions of SP1, cleaved caspase-3 and Bax, and inhibited dexamethasone-induced cell apoptosis. Immunoprecipitation assay and Western blotting demonstrated the interaction between HDAC1 and SP1 in the cells. Conclusion HDAC1 inhibits dexamethasone-induced apoptosis and promotes proliferation of cultured mouse osteocytes by suppressing SP1 expression via promoting its deacetylation.

Graphical abstract

关键词

激素性股骨头坏死 / SP1 / HDAC1 / 去乙酰化

Key words

steroid-induced osteonecrosis femoral head / SP1 / HDAC1 / deacetylation

激素性骨头坏死是大剂量使用类固醇的常见并发症，而股骨头在类固醇使用中受累最多^{［1， 2］}。激素性股骨头坏死（SONFH）表现为股骨头塌陷^［3］，其发病机制与类固醇诱导的免疫抑制及脂质代谢紊乱息息相关。类固醇可抑制白介素-1促炎因子，从而破坏正常的免疫体系，此外类固醇也引起低密度脂蛋白胆固醇乳化不完全及游离脂肪酸损伤，从而导致骨组织缺血及坏死^［4］。探究SONFH机制对预防和治疗SONFH具有重要意义。

特异性蛋白1（SP1）是一种调控生物活性的管家基因，其主要生物学功能是通过发挥转录因子活性调控细胞周期及细胞重编程等过程^［5］。在骨质疏松症中SP1可通过调控lncRNA SNGH1/miR-181c-5p轴靶向调控Wnt/β-catenin通路，从而抑制成骨分化及血管生成^［6］。已有研究指出SP1在SONFH细胞模型中表达上调，下调SP1有助于抑制SONFH细胞模型的细胞凋亡^［7］。由此可见，SP1是影响SONFH发生和发展的核心因素。探究SP1在SONFH中的上下游因子有助于提高对SONFH发病机制的认知。

组蛋白脱乙酰基酶1（HDAC1）是疾病与发育的重要调控因子，有组蛋白去乙酰化蛋白酶活性^［8］。HDAC1可直接靶向SP1并抑制其乙酰化修饰，进而调控SP1的转录因子活性 ^［9］。HDAC1介导的组蛋白去乙酰化与SONFH进展相关，类固醇通过抑制HDAC1升高模型体内组蛋白乙酰化水平，而抑制组蛋白乙酰化水平有助于缓解类固醇引起的骨质疏松^［10］。因此，本研究推测HDAC1通过促进SP1去乙酰化修饰影响下游SONFH相关基因的转录活性，进而调控SONFH的发生与发展。目前尚无直接证据表明HDCA1-SP1相互作用调控SONFN发生和发展。本研究构建SONFN细胞模型，旨在验证HDCA1及SP1在SONFH中的相互作用，为后续治疗提供潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

小鼠骨样细胞MLO-Y4（武汉赛奥斯生物）；一步法反转录荧光定量试剂盒（上海生工生物有限公司）；曲古抑菌素A（TSA，MedChemExpress）；Annexin V 凋亡检测试剂盒（FITC/PI双染法）、LipoHigh 脂质体高效转染试剂（上海生工生物有限公司）；快速封闭液、TBST溶液、α-MEM培养基、胎牛血清、链霉素-青霉素混合液（上海生工生物有限公司）；PBS溶液、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；HDAC1抗体（Western blotting：1/1000；免疫共沉淀：1/30）、SP1抗体（Western blotting：1/1000；免疫共沉淀：1/30）、裂解caspase-3抗体（Western blotting：1∶5000）、Bax抗体（1/1000）、β-actin抗体（Western blotting：1/5000）、山羊抗兔抗体（Abcam；Western blotting：1/10 000）；乙酰化抗体（Cell signaling techenology，IP稀释度：1/50；Western blotting：1/1000）；地塞米松（MedChemExpress，纯度：99.86%）。

1.2 实验方法

1.2.1 HDAC1过表达载体构建

对HDAC1基因及pcDNA3.1载体行双酶切，并通过DNA连接酶将HDAC1克隆至pcDNA3.1载体上。将HDAC1-pcDNA3.1载体转化至感受态大肠杆菌，过夜培养一段时间后挑选阳性菌落，行PCR检测及测序，获得HDAC1过表达载体（oe-HDAC1），并以空载pcDNA3.1载体作为阴性对照（oe-NC）。

1.2.2 细胞培养与处理

细胞培养基（5 mL）组成如下：1 mL链霉素-青霉素混合液+10 mL胎牛血清+489 mL α-MEM培养基。37 ℃、5% CO₂下孵育细胞，每3 d更换1次培养基，细胞分组如下：对照组、TSA组、类固醇组、类固醇+oe-NC组、类固醇+oe-HDAC1组、oe-NC组、oe-HDAC1组。对照组细胞正常培养，不接受试剂诱导及细胞转染。TSA组细胞接受400 nmol/L TSA处理24 h。类固醇组接受1 μmol/L地塞米松诱导24 h。类固醇+oe-NC组或类固醇+oe-HDAC1组接受oe-NC或oe-HDAC1转染，通过LipoHigh 脂质体高效转染试剂行细胞转染，转染48 h后进行类固醇诱导。oe-NC组或oe-HDAC1组接受oe-NC或oe-HDAC1转染。

1.2.3 流式细胞仪

采用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞消化液，500 g离心5 min，弃上清液。预冷PBS溶液洗涤细胞1次，500 g离心5 min，弃上清液。加入结合缓冲液，重悬细胞。依次加入5 μL Annexin V试剂及10 μL PI试剂，混匀，室温避光孵育5 min。采用流式细胞仪检测凋亡细胞，获得细胞凋亡率。

1.2.4 qPCR

取细胞样品，通过细胞RNA提取试剂盒（Trizol）提取细胞总RNA，经紫外分光光度计检测260 nm及280 nm处光密度值，选择OD_260/280>1.7者用于qPCR检测。结合一步法反转录荧光定量PCR试剂盒对RNA行反转录及荧光定量。PCR程序如下：反转录（50 ℃，5 min）-预变性（95 ℃，3 min）-40次循环（变性，95 ℃，10 s；退火/延伸/采集荧光信号，60 ℃，30 s）。HDAC1上游引物：5'-TGAAGCCTCACCGAATCC GCAT-3'；HDAC1下游引物：5'-TGGTCATCTCCT CAGCATTGGC-3'。以GAPDH为内参，根据2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。GAPDH上游引物：5'-AGCCCA AGATGCCCTTCAGT-3'；GAPDH下游引物（上海）生工生物股份有限公司设计合成：5'-CCGTGTTCCT ACCCCCAATG-3'。

1.2.5 Western blotting

通过RIPA裂解液处理细胞，14 000 g离心15 min，取上清液，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。100 ℃加热变性后，通过SDS-PAGE凝胶试剂盒配置浓缩胶及分离胶。采用上样缓冲液稀释蛋白上清液，后以25 μL/孔的规格向凝胶泳道加入蛋白样品。经电泳分离后将蛋白印迹至PVDF膜。加入封闭液封闭1 h。加入稀释的1抗，4 ℃孵育过夜。回收一抗。加入稀释的二抗，室温孵育1 h。回收二抗，加入ECL试剂，反应5 min。立即采用蛋白凝胶成像系统检测蛋白条带，拍摄图像。采用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，并以β-actin为内参，计算蛋白相对量。

1.2.6 CCK-8实验

取4块24孔板，按2000/孔接种细胞，每组设置3复孔，根据分组进行处理。分别于处理24、48、72 h后各取出1块孔板，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h。采用酶标仪检测24、48、72 h细胞样品光密度值A₄₅₀。

1.2.7 免疫共沉淀

收集细胞样品，加入1 mL细胞裂解液，待细胞裂解充分后，取部分裂解液作为Input样品，剩余部分作为免疫沉淀（IP）样品，取蛋白A/G磁珠，加入细胞裂解液并混匀，4 ℃下8000 g离心30 s，弃上清液，以上步骤重复3次。加入细胞裂解液以重悬磁珠，加入5 mg/mL BSA溶液封闭，4 ℃孵育1 h，移除上清液，细胞裂解液重悬磁珠并备用。取细胞样品，加入细胞裂解液，裂解充分后加入预处理过的蛋白A/G磁珠及免疫球蛋白G（IgG）抗体，4℃缓慢摇晃2 h，4 ℃下8000 g离心30 s，收集上清液，取部分上清液作为IgG IP样本，剩余部分作为SP1 IP样本。向SP1 IP样本加入SP1抗体，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜，后加入预处理过的蛋白A/G磁珠，4℃缓慢摇晃孵育过夜，4 ℃下8000 g离心30 s。收集Input及IP样本的磁珠蛋白复合物，洗脱、纯化蛋白后行Western blotting，检测各样本中HDAC1蛋白水平。

1.2.8 细胞乙酰化水平检测

取蛋白A/G磁珠，加入细胞裂解液洗涤3次，加入BSA溶液封闭1 h，离心后采用细胞裂解液重悬并待用。取细胞样品，加入细胞裂解液，裂解充分后加入预处理过的蛋白A/G磁珠及免疫球蛋白G（IgG）抗体，4 ℃缓慢摇晃2 h，4 ℃下8000 g离心30 s，收集上清液。向上清液中加入乙酰化抗体（稀释度：1/50），4 ℃缓慢摇晃孵育过夜，后加入预处理过的蛋白A/G磁珠，4 ℃缓慢摇晃孵育过夜，4 ℃下8000 g离心30 s，收集磁珠蛋白复合物，洗脱、纯化蛋白后行Western blotting，检测细胞乙酰化水平。

1.3 统计学分析

本研究所有实验均有3次生物重复实验，在每次实验中所有数据均有3次技术重复。对3次生物重复的数据取均值，以均数±标准差表示。本研究采用SPSS软件行统计学分析，使用GraphPad软件行数据可视化处理。采用独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、Turkey法事后比较行组间差异分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HDAC1在SONFH细胞模型中的表达

两组细胞凋亡率差异有统计学意义（P=0.002）。Western blotting检测检测促凋亡蛋白裂解caspase-3及Bax蛋白量。类固醇组与对照组相比，裂解caspase-3（P<0.001）及Bax（P<0.001）升高，HDAC1降低（P=0.006，图1）。

比较CCK-8实验中各组不同时间点A值，每组内24、48、72 h的A_{450 nm}存在差异（对照组内：P=0.009；类固醇组内：P=0.028），经独立样本t检验，48 h时类固醇组A值低于对照组（P=0.013），72 h时类固醇组A_{450 nm}值低于对照组（P=0.030，表1）。

2.2 基于类固醇诱导的SONFH模型探究上调HDAC1对骨细胞凋亡的影响

3组HDAC1相对表达量差异具有统计学意义（P<0.001），经Turkey法比较，类固醇组与类固醇+oe-NC组的HDAC1表达差异无统计学意义（P=0.995），类固醇+oe-HDAC1组HDAC1高于类固醇+oe-HDAC1组（P<0.001，图2A）。

3组HDAC1蛋白量表达差异具有统计学意义（P=0.019），经Turkey法比较，类固醇组与类固醇+oe-NC组的HDAC1表达差异无统计学意义（P=0.890），类固醇+oe-HDAC1组HDAC1蛋白量显著高于类固醇+oe-NC组（P=0.040，图2B）。

流式细胞检测结果显示3组细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.001），类固醇组与类固醇+oe-NC组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P=0.999），类固醇+oe-HDAC1组细胞凋亡率高于类固醇+oe-NC组（P<0.001，图3A）。

Western blotting检测促凋亡蛋白裂解caspase-3及Bax。3组在裂解caspase-3（F=8.137，P=0.020）及Bax（P=0.023）方面差异有统计学意义。类固醇与类固醇+oe-NC组的裂解caspase-3（P=0.999）及Bax（P=0.999）差异无统计学意义，类固醇+oe-HDAC1组与类固醇+oe-NC组相比裂解caspase-3（P=0.030）及Bax（P=0.034）降低（图3B）。

2.3 基于类固醇诱导的SONFH模型探索上调HDAC1对骨细胞活性的影响

每组内24、48、72 h的A值差异有统计学意义（P<0.05，表2）。48 h时类固醇组、类固醇+oe-NC组、类固醇+oe-HDAC1组A值差异具有统计学意义（F=8.920，P=0.016），类固醇组与类固醇+oe-NC组A差异无统计学意义，类固醇+oe-HDAC1组A值高于类固醇+oe-NC组（P=0.027），72 h时类固醇组、类固醇+oe-NC组、类固醇+oe-HDAC1组A值差异具有统计学意义（F=7.279，P=0.025）。类固醇组与类固醇+oe-NC组A差异无统计学意义，类固醇+oe-HDAC1组A值大于类固醇+oe-NC组（P=0.039，表2）。

2.4 基于免疫共沉淀验证HDAC1与SP1的相互作用

免疫共沉淀结果显示（图4），oe-NC组及oe-HDAC1组Input样本存在HDAC1蛋白条带，表明两组样本均可表达HDAC1，两组IgG抗体上并未检测出HDAC1蛋白，而两组SP1抗体上均存在HDAC1，表明HDAC1可与SP1相互作用。对HDAC1行Flag标记，并通过免疫共沉淀检测HDAC1-flag与SP1相互作用，结果显示抗Flag抗体上存在HDAC1及与SP1（图4）。

2.5 基于类固醇诱导的SONFH模型挖掘HDAC1轴对骨细胞乙酰化水平的调控

5组抗乙酰化抗体水平差异有统计学意义（P=0.001），经Turkey事后两两比较，TSA组（P=0.005）及类固醇组（P=0.005）抗乙酰化抗体水平分别高于对照组。TSA组（P=0.999）及类固醇+oe-NC组（P=0.997）抗乙酰化抗体水平与类固醇组差异无统计学意义，类固醇+oe-HDAC1组抗乙酰化抗体水平低于类固醇+oe-NC组（P=0.020，图5A）。

5组SP1蛋白量差异有统计学意义（P=0.001），TSA组（P=0.005）及类固醇组（P=0.008）SP1蛋白量分别高于对照组，TSA组（P=0.999）及类固醇+oe-NC组（P=0.993）与类固醇组SP1蛋白量差异无统计学意义，类固醇+oe-HDAC1组SP1蛋白量低于类固醇+oe-NC组（P=0.009，图5B）。

3 讨论

骨细胞凋亡是SONFH的重要病理学表现。长期或大剂量使用类固醇可导致股骨组织中骨细胞凋亡增加，并诱导严重的氧化应激反应^［11-14］。抑制骨细胞凋亡能改善SONFH症状^［15］。SP1是调控骨细胞凋亡的重要因子。SP1是转录因子家族的主要成员，可通过结合靶基因启动子的SP位点激活基因转录过程^{［16， 17］}。新近研究证实SP1可通过自身转录因子活性调控神经元、骨肉瘤细胞、非小细胞肺癌细胞等细胞的凋亡表型^［18-20］。SP1对骨细胞凋亡调控至关重要。既往证据表明在SONFH中SP1通过介导11β-羟基类固醇脱氢酶及Wnt/β-catenin通路等参与调控骨细胞凋亡^{［21， 22］}。本研究也在类固醇诱导的骨细胞中观察到SP1上调。由此可见，SP1上调对诱导骨细胞凋亡促进SONFH进展至关重要。

本研究证实在SONFH细胞模型中SP1表达受HDAC1调控。HDAC1具有去乙酰化蛋白酶活性，能通过催化组蛋白及转录因子去乙酰化调控基因的转录表达过程^［23-25］。SP1携带乙酰化位点，且在该蛋白上的乙酰化修饰可竞争性抑制泛素化修饰，进而避免蛋白降解，提高蛋白在细胞中的表达水平^［26］。已有研究指出HDAC1可与SP1互作并催化其去乙酰化^{［9， 27， 28］}，提示HDAC1可能参与调控SP1的乙酰化修饰。然而目前尚无文献报告HDAC1与SP1在SONFH中的潜在关系。本研究首次证实了在SONFH中上调HDAC1可导致SP1的乙酰化水平降低，从而引起SP1表达下调。

HDAC1在SONFH发病机制发挥重要作用。目前证据显示HDAC1活性及表达受到类固醇的负向调控。例如，Qiu等^［29］研究指出类固醇通过促进HDAC1乙酰化抑制HDAC1的去乙酰化酶活性。Kuzmochka等^［30］证实皮质类固醇能够通过抑制HDAC1促进成脂分化，进而诱导骨质疏松症状。在胚胎发育过程中，类固醇引起的HDAC1异常表达能破坏长骨发育。由此可见，HDAC1是介导SONFH发病机制的重要靶点之一^［31］。在本研究中，HDAC1在SONFH模型中表达下调，这一结果提示类固醇可能抑制了HDAC1在SONFH中的表达。本研究还证实上调HDAC1可有效抑制骨细胞凋亡并促进细胞增殖，提示HDAC1上调具有改善SONHF的潜能。在SONFH中，HDAC1下调可能导致SP1乙酰化水平升高，继而促进SP1稳定，引起SP1蛋白上调；随后SP1通过诱导骨细胞凋亡等机制促进骨组织坏死，推动SONFH进展。由此可见，HDAC1有望成为调控SP1并改善SONHF的重要靶点。

本研究的局限性如下：本研究通过类固醇诱导的骨细胞探究HDAC1-SP1互作对SONFH的影响，但因时间和研究成本等因素未能通过SONFH动物模型验证上述发现；类固醇对成骨细胞、破骨细胞、骨细胞的影响不尽相同，本研究仅以骨细胞为研究对象探讨SONFH相关机制，而未能进一步探究成骨或破骨细胞是否同样具有HDAC1-SP1互作机制；本项研究的实验均进行3次生物重复，但由于经费等原因，未能进行更多次重复实验。为进一步加深研究发现的临床相关性，后续研究将考虑建立SONFH动物模型，验证HDAC1通过SP1去乙酰化抑制股骨头坏死的作用机制，并探究HDAC1在成骨或破骨细胞的调控作用。

综上所述，本研究证实HDAC1通过介导去乙酰化修饰抑制SP1表达，从而抑制类固醇诱导的骨细胞凋亡，并促进骨细胞增殖。本研究揭示了HDAC1对SONFH骨细胞的调控作用，为后续基于HDAC1的药物研发提供了有力的研究依据。

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基金资助

湖南省自然科学基金青年项目(2022JJ40328)

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