“白花蛇舌草-半枝莲”治疗原发性肝癌的机制研究：基于网络药理学、分子对接及体外实验验证

Mechanism of Hedyotis diffusa-Scutellaria barbata D. Don for treatment of primary liver cancer: analysis with network pharmacology, molecular docking and in vitro validation

摘要

目的 通过网络药理学及分子对接探究“白花蛇舌草-半枝莲”的有效成分及其作用于原发性肝癌的主要生物过程及信号通路。 方法 通过TCMSP、Uniport、Genecards、String数据库以及Cytoscape软件得出最终核心基因；通过ClueGo对药物-疾病共有基因做GO、KEGG富集分析；通过Pubcham、RCSB、Autoduck把药物有效成分与最终核心基因进行分子对接，得出结合能最高药物有效成分；再通过CCK-8、细胞凋亡、Western blotting实验研究此药物有效成分对HepG2的作用。 结果 筛选得出最终核心基因为TP53、ESR1。GO分析显示主要生物过程为BP- regulation of apoptotic signaling pathway，negative regulation of cell population proliferation；CC-membrane raft； MF-protein kinase activity等。KEGG分析显示主要信号通路为Apoptosis，Proteoglycans in cancer，PI3K-Akt signaling pathway，Hepatitis B等。分子对接结果显示，药物有效成分与最终核心基因均可以在自然条件下进行对接，其中ESR1与ursolic acid结合能最高（-4.98 kcal/mol）。CCK-8、细胞凋亡、Western blotting实验显示ursolic acid对HepG2有明显抑制作用。 结论 “白花蛇舌草-半枝莲” 通过多种有效成分与原发性肝癌紧密结合，继而对原发性肝癌起到治疗作用。

Abstract

Objective To investigate the active ingredients in Hedyotis diffusa-Scutellaria barbata D. Don and the main biological processes and signaling pathways mediating their inhibitory effect on primary hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The core intersecting genes of HCC and the two drugs were screened from TCMSP, Uniport, Genecards, and String databases using Cytoscape software, and GO and KEGG enrichment analyses of the intersecting genes were conducted. Molecular docking between the active ingredients of the drugs and the core genes was carried out using Pubcham, RCSB and Autoduckto to identify the active ingredients with the highest binding energy, whose inhibitory effect on HepG2 cells was verifies using CCK-8 assay, flow cytometry and Western blotting. Results TP53 and ESR1 were identified as the core genes of HCC and the two drugs. GO and KEGG analyses showed that the two genes were mainly involved in regulation of apoptotic signaling pathway, cell population proliferation, methane raft, and protein kinase activity, and participated in the signaling pathways of apoptosis, proteoglycans in cancer, PI3K Akt signaling pathway, and hepatitis B. Molecular docking studies showed that the active ingredients of the drugs could be docked with TP53 and ESR1 genes under natural conditions, and ursolic acid had the highest binding energy to ESR1 (-4.98 kcal/mol). The results of CCK-8 assay, flow cytometry and Western blotting all demonstrated significant inhibitory effect of ursolic acid on HepG2 cells. Conclusion The inhibitory effect of Hedyotis diffusa-scutellariae barbatae on HCC is mediated by multiple active ingredients in the two drugs.

Graphical abstract

关键词

白花蛇舌草 / 半枝莲 / 原发性肝癌 / 网络药理学 / 分子对接

Key words

Hedyotis diffusa / Scutellaria barbata D. Don / primary hepatocellular carcinoma / network pharmacology / molecular docking

原发性肝癌为最常见的恶性肿瘤之一，在癌症致死原因处于第3位^［1］，其发病率与死亡率几乎等同，且发病率正逐年上升^{［2， 3］}。HBV病毒感染能够启动肝癌的发生过程，而HCV病毒感染是启动该发生过程的促进剂^［4］；黄曲霉毒素感染亦是重要因素，黄曲霉毒素可加强HBV病毒感染致肝癌的作用，从而加速肝癌的发生^［1］。其发病率与死亡率几乎等同，原因是原发性肝癌患者早期多无明显症状或体征，后期可能会出现腹痛、腹水等症状，但大多数肝硬化患者亦有此症状，故而会忽略肝癌潜在病变区，以致发现时多为晚期^［5］。

对于原发性肝癌的治疗，目前多提倡中西医结合。临床研究表明加用中药口服治疗可明显延长患者生存时间^［6］。白花蛇舌草，其性寒，味苦、淡，可清热解毒、化瘀止痛，在临床多被用于抗癌、抗炎、抗氧化等^［7］。白花蛇舌草可通过调控相关信号通路、抑制肿瘤血管生成，从而促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖^［8］。半枝莲为唇形科黄芩属多年生草本植物，全草入药，善于清热解毒、化瘀消肿止痛，在中国广泛被用于治疗癌症、水肿、泌尿系疾病等，现代药理学证实其具有很强的抗肿瘤活性^［9］。

目前对于白花蛇舌草与半枝莲的研究已较完善，包括各自传统用途、植物学、植物化学、药理、药代动力学、毒理学等，亦有白花蛇舌草-半枝莲治疗癌症的相关研究，如研究发现半枝莲-白花蛇舌草可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化调控肝细胞癌迁移和侵袭^［10］。但对于两者联合治疗肝癌的的作用机制目前尚不足，本研究通过网络药理学及分子对接探讨其治疗肝癌的作用机制，另构建体外实验进行验证。

1 材料和方法

1.1 收集靶点

通过TCMSP^［11］、Uniport（https：//www.uniprot.org/）^［12］、GeneCards^［13］数据库，条件设定为口服生物利用度（OB）>30%、药物相似性（DL）>0.18^［14］，得出半枝莲、白花蛇舌草两味药物的成分、靶点基因及原发性肝癌的靶点基因。将两味药物的成分及靶点基因导入Cytoscape3.8.2^［15］，得出“药物-靶点-基因”网络图。

1.2 筛取核心基因

将原发性肝癌靶点基因、两味药物的共有基因导入Venny 2.1在线工具^［16］，得出韦恩图，获得疾病-药物共同靶点基因。将其输入String数据库（https：/string-db.org/cgi/input. pl），设定物种为“Homo sapiens”，获得蛋白之间互作关系。再次导入Cytoscape3.8.2软件，在cytonca中对数据进行分析得出最终核心基因。

1.3 GO和KEGG通路富集分析

将1.2中的共同靶点基因导入Cytoscape3.8.2中ClueGo插件中，依次选择GO-BP，GO-CC，GO-MP，KEGG进行分析。

1.4 分子对接

将最终核心基因、药物共有基因分别导入RCSB（http：//www.rcsb.org/）、Pubcham（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下载3D结构。将3D结构导入AutoduckTools^［17］予以处理后计算二者结合能。

1.5 验证实验

1.5.1 主要材料

LO-2（正常人肝细胞）、HepG2（人肝癌细胞株）、Ursolic acid、索拉非尼（10 µmol/L，培育24 h）^［18］、JNK抑制剂（安徽中抗生物技术有限公司），CCK-8检测试剂盒、PBS（Hyclone），FBS（BI），胰酶、线粒体膜电位试剂盒（JC-1），活性氧检测试剂盒（碧云天），96孔板（LabServ）；RIPA细胞裂解液（强）、Western一抗二抗去除液（Beyotime），SDS、Glycine、PAGE胶促凝剂、Tris、Tween-20（Solarbio），PVDF膜（Millipore），APS（BBI Life Sciences），Acrylamide、Bis-Acrylamide（Sigma）；Methanol、iso-Propanol（上海苏懿），PBS缓冲液粉末（Zs-BIO），预染蛋白Marker、ECL超敏发光试剂盒、培养箱（Thermo）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、β-Actin（Zsbio），P38（abcam），p-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2（CST），JNK（Proteintech），p-P38（Santa Cruz），Annexin V-FITC/PI apoptosis kit（联科生物），DMEM（cytiva），移液枪（Dragon），倒置显微镜（OLYMPUS），离心机（上海和欣科教设备有限公司），超净工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司），自动制冰机（常熟市雪科电器有限公司），电泳仪、电泳槽、转膜仪（Tanon），常温微量离心机、水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司），pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），纯水机（上海和泰仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司），电子天平（上海菁海仪器有限公司），微量移液器（德国Eppendorf），磁力加热搅拌器（常州市人和仪器厂），自动曝光仪（上海培清科技有限公司），流式细胞仪（贝克曼）。

1.5.2 实验方法

1.5.2.1　ursolic acid最佳浓度、时间筛选实验

CCK-8实验：细胞为HepG2，加入成分为ursolic acid。胰酶消化对数期细胞，予以处理后置于培养箱中培养（单层细胞铺满孔底，96孔平底板），5%CO₂，37 ℃孵育过夜，倒置显微镜下观察。将HepG2分为5组，每组分别加入0、20、40、80 µmol/L ursolic acid，再将每组都分别培养12、24、48、72 h，加入10 µL/孔CCK-8试剂，继续培养4 h。测量各孔的吸光值A_{450 nm}。同时设置空白孔（培养基、CCK-8），细胞活力=（A_实验孔-A_空白孔）/（A_对照孔-A_空白孔）。

ROS实验：细胞为HepG2，分为5组，各加入0、20、40、80 µmol/L ursolic acid。收集以上各组细胞调整细胞浓度至（1~10）×10⁶/mL。加入浓度为10 µmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，每隔3~5 min混匀，使其充分作用，同时设置不染色细胞作为对照。后用PBS洗细胞两次，进行流式分析。

1.5.2.2　 通过JNK抑制剂的加入对比ursolic acid与索拉非尼对细胞的作用

分组（1）：HepG2，HepG2+0、0.5、1.0、1.5 µmol/L JNK抑制剂。CCK-8实验：过程同1.5.2.1。

分组（2）：LO-2，HepG2，HepG2+最佳浓度的ursolic acid，HepG2+最佳浓度的JNK抑制剂，HepG2+索拉非尼（10 µmol/L，培育24 h），HepG2+最佳浓度的ursolic acid+最佳浓度的JNK抑制剂，HepG2+索拉非尼（10 µmol/L，培育24 h）+最佳浓度的JNK抑制剂。

CCK-8实验同1.5.2.1。

细胞凋亡：离心收集细胞，后用冷PBS离心洗涤细胞，收集（1~10）×10⁵细胞，用双蒸水稀释取500 µL 1×Binding Buffer悬浮细胞。后加入5 µL Annexin V-FITC和10 µL PI，进行流式分析。

Western blotting实验：LO-2、HepG2细胞接种于6孔板中，HepG2细胞按上述分组，加入RIPA细胞裂解液600 µL进行裂解、提取组织总蛋白；根据TRAKRA产品目录进行SDS-PAGE凝胶配置，浓缩胶（2 mL）10%分离胶（10 mL）。在收集的蛋白样品中按照1∶4加入5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。将滤纸和PVDF膜，浸入转膜缓冲液中5 min，通过转膜装置进行恒流转膜；转膜完毕后，蛋白膜放置到Western洗涤液中漂洗5 min，加入Western封闭液（5%脱脂奶粉）封闭2 h。将滤纸和PVDF膜，浸入转膜缓冲液中5 min，通过转膜装置进行恒流转膜；转膜完毕后，蛋白膜放置到Western洗涤液中漂洗5 min，加入Western封闭液（5%脱脂奶粉）封闭2 h。按照合适的比例（表1）在4 ℃用一抗稀释液进行稀释过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000稀释） 反应1.2 h。参考相关说明书，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布的数据组间比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的数据组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物的有效成分及靶点

筛选出白花蛇舌草、半枝莲各有24、29个有效成分。在TCMSP related targets中根据有效成分得出药物各有靶点，再将其输入Uniport数据库中，选择条件为“UniProtKB，Reviewed，Human”，筛选出对应基因名，去除无效靶点后，最终得出两味中药对应基因各有408、517个。将药物-成分-靶点基因导入Cytoscape，得到“药物-靶点-基因”网络图（图1）及药物共有基因（表2）。

2.2 疾病-药物共有基因

在Genecards数据库中输入“primary carcinoma of the liver”，得出原发性肝癌靶点基因共1015个。将其与药物共有基因导入 Venny2.1 在线工具，绘制韦恩图，得到疾病-药物共有基因92个（图2）。

2.3 核心基因筛选

将疾病-药物共有基因输入String 数据库，条件选定为“Multipleproteins”，“Homo sapiens”获得蛋白间互作关系。将结果导入Cytoscape3.8.2软件，在cytonca中对数据进行分析得出最终核心基因（图3）。最终核心基因为TP53，ESR1。

2.4 GO、KEGG分析

GO分析结果显示，涉及白花蛇舌草-半枝莲治疗原发性肝癌的主要生物过程是：BP-regulation of apoptotic signaling pathway，negative regulation of cell population proliferation；CC-membrane raft；MF-protein kinase activity等（图4）。KEGG分析结果显示，涉及白花蛇舌草-半枝莲治疗原发性肝癌的主要相关信号通路包括：Apoptosis，Proteoglycans in cancer，PI3K-Akt signaling pathway，Hepatitis B等（图5）。

2.5 分子对接结果

通过RCSB PDB 数据库得出TP53，ESR1分别对应的 ID 为3D06、4PXM，下载3D结构；通过Pubcham数据库得出白花蛇舌草、半枝莲两味药物有效成分3D结构，两者进行分子对接（图6）。结果显示均可以在自然条件下进行对接（表3）；ESR1与ursolic acid结合能最高（-4.98 kcal/mol）。

2.6 实验结果

2.6.1 ursolic acid最佳浓度、时间筛选

当Ursolic acid作用于HepG2细胞中时，浓度越大，细胞活力受到抑制作用越大；40 µmol/L后细胞活力抑制水平基本稳定；此浓度下细胞培养24、48、72 h，细胞活力受抑制作用基本一致（图7）。ROS实验显示，当HepG2中40 µmol/L ursolic acid培育24 h时DCF荧光最低（图8）。

2.6.2 通过z-vad-fmk 凋亡抑制剂的加入对比ursolic acid与索拉非尼两者对细胞的作用

JNK抑制剂作用于HepG2细胞中时，浓度越大，细胞活力越大，1.5 µmol/L后细胞活力基本稳定（P<0.01）；此浓度下细胞培养24、48、72 h的细胞活力基本一致，故1.5 µmol/L、24 h为JNK抑制剂浓度最佳浓度及时间（图9）。Ursolic acid（40 µmol/L，培育24 h）对肝癌细胞活力的抑制作用大于索拉非尼（10 µmol/L，培育24 h）（图10）。细胞凋亡实验显示，C组细胞内荧光强度强于E组（图11）。Western blotting实验显示，当HepG2中加入Ursolic acid（40 µmol/L，培育24 h）时，HepG2中蛋白的相对表达量与HepG2中加入索拉非尼（10 µmol/L，培育24 h）几乎等同（图12）。

3 讨论

本研究对白花蛇舌草、半枝莲与原发性肝癌进行网络药理学及分子对接研究，验证了两味药物与原发性肝癌之间有密切关系，通过GO、KEGG分析发现两味药物治疗原发性肝癌的主要通路，验证了白花蛇舌草、半枝莲在治疗原发性肝癌上起重要作用。网络药理学分析得出药物-疾病最终核心靶点为：TP53，ESR1。在癌病基因中，TP53最常发生突变，其高频率突变使人体自身机制互相调节努力恢复突变后的正常功能，因而致使肿瘤细胞的死亡和消除^［19］。ESR1为雌激素受体，人体若具有高ESR1表达，可通过调节MMAA控制肝癌发展^［20］。本研究分子对接结果显示，白花蛇舌草-半枝莲治疗原发性肝癌可能为通过TP53，ESR1。

对于白花蛇舌草-半枝莲治疗原发性肝癌的主要生物过程及相关通路，regulation of apoptotic signaling pathway-crocin通过调节凋亡信号来减低实验诱导发生肝癌的概率，可通过HO-1和Keap-1信号调节参与各种细胞凋亡的蛋白^［21］。Negative regulation of cell population proliferation-若FRAT1过表达，则会抑制STM抗肿瘤，因此STM可负调控FRAT1 的表达，从而抑制HCC细胞的增殖^［22］。Membrane raft膜筏富含鞘脂和胆固醇，在众多病毒家族生命周期中起着重要作用，另外，它似乎亦参与病毒在细胞表面附着、募集^［23］。Protein kinase activity若要说明影响细胞行为的信号传导途径，其为关键步骤之一^［24］。甲状腺激素可以改变肝蛋白激酶活性^［25］。Hepatitis B为全球肝细胞癌的主要原因，在肝癌发病过程中，HBV基因组序列变异占据重要位置，通过多种方式随HBV慢性感染导致的坏死性炎症性肝病促进肝细胞发生转化^［26］。PI3K-Akt signaling pathway突变谱可证明PI3K在肿瘤中变现为活跃或过度活跃，PI3K-AKT轴已被证实是癌症中最常被激活的途径，而对于肿瘤的发生，PI3K途径的激活亦是必不可少的^［27］。Proteoglycans in cancer Proteoglycans如多聚多糖，是正常肝组织中存在的主要类型的多糖，研究已证明蛋白多糖的结构会随着肝癌的发生发展而变化，因此其为临床研究治疗剂及诊断相关疾病提供了依据^［28］。 Apoptosis及时有效的去除多余细胞这个过程即为细胞凋亡，该过程对于保护肝脏健康十分重要。在生理病理情况下，细胞增殖、细胞凋亡的平衡时常会被打破，从而致使肝病的发生，因此目前肝病的治疗策略为抑制肝损伤中细胞的持续凋亡及选择性杀死存在于肿瘤中的恶性细胞^［29］。

分子对接显示药物有效成分与疾病在自然条件下均可对接，表明“白花蛇舌草-半枝莲”与原发性肝癌之间存在紧密关系。而体外实验，通过CCK8、ROS、细胞凋亡、Western blotting、JC-1等实验表明ursolic acid对于HepG2确有作用。

本研究通过网络药理学、分子对接对“白花蛇舌草-半枝莲”表明“白花蛇舌草-半枝莲”与原发性肝癌密不可分，通过体外实验进一步表明其治疗作用。本研究为治疗原发性肝癌提供了新思想、新途径，也为“白花蛇舌草-半枝莲”治疗原发性肝癌提供科学依据。

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