N-乙酰神经氨酸中通过抑制Nrf2轴促进缺氧/复氧损伤的H9C2心肌细胞发生铁死亡

摘要

目的 基于铁死亡探讨N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）加剧H9C2大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤（H/RI）的影响及作用机制。方法以大鼠心肌细胞株H9C2细胞作为研究对象，将细胞分为Control组、H/R 0 h组、H/R 3 h组、H/R 6 h组、H/R 9 h组、H/R 12 h组和H/R 15 h组，在缺氧缺糖8 h，分别复氧复糖0、3、6、9、12、15 h建立细胞缺氧/复氧损伤模型模拟心肌缺血再灌注损伤，通过实验选择最佳复氧时间进行后续实验。根据最佳复氧时间，复氧时给予不同Neu5Ac浓度的完全培养基作为复氧液，将细胞分为Control、0、5、10、20、30、40、50、60 mmol/L组，通过实验选择最佳药物浓度进行后续实验。根据前述最佳复氧时间和最佳给药浓度探讨Neu5Ac对H9C2心肌细胞加剧损伤的机制，将H9C2心肌细胞分为5组：Control组、H/R组、H/R+Neu5Ac组、H/R+Fer-1（铁死亡抑制剂）组、H/R+Neu5Ac+Fer-1组。通过检测5组细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，判断各组细胞氧化应激水平；使用FerroOrange荧光探针和C11 BODIPY 581/591荧光探针分别检测细胞内Fe²⁺和脂质过氧化物（Lipid ROS）水平；此外，通过Western blotting检测Neu5Ac在H9C2心肌细胞H/RI中对核因子E2相关因子2（Nrf2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、血红素加氧酶-1（HO-1）、铁死亡抑制蛋白1（FSP1）、胱氨酸/谷氨酸反向转运体（xCT）蛋白表达的影响。结果 H9C2心肌细胞缺氧缺糖8 h后，H/R 6 h组和除H/R 9 h组之外的其他组相比，Nrf2、GPX4、HO-1、FSP1蛋白表达最少，且差异有统计学意义（P<0.001）。与Control组相比，不同浓度药物的实验组细胞活力均明显降低（P<0.0001），且随药物浓度逐渐增大，细胞活力逐渐减小，并测得该药物的半抑制浓度IC₅₀=30.07 mmol/L。选择心肌细胞未发生明显铁死亡的时间，即缺氧缺糖8 h合并复氧复糖3 h，且复氧复糖时Neu5Ac浓度为30 mmol/L进行后续实验。结果显示，Neu5Ac可以提高SOD活性，增加Fe²⁺和Lipid ROS水平，降低Nrf2、GPX4、xCT、HO-1、FSP1等5种蛋白的表达（P<0.05）。在Neu5Ac的基础上使用Fer-1后，与H/R+Neu5Ac组相比，SOD活性下降，Fe²⁺和Lipid ROS水平减少，Nrf2、GPX4、xCT、HO-1、FSP1等5种蛋白的表达升高（P<0.0001）。结论Neu5Ac在H/RI中加剧心肌细胞发生铁死亡可能是通过抑制Nrf2轴进而产生过多的活性氧和脂质活性氧而导致。

关键词

N-乙酰神经氨酸 / 心肌细胞 / 缺氧/复氧损伤 / 铁死亡