缺氧微环境下补阳还五汤通过抑制BNIP3-PI3K/Akt通路抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的线粒体自噬

摘要

目的 在低氧微环境下，以BNIP3-PI3K/Akt信号通路为核心，研究补阳还五汤参与FLS-RA线粒体自噬的调控机制。方法将成纤维样滑膜细胞（FLS）体外培养，分为正常对照组（FLS-RA正常培养）、模型对照组（IL-1β诱导）、补阳还五汤含药血清低、中、高干预组（IL-1β诱导+浓度分别为5%、10%、20%含药血清），除正常对照组外，其余组细胞按照10%O₂浓度低氧处理。AnnexinV-APC/7-AAD双染测定细胞凋亡和T-AOC试剂盒检测细胞总抗氧化能力。探针分子测定细胞ROS,ATP试剂盒测定细胞ATP水平、线粒体膜电位（Δψm）、细胞Ca²⁺平衡稳态的变化。Western blotting法检测BNIP3、PI3K、AKT蛋白表达水平，RT-q PCR法检测BNIP3、PI3K、AKT及自噬相关因子LC3、Beclin-1、P62 mRNA的表达。结果 补阳还五汤组能够降低细胞的凋亡百分比（P<0.05），且呈浓度依赖性。补阳还五汤组总抗氧化力降低，T-AOC浓度（U/mL）降低，ROS产生增加。观察到自噬小体的形成，ATP酶水平释放量增加（P<0.05）；线粒体膜电位、Ca²⁺水平均呈下降趋势。补阳还五汤组BNIP3蛋白表达升高，PI3K、AKT表达降低；与模型组相比，补阳还五汤组BNIP3、P62、mRNA表达升高（P<0.05）;PI3K、AKT、LC3、Beclin-1、mRNA表达降低，Beclin-1的表达差异无统计学意义（P>0.05）;LC3的表达仅在中药小剂量组差异无统计学意义（P>0.05）。结论 在低氧环境下，补阳还五汤可能通过抑制BNIP3介导的PI3K/AKT通路，从而抑制了自噬因子的表达。

关键词

低氧 / 补阳还五汤 / 类风湿关节炎 / 滑膜成纤维细胞 / BNIP3-PI3K/Akt / 线粒体自噬