高糖环境通过抑制免疫反应基因1的表达诱导巨噬细胞促炎性M1型极化

High glucose induces pro-inflammatory polarization of macrophages by inhibiting immune-responsive gene 1 expression

摘要

目的 研究高糖环境对巨噬细胞极化的影响及其潜在分子机制。 方法 将离体培养的RAW264.7细胞随机分为过表达对照组（NC-OE组）、免疫反应基因1过表达组（IRG1 OE组）、沉默对照组（NC-siRNA组）和IRG1沉默组（IRG1 siRNA组），电穿孔进行质粒转染后再组内随机分为对照组（Con组）和高糖组（HG组），60 mmol/L葡萄糖干预72 h后收集细胞进行检测。CCK-8检测细胞活性，相差显微镜观察细胞形态，Western blotting检测细胞中IRG1、iNOS、Arg-1、IL-1β和IL-10蛋白表达，免疫荧光染色检测细胞中iNOS和Arg-1蛋白荧光水平，ELISA法检测细胞培养基中IL-1β和IL-10蛋白水平。 结果 与对应Con组相比，HG组IRG1表达均下降（P<0.01），同时出现较多梭形和多突形细胞且两极可见伸展的伪足，iNOS表达升高（P<0.01）、Arg-1表达下降（P<0.05），IL-1β表达和分泌升高（P<0.05）、IL-10分泌下降（P<0.01）。转染IRG1过表达质粒后，与对应NC-OE组相比，IRG1 OE组IRG1水平均升高（P<0.01）；高糖环境下，HG-IRG1 OE组梭形和多突形细胞明显减少、iNOS表达下降（P<0.01）、Arg-1表达升高（P<0.01）、IL-1β表达和分泌下降（P<0.01）、IL-10表达和分泌升高（P<0.05）。IRG1沉默后，与对应NC-siRNA组相比，IRG1 siRNA组IRG1水平降低（P<0.01）；高糖环境下，HG-IRG1 siRNA组多突形细胞和伪足进一步增加、Arg-1表达降低（P<0.01）、IL-10表达和分泌减少（P<0.05）。 结论 高糖环境诱导巨噬细胞促炎性M1型极化进而诱发慢性炎症反应，其作用机制可能与抑制巨噬细胞中IRG1蛋白表达有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of high glucose on macrophage polarization and the role of immune-responsive gene 1 (IRG1) in mediating its effect. Methods RAW264.7 cells were transfected with IRG1-overexpressing plasmid or IRG1 siRNA via electroporation and cultured in either normal or high glucose for 72 h to observe the changes in cell viability and morphology using CCK-8 assay and phase contrast microscopy. The protein levels of IRG1, iNOS, Arg-1, IL-1β and IL-10 in the treated cells were detected with Western blotting, and the fluorescence intensities of iNOS and Arg-1 were detected using immunofluorescence assay. The protein levels of IL-1β and IL-10 in the culture medium were determined with ELISA. Results High glucose exposure significantly reduced IRG1 and Arg-1 expressions, increased iNOS and IL-1β expressions and IL-1β secretion, and decreased IL-10 level in RAW264.7 cells. Transfection with the IRG1-overexpressing plasmid provided the cells with obvious resistance to high glucose-induced changes in iNOS, Arg-1, IL-1β and IL-10, whereas IRG1 knockdown further enhanced the effects of high glucose exposure on Arg-1 expression and the expression and secretion of IL-10. Conclusion High glucose promotes M1 polarization of the macrophages possibly through a mechanism to inhibit the expression of IRG1 protein, thus leading to chronic inflammatory response.

Graphical abstract

关键词

巨噬细胞 / M1型极化 / 炎症因子 / 高糖环境 / 免疫反应基因1

Key words

macrophages / M1 polarization / inflammatory cytokines / high glucose condition / immune-responsive gene 1

目前全球范围内2型糖尿病（T2DM）发病率骤增，成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题^{［1， 2］}，而炎症学说在T2DM发病机制中的作用受到广泛关注^［3-5］。高糖高脂膳食可激活先天免疫，进而诱导T2DM发生发展^{［6， 7］}，且高糖环境是体内T2DM的主要病理特征^［8］，因此深入研究高糖环境下先天免疫细胞炎症反应及潜在机制对于T2DM病理机制研究及相关药物研发具有重要意义。

巨噬细胞是先天免疫的重要组成部分^{［9， 10］}，在不同微环境下可极化为功能迥异的促炎性M1型或抗炎性M2型^［11-13］。能量过剩诱发代谢紊乱时，组织巨噬细胞浸润增加且持续向促炎性M1型极化，导致M1/M2稳态失衡，诱发慢性炎症^［11-13］。但目前关于高糖环境诱导巨噬细胞促炎性M1型极化的分子机制尚不明确。

免疫反应基因1（IRG1）是三羧酸循环中的重要代谢酶，是巨噬细胞免疫与代谢的重要连接点^{［14， 15］}。随着免疫代谢学的兴起，极大的拓展了人们对IRG1在免疫调节及相关疾病中的作用的认识，使得IRG1成为近年来免疫代谢领域的明星分子^［16］。研究发现，IRG1是介导巨噬细胞促炎性极化的重要负向调控点，其可通过抑制巨噬细胞炎症反应来调节疾病进程^［17］。然而，目前高糖环境下巨噬细胞IRG1变化及其在高糖诱导的巨噬细胞极化中的调控作用尚未阐明。因此，本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，制备IRG1过表达质粒和IRG1 siRNA，离体探究高糖环境诱导巨噬细胞极化的分子机制，为今后研究T2DM等代谢性疾病发病机理及创新诊疗手段提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7细胞（中国科学院细胞库）；DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清（Thermo）；青霉素-链霉素混合溶液（Hyclone）；OPTI-MEM（Thermo）；CCK-8（APExBIO）；IRG1抗体、诱导性一氧化氮合酶（iNOS）抗体、精氨酸酶-1（Arg-1）抗体、白介素-1β（IL-1β）抗体和白介素-10（IL-10）抗体（Abcam）；β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗兔 IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG（北京中衫金桥生物技术有限公司）；Cy3标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG（碧云天）；DAPI染液（Sigma）；IL-1β ELISA试剂盒（R&D SYSTEMS）；IL-10 ELISA试剂盒（Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

RAW264.7细胞采用细胞生长液（DMEM、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素），在5%CO₂、37 ℃的细胞孵育箱中孵育。培养过程中，维持细胞密度在70%~90%的状态。传代前37 ℃预热细胞生长液和PBS。传代时，换上新鲜生长液，以细胞刮缓慢轻柔的刮下细胞，细胞悬液加入15 mL离心管中，离心机中以800 r/min转速进行离心，离心5 min。去上清，加少许新鲜培养基吹散，打匀细胞后，依细胞浓度进行传代。待细胞增殖传代到足够细胞量后统一冻存，选取同一代细胞作为实验对象。

1.2.2 实验分组与处理

RAW264.7细胞随机分为过表达对照组（NC-OE组）、IRG1过表达组（IRG1 OE组）、沉默对照组（NC-siRNA组）和IRG1沉默组（IRG1 siRNA组）（n=12）。转染细胞24 h后，各组再组内随机分为对照组（Con组）和高糖组（HG组）（n=6），HG组以60 mmol/L葡萄糖实施干预，对照组加入同浓度L-葡萄糖作为渗透压控制。24 h/次更换培养基，干预72 h后收集细胞，检测高糖干预对RAW264.7细胞极化的影响并分析其潜在分子机制。

1.2.3 制备IRG1过表达质粒和siRNA并转染细胞

本研究采用IRG1过表达质粒（Myc-DDK-Tagged，MR217265）、IRG1 siRNA （SR415749）以及相应的对照质粒（PS100001）和对照siRNA进行转染（OriGene）。RAW264.7细胞在电穿孔转染前24 h换不含青霉素和链霉素的培养基。转染时先加入无血清培养基洗细胞2次，将细胞刮下，离心后用OPTI-MEM重悬细胞，调节细胞密度为1×10⁶/24 μL OPTI-MEM，每次转染时细胞量约为1×10⁶，即24 μL细胞悬液。按仪器说明书，设置电击程序，具体包括脉冲电压、脉冲时长、电击次数等，保存好程序后点击“standby”，将盛有待转染细胞悬液的电极杯放入转染仪电击杯座上，盖上电极杯座盖子后开始电击，同时观察电阻大小。根据前期研究结果^［18］，本研究中以120 mV、20 ms、重复10次条件在RAW264.7细胞中转染IRG1过表达质粒（每样本4 μg）和IRG1 siRNA（10 nmol/L）。电穿孔转染后将细胞用不含青霉素和链霉素的培养基吹打混匀，接种于6孔板或多聚赖氨酸处理的圆形盖玻片，倒置显微镜下观察后置于5% CO₂、37 ℃细胞孵育箱中孵育，24 h后更换含青霉素和链霉素的培养基。每天在显微镜下观察细胞形态。

1.2.4 CCK-8检测细胞活性

收集细胞时加入CCK-8试剂 10 μL/孔，混匀，于孵育箱中继续培养2 h后在酶标仪中检测各孔吸光度值（A_{450 nm}）。根据下列公式计算细胞活性：细胞活性%=（A_{实验处理孔}-A_空白孔）/（A_对照孔-A_空白孔）×100%，每个样本重复检测3次，检测不同干预对RAW264.7细胞活性的影响。

1.2.5 Western blotting检测细胞中蛋白表达

收集细胞时将细胞刮下吸入2 mL EP管中，4 ℃离心留沉淀，加入裂解液150 μL/管，混匀，置冰上裂解25 min，提取总蛋白，使用蛋白浓度测定试剂盒对蛋白进行定量。Western blotting检测中蛋白上样量为30 μg，经100 V电压电泳和60 V电压电转后取出NC膜，立春红预染剪下对应条带。IRG1、iNOS、Arg-1、IL-1β和IL-10蛋白以50 g/L BSA封闭液室温孵育2 h，β-actin蛋白以50 g/L BSA 封闭液4 ℃孵育过夜。iNOS、IL-1β和IL-10一抗稀释度为1∶1000，IRG1、Arg-1一抗稀释度为1∶500，均4 ℃孵育过夜；β-actin一抗稀释度为1∶3000，室温孵育2 h。IRG1、iNOS、IL-1β和IL-10为兔源一抗，采用山羊抗兔二抗；Arg-1和β-actin为鼠源一抗，采用山羊抗小鼠二抗。IRG1、iNOS、IL-1β和IL-10二抗稀释度为1∶1000，Arg-1二抗稀释度为1∶500，β-actin二抗稀释度为1∶2000，均室温孵育2 h。二抗结束后将膜置于凝胶成像仪器中显像，将得到的图片导入Image-Pro Plus6.0软件进行灰度分析。

1.2.6 免疫荧光染色检测细胞中蛋白表达

以上干预的细胞爬片进行免疫荧光染色，4%多聚甲醛室温固定15 min后在玻片上滴加10%羊血清室温封闭30 min。iNOS一抗稀释度为1∶200，Arg-1一抗稀释度为1∶100，均置于湿盒中4 ℃孵育过夜。iNOS为兔源一抗，采用Cy3标记的山羊抗兔二抗；Arg-1为鼠源一抗，采用Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗，稀释度均为1∶300，室温闭光孵育1 h。之后滴加DAPI染液，室温闭光孵育5 min后用抗荧光淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下镜检并采集图像。镜检和采集图像时，DAPI紫外激发波长330~380 nm，发射波长420 nm，发蓝光；Cy3激发波长510~560，发射波长590 nm，发红光；Alexa Fluor 488激发波长465~495 nm，发射波长515~555 nm，发绿光。每个样本选取8个视野，采用Image Pro Plus 6.0软件处理分析图像。

1.2.7 ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-10水平

按本研究中实验设置条件和时间点收集RAW264.7细胞同时收集细胞培养上清液，于离心机中以3500 r/min转速4 ℃离心15 min，吸取上清液混合均匀后通过ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-10的含量。严格按照说明书进行逐步操作，酶标仪测量相应吸光度值A_{450 nm}，计算各细胞因子含量。

1.3 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件进行分析。采用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态分布检验，采用Levene检验进行方差齐性检验。采用双因素方差分析对干预因素进行主效应和交互效应分析。交互效应显著，组间多重比较采用简单效应分析；交互效应不显著，分别对单独主效应进行分析。对各因素内的比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane's检验。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖环境下巨噬细胞中过表达或沉默IRG1效果的验证

Western blotting结果显示，与Con-NC-OE组相比，HG-NC-OE组IRG1水平下降（P<0.01）；转染IRG1过表达质粒后，IRG1 OE组IRG1水平均高于相应对照组（P<0.01），且HG-IRG1 OE组IRG1水平与Con-IRG1 OE组相比差异无统计学意义（P>0.05，图1A）。与Con-NC-siRNA组相比，HG-NC-siRNA组IRG1水平下降（P<0.01）；转染IRG1 siRNA后，IRG1 siRNA组IRG1水平均低于相应对照组（P<0.01），且HG-IRG1 siRNA组IRG1水平与Con-IRG1 siRNA组相比差异无统计学意义（P>0.05，图1B）。

2.2 IRG1过表达或沉默对高糖条件下巨噬细胞活性的影响

CCK-8检测巨噬细胞活性，结果显示，与对照组相比，高糖环境下巨噬细胞中IRG1过表达干预和IRG1沉默干预均对细胞活性无明显影响（P>0.05，图2）。

2.3 IRG1过表达或沉默对高糖条件下巨噬细胞形态的影响

相差显微镜观察细胞形态发现，Con-NC-OE组和Con-NC-siRNA组细胞大小一致，细胞呈圆形。高糖处理的HG-NC-OE组和HG-NC-siRNA组则出现较多梭形和多突形细胞且两极可见伸展的伪足。IRG1过表达后，HG-IRG1-OE组梭形和多突形细胞明显减少。与此相反，IRG1沉默后，Con-IRG1-siRNA组同样出现梭形和多边形细胞，且HG-IRG1-siRNA组多突形细胞和伪足进一步增加（图3）。

2.4 IRG1过表达或沉默对高糖条件下巨噬细胞极化标志蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，与Con-NC-OE组相比，HG-NC-OE组iNOS水平升高（P<0.01）、Arg-1水平下降（P<0.05）；转染IRG1过表达质粒后，与相应NC-OE组相比，IRG1 OE组iNOS水平均下降（P<0.01）、HG-IRG1 OE组Arg-1水平升高（P<0.05），且HG-IRG1 OE组iNOS和Arg-1水平与Con-IRG1 OE组的差异均无统计学意义（P>0.05，图4A）。与Con-NC-siRNA组相比，HG-NC-siRNA组iNOS水平升高（P<0.05）、Arg-1水平下降（P<0.01）；转染IRG1 siRNA后，与相应NC-siRNA组相比，IRG1 siRNA组iNOS水平升高（P<0.05）、Arg-1水平均下降（P<0.01），且HG-IRG1 siRNA组iNOS水平与Con-IRG1 siRNA组相比差异无统计学意义（P>0.05，图4B）。

免疫荧光染色结果显示，与Con-NC-OE组相比，HG-NC-OE组iNOS荧光水平升高（P<0.01）、Arg-1荧光水平下降（P<0.01）；转染IRG1过表达质粒后，与相应NC-OE组相比，IRG1 OE组iNOS荧光水平均下降（P<0.01）、Arg-1荧光水平均升高（P<0.01），且HG-IRG1 OE组iNOS和Arg-1荧光水平均与Con-IRG1 OE组相比差异无统计学意义（P>0.05，图5）。与Con-NC-siRNA组相比，HG-NC-siRNA组iNOS荧光水平升高（P<0.01）、Arg-1荧光水平下降（P<0.05）；转染IRG1 siRNA后，与相应NC-siRNA组相比，IRG1 siRNA组iNOS荧光水平均升高（P<0.01）、Arg-1荧光水平均下降（P<0.01，图6）。

2.5 IRG1过表达或沉默对高糖条件下巨噬细胞炎症因子表达和分泌的影响

Western blotting结果显示，与Con-NC-OE组相比，HG-NC-OE组IL-1β水平升高（P<0.01）；转染IRG1过表达质粒后，与相应NC-OE组相比，HG-IRG1 OE组IL-1β水平下降（P<0.01）、Con-IRG1 OE组与HG-IRG1 OE组IL-10水平均升高（P<0.05），且HG-IRG1 OE组IL-1β水平低于Con-IRG1 OE组（P<0.01）、IL-10水平与Con-IRG1 OE组相比差异无统计学意义（P>0.05，图7A）。与Con-NC-siRNA组相比，HG-NC-siRNA组IL-1β水平升高（P<0.05）；转染IRG1 siRNA后，与相应NC-siRNA组相比，Con-IRG1 siRNA组IL-1β水平升高（P<0.05）、HG-IRG1 siRNA组IL-10水平下降（P<0.05），且HG-IRG1 siRNA组IL-1β和IL-10水平均与Con-IRG1 siRNA组相比差异无统计学意义（P>0.05，图7B）。

ELISA结果显示，与Con-NC-OE组相比，HG-NC-OE组IL-1β水平升高（P<0.01）、IL-10水平下降（P<0.01）；转染IRG1过表达质粒后，与相应NC-OE组相比，HG-IRG1 OE组IL-1β水平下降（P<0.01）、Con-IRG1 OE组与HG-IRG1 OE组IL-10水平均升高（P<0.05），且HG-IRG1 OE组IL-1β和IL-10水平与Con-IRG1 OE组相比差异无统计学意义（P>0.05，图8A）。与Con-NC-siRNA组相比，HG-NC-siRNA组IL-1β水平升高（P<0.01）、IL-10水平下降（P<0.01）；转染IRG1 siRNA后，与相应NC-siRNA组相比，Con-IRG1 siRNA组IL-1β水平升高（P<0.01）、Con-IRG1 siRNA组与HG-IRG1 siRNA组IL-10水平下降（P<0.01），且HG-IRG1 siRNA组IL-1β和IL-10水平均与Con-IRG1 siRNA组相比差异无统计学意义（P>0.05，图8B）。

3 讨论

炎症反应是机体固有的保护性免疫机制^［19］，但慢性炎症导致疾病，是T2DM等代谢性疾病的共同发病基础^［5］。作为先天免疫的重要组成部分，巨噬细胞是调节机体慢性炎症的中心介质，可在不同病理生理刺激下极化为功能迥异的促炎性M1型或抗炎性M2型，参与调控机体组织稳态与代谢^{［11-13， 20］}。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象，于RAW264.7细胞中电穿孔转染IRG1过表达质粒或IRG1 siRNA，然后以高糖持续处理细胞72 h，检测细胞活性、形态、极化标志蛋白表达、炎症因子蛋白表达与分泌水平，探索高糖环境诱导巨噬细胞促炎性极化的分子机制，为理解巨噬细胞极化在代谢性疾病发生发展中的重要作用及潜在机制提供新线索。

现有研究表明，正常培养的RAW264.7细胞呈圆形或椭圆形，大小较一致；而促炎性M1型极化巨噬细胞则呈长梭形和多突形且可见伸展的伪足^［21］。本研究中正常培养的RAW264.7细胞多呈圆形且均匀分布，高糖干预72 h则出现较多长梭形和多突形细胞且周围可见伸展的伪足，说明高糖干预72 h诱导巨噬细胞产生典型的炎症相关形态学应答。iNOS是M1型极化巨噬细胞标志蛋白，Arg-1则是M2型极化巨噬细胞标志蛋白^{［22， 23］}。为进一步验证以上形态学观察结果，本研究检测了高糖干预72 h后巨噬细胞中iNOS和Arg-1蛋白水平，发现高糖干预72 h诱导巨噬细胞中iNOS蛋白表达显著增加、Arg-1蛋白表达显著下降，这与本课题组前期研究结果一致^［24］。研究表明，巨噬细胞中IL-1β为促炎因子，主要由M1型巨噬细胞表达和分泌，增强炎症反应；IL-10为抗炎因子，主要由M2型巨噬细胞表达和分泌，抑制巨噬细胞的促炎性转变，进而减轻炎症反应^［25-27］。本研究中高糖干预导致巨噬细胞促炎因子蛋白IL-1β表达和分泌显著增加，抗炎因子蛋白IL-10分泌显著减少。综合以上研究结果分析，本研究中60 mmol/L葡萄糖干预72 h后诱导巨噬细胞RAW264.7细胞呈典型的促炎性M1型极化状态，诱发持续慢性炎症反应。

随着免疫代谢学的兴起，IRG1成为近年来免疫代谢领域研究的明星分子^［16］，在免疫调节中发挥重要功能^{［14， 15］}。Li等^［28］于2013年首次提出IRG1在抑制炎症反应中发挥重要作用。Domínguez-Andrés等^［29］也发现，β-葡聚糖通过下调IRG1水平使机体应对继发感染时产生更强的促炎反应。Mills等^［30］研究则发现，IRG1在巨噬细胞炎症发生中处于关键地位，IRG1下调时诱导巨噬细胞活性氧生成及促炎因子分泌，增强巨噬细胞炎症反应；IRG1表达上调则抑制巨噬细胞炎症反应。本研究同样发现高糖干预72 h诱导巨噬细胞RAW264.7细胞促炎性M1型极化，同时显著下调巨噬细胞中IRG1水平，提示高糖环境可能通过抑制IRG1表达来发挥诱导巨噬细胞促炎性极化的调节作用。

本研究通过在RAW264.7巨噬细胞中电穿孔转染IRG1过表达质粒或IRG1 siRNA，然后施以高糖干预，检测巨噬细胞活性、形态、极化标志蛋白表达、炎症因子蛋白表达与分泌水平，分析IRG1在高糖环境诱发巨噬细胞促炎性M1型极化中的重要作用。参照本课题组前期建立的RAW264.7细胞质粒转染条件^［18］，本研究中转染IRG1过表达质粒有效提高RAW264.7巨噬细胞IRG1蛋白水平，转染IRG1 siRNA则有效降低细胞中IRG1蛋白水平，且转染后对照组与高糖组间IRG1蛋白水平差异无统计学意义，不同干预后细胞活性差异无统计学意义，说明本研究中质粒转染在保证较高细胞存活率的同时能显著改变目的基因蛋白表达水平，为本研究分析IRG1在高糖环境诱发巨噬细胞M1型极化中重要作用提供方法学支撑。通过检测发现，巨噬细胞中过表达IRG1后，高糖干预下长梭形和多突形细胞明显减少，且M1型极化标志蛋白iNOS表达、促炎因子IL-1β表达和分泌均明显降低，M2型极化标志蛋白Arg-1表达、抗炎因子IL-10表达和分泌则均明显升高，说明IRG1过表达有效逆转高糖环境诱导的巨噬细胞促炎性极化，减轻细胞炎症水平。相反，巨噬细胞中IRG1沉默后，高糖干预下长梭形和多突形细胞进一步增加，且iNOS蛋白表达、IL-1β蛋白表达和分泌同样进一步升高，Arg-1蛋白表达、IL-10蛋白表达和分泌则进一步下降，说明IRG1沉默进一步诱导高糖环境下巨噬细胞促炎性极化，加剧炎症反应。以上研究结果进一步证实上文中高糖环境通过抑制IRG1表达来发挥诱导巨噬细胞促炎性M1型极化的调节作用这一研究假设。

综上所述，本研究结果证明高糖环境诱导巨噬细胞促炎性M1型极化，诱发慢性炎症反应。过表达IRG1可有效逆转高糖环境诱导的巨噬细胞促炎性极化，减轻细胞炎症水平，提示高糖环境可能通过抑制IRG1表达发挥促进巨噬细胞促炎性极化的调节作用，IRG1可能在慢性炎症相关代谢性疾病发生发展中起重要作用，并可能是其有效的治疗靶点。由于本研究局限于细胞层面，IRG1在高糖高脂环境下肝脏、脂肪和骨骼肌等不同组织巨噬细胞极化中的关键作用及其对不同组织慢性炎症和代谢紊乱的影响仍有待进一步探讨，亦是未来研究的方向。

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