铁抑制素-1抑制丙酮醛诱导的小鼠肺泡巨噬细胞铁死亡

FER-1 inhibits methylglyoxal-induced ferroptosis in mouse alveolar macrophages in vitro

摘要

目的 探讨丙酮醛（MG）对小鼠肺泡巨噬细胞的损伤及铁死亡抑制剂铁抑制素-1（FER-1）在其中的作用机制。 方法 采用小鼠肺泡巨噬细胞来源的MH-S细胞体外培养，分别用MG及FER-1进行处理，建立细胞损伤及损伤挽救模型。分别设置对照组：MH-S正常培养、MG组：90 μg/mL MG、MG+FER-1组：90 μg/mL MG+10 μmol/mL FER-1、FER-1组：10 μmol/mL FER-1。用双氯荧光素（DCFH-DA）检测细胞内ROS水平，脂质氧化（MDA）试剂盒检测MDA含量，细胞亚铁比色法检测亚铁离子（Fe²⁺）含量；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测线粒体膜电位变化，Western blotting检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、长链酰基辅酶A合酶4（ACSL4）的表达水平。 结果 90 μg/mL MG处理MH-S细胞24 h，GPX4的表达水平降低（P<0.001），ACSL4的表达水平升高（P<0.01），同时出现细胞内亚铁离子浓度升高，线粒体膜电位丢失，胞内活性氧水平升高，丙二醛含量增多等现象，最终导致细胞存活率降低（P<0.01）。通过FER-1共同干预后，GPX4的表达升高、ACSL4的表达降低，胞内铁离子浓度降低、线粒体膜电位恢复、活性氧水平降低，丙二醛含量减少（P<0.001）。 结论 MG能够剂量依赖性诱导MH-S细胞发生铁死亡，而铁死亡抑制剂FER-1能够挽救MG所导致的铁死亡。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of FER-1 on methylglyoxal-induced ferroptosis in cultured mouse alveolar macrophages. Methods MH-S cells derived from mouse alveolar macrophages treated with 90 μg/mL methylglyoxal, 10 μmol/mL FER-1MG+FER-1, or both were examined for intracellular reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) and ferrous ion (Fe²⁺) levels and changes in mitochondrial membrane potential. Western blotting was performed to detect the protein expression levels of glutathione peroxidase 4 (GPX4) and long-chain acyl-CoA synthase 4 (ACSL4). Results Methylglyoxal treatment of MH-S cells for 24 h significantly decreased the protein expression level of GPX4, upregulated the protein expression of ACSL4, increased intracellular concentrations of ferrous ions, ROS and MDA, caused loss of mitochondrial membrane potential, and decreased cell viability. Treatment of the cells with FER-1 effectively attenuated these detrimental effects of methylglyoxal in MH-S cells by increasing GPX4 expression, reducing ACSL4 expression and intracellular ferrous ions, ROS and MDA levels, and restoring the mitochondrial membrane potential. Conclusion Methylglyoxal can induce ferroptosis in MH-S cells in a dose-dependent manner, and FER-1 can rescue the cells from methylglyoxal-induced ferroptosis.

Graphical abstract

关键词

铁抑制素-1 / 小鼠肺泡巨噬细胞 / 丙酮醛 / 铁死亡

Key words

ferroptosis inhibitor ferroptin-1 / mouse alveolar macrophages / methylglyoxal / ferroptosis

糖尿病（DM）是一种以高血糖为主要特征的全身慢性代谢性疾病，其患病率逐年上升，常导致心血管、肾、眼以及肺部感染等多器官的长期损害。其中糖尿病合并肺炎是糖尿病在呼吸系统的重要并发症。糖尿病易感肺炎的机制复杂，主要包括以下几点：高糖微环境可使宿主的肺泡巨噬细胞（AM）免疫功能产生缺陷^{［1， 2］}。糖尿病晚期糖基化终末产物（AGEs）如丙酮醛等显著增加，并导致肺通气及弥散功能受损，进而易发感染^［3］。我国糖尿病合并肺炎高发、机会性感染病原体致病增多但检出率低、重症肺炎多见且病死率高，导致严重的医疗和经济负担。因此对糖尿病合并肺炎的发病机制进行深入探讨和挖掘，改善患者预后是非常迫切的。

丙酮醛（MG）又称之为甲基乙二醛，其最主要的来源是糖酵解途径，如糖酵解中间体二羟丙酮磷酸和甘油醛3-磷酸去除磷酸基^［4］。MG虽然是机体正常代谢产物^［5］，但在2型糖尿病（T2D）患者体内浓度高于正常水平^［6］，并有研究证实高浓度的MG会引起细胞内活性氧生成增加，线粒体损伤和炎症反应^［7］，最终导致铁死亡。在细胞死亡中，铁死亡是一种新型的细胞死亡形式，依赖于细胞内铁的蓄积和脂质过氧化^［8］。铁死亡在糖尿病的发生发展中发挥重要作用，例如：糖尿病肾病小鼠中铁死亡相关的标志物发生了变化，如脂质过氧化物积累的关键标志物长脸酰基辅酶A合酶4（ACSL4）升高；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、氧化还原稳态的重要调节因子降低^［9］。Feng^［10］的研究揭示，铁死亡可能通过缺氧诱导因子（HIF）-1α/HO-1途径加重糖尿病小鼠肾小管损伤和纤维化；高糖通过上调TRIM46（一种含三方基序46蛋白，参与多种类型癌细胞的增殖，包括肺癌和乳腺癌）、诱导泛素化和加速GPX4（谷胱甘肽过氧化物酶4）清除来诱导人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCECs）的铁死亡^［11］等，说明铁死亡与高糖有一定相关性。而针对肺泡巨噬细胞铁死亡而言，虽然有研究表明MG通过活性氧诱导成骨细胞的铁死亡^［12］，但关于MG通过诱导AM铁死亡从而影响肺的免疫稳态，进而导致呼吸系统疾病发生的研究尚未见报道。本研究通过MG诱导小鼠来源的肺泡巨噬细胞（MH-S）发生铁死亡，检测铁死亡相关因子及指标，确定糖尿病晚期糖基化终末产物MG与AM发生铁死亡的相关性，同时验证铁死亡抑制剂铁抑制素-1（FER-1）是否有效抑制MG所诱导的AM的铁死亡，结果可能成为预防糖尿病肺部并发症新的治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

MH-S小鼠肺泡巨噬细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）；脂质氧化（MDA）检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、活性氧检测试剂盒（碧云天）；细胞亚铁比色法测试盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；抗GPX4抗体（Abcam）；抗ACSL4抗体（ABclonal）；铁抑制素-1（MedChemExpress）；小鼠肺泡巨噬细胞MH-S培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MH-S细胞培养

含10%胎牛血清的培养基用于培养MH-S细胞，当细胞密度达到80%~90%时，进行传代及后续实验。

1.2.2 实验分组

实验分为4组：对照组（单独用1640培养基处理MH-S细胞24 h）； MG组（用含90 μg/mL MG的1640培养基处理细胞24 h）；MG+FER-1组（用含90 μg/mL MG与10 μmol/L FER-1的1640培养基共同培养细胞24 h）；FER-1组（用含10 μmol/L FER-1的1640培养基干预细胞24 h）。

1.2.3 Western blotting检测蛋白表达水平

于60 mm皿中培养MH-S细胞，密度达标后给予不同处理；用预冷的PBS充分冲洗、吸干，加入裂解液后置于冰上作用30 min，冰上刮取皿中蛋白，4 ℃、12000 r/min离心10 min，吸取离心后上清液，用BCA法计算各组上清液中蛋白的浓度。SDS-PAGE电泳分离各组蛋白并转移至PVDF膜上，10%脱脂奶粉封闭30 min，加入抗GPX4抗体（1∶2000）以及抗ACSL4抗体（1∶10 000）；4 ℃摇床孵育过夜，冷TBST液充分漂洗膜5次，10 min/次；II抗（1∶10 000）于室温孵育1 h，TBST充分漂洗3次，10 min/次，利用发光试剂ECL显色，曝光，凝胶成像系统分析结果。实验重复3次。

1.2.4 线粒体膜电位检测

将MH-S细胞以40×10⁴接种于6孔板培养，根据不同分组干预后，PBS润洗2~3次，每孔加入JC-1（1∶200）染色剂覆盖细胞，37 ℃培养20 min，再用PBS润洗3次，荧光显微镜拍照，后用图像分析软件评估图片荧光强度的平均值（平均荧光强度MFI，反映线粒体膜电位的高低）。实验重复3次。

1.2.5 MDA试剂盒检测

取MH-S细胞以40×10⁴种于6孔板，设置对照组、MG组、MG+FER-1组与FER-1组。根据MDA检测试剂盒说明书步骤，用BCA法测定样品蛋白浓度，将100 μL待测样品与200 μL检测工作液混匀，100 ℃加热15 min。将样品水浴冷却至室温，1000 r/min离心10 min。取上清200 μL于96孔板中，采用酶标仪测定吸光度值A_{532 nm}。

1.2.6 细胞内ROS水平的检测

将MH-S细胞以40×10⁴接种于6孔板，不同干预后，PBS润洗3次，每孔加入10 μmol/L的DCFH-DA染色液500 μL覆盖细胞，37 ℃培养箱中孵育20 min，PBS冲洗3次，每个分组的贴壁细胞于荧光分光光度计下检测荧光强度，应用Graph Pad Prism软件分析每个A值的荧光强度（488nm激发波长，525 nm发射波长），实验重复3次。

1.2.7 亚铁离子检测

按照实验分组给与不同干预后，取收集好的MH-S细胞按约1×10⁶/0.2 mL裂解液置于摇床裂解10 min，15 000×g离心10min后收集不同分组标本；按照亚铁离子比色法检测试剂盒操作说明，将裂解的样品与混液A混匀，37 ℃孵育10 min，冷却至室温后加入铁离子检测试剂，常温孵育30 min，测定吸光度A_{593 nm}，根据标准曲线计算铁离子浓度。重复实验3次。

1.3 统计学方法

使用Graph Pad Prism 8.0.1对实验结果进行统计分析，所有数据以均数±标准差表示。比较变量之间的差异采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 MG呈剂量依赖性诱导肺泡巨噬细胞的铁死亡

应用MG诱导建立损伤模型，与对照组相比，90 μg/mL MG作用于MH-S细胞24 h，GPX4下降（P<0.001）；而ACSL4的表达明显上调（P<0.01，图1）。

2.2 10 μmol/mL铁死亡抑制剂挽救90 μg/mL MG所诱导的铁死亡

应用10 μmol/mL铁死亡抑制剂（FER-1）与MG共同处理小鼠肺泡巨噬细胞24 h后，结果显示FER-1能够抑制MG对肺泡巨噬细胞GPX4的下调作用以及ACSL4的上调作用，与MG组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05，图2）。

2.3 FER-1抑制MG对肺泡巨噬细胞内ROS生成的促进作用

MG干预MH-S细胞24 h，使DCFH-DA染色的贴壁肺泡巨噬细胞内ROS的水平明显升高，与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.0001，图3）。应用10 μmol/mL FER-1与MG共同干预肺泡巨噬细胞24 h可明显减少ROS的生成，与MG组相比，差异有统计学意义（P<0.0001，图3）。

2.4 MDA检测

使用BODIPY 581/591 C11探针直接检测细胞内脂质氧化水平，结果显示MG处理过后引起脂质过氧化水平增加。而FER-1与MG共培养处理过后MDA的脂质过氧化水平降低，差异具有统计学意义（P<0.0001，图4）。单独FER-1处理MH-S细胞24 h对胞内脂质过氧化的基础水平无明显影响（P>0.05）。

2.5 FER-1对抗MG诱导的MH-S细胞线粒体损伤

MG干预MH-S细胞24 h，肺泡巨噬细胞内的MFI值（反映MMP水平）降低，两者差异有统计学意义（P<0.0001）。应用10 μmol/mL FER-1与MG共同处理肺泡巨噬细胞24 h可减少MMP的丢失，使MFI升高，与MG组相比，差异具有统计学意义（P<0.001，图5）。单独FER-1处理肺泡巨噬细胞对MMP无明显影响。

2.6 FER-1抑制MG诱导的铁离子增多

与对照相比，MG处理小鼠肺泡巨噬细胞24 h铁离子增多（P<0.001）；在MG作用的同时，加用10 μmol/mL FER-1处理肺泡巨噬细胞24 h，亚铁离子减少，与MG组比较，差异有统计学意义（P<0.001，图6）。

3 讨论

MG通过AEG/RAGE诱导MH-S细胞发生凋亡，并具有浓度依赖性，但MH-S细胞凋亡率在浓度为0.8 mmol/L时达到峰值，当1.6 mmol/L时，细胞凋亡却呈现下降趋势^［13］。对这一结果最接近的解释是，高浓度的MG会诱导细胞严重坏死 。细胞凋亡是一种非溶解性的，且在免疫反应上相对沉默的细胞死亡方式，而铁死亡是一种是溶解性的，且促炎的细胞死亡方式^［14］。在铁死亡中，细胞抗氧化能力降低，致使脂质过氧化与代谢功能障碍，脂质活性氧（ROS）增多。GPX4和ACSL4蛋白被认为是铁死亡的关键标志物^［15］，其中，GPX4蛋白在铁死亡过程中起着至关重要的调节作用，其功能是将脂质氢过氧化物转化为无毒的脂质醇，从而抑制脂质过氧化^{［16， 17］}，因此GPX4也被看作是抵抗铁死亡的重要蛋白。不饱和脂肪酸（PUFA）是脂质过氧化的主要靶标之一，但是将PUFA掺入磷脂中需要 ACSL4，所以ACSL4在铁死亡中起到了促进作用^{［18， 19］}。本研究通过不同浓度的MG处理MH-S，检测细胞GPX4蛋白表达水平；结果MG浓度为90 μg/mL的条件下，GPX4蛋白水平下降；同时发现，细胞ACSL4的水平升高，表明在MH-S细胞中，MG是影响铁死亡的关键蛋白。

FER-1是一种通过小分子文库高通量筛选分离的合成化合物，通过抑制脂质过氧化来抵抗铁死亡的发生^{［20， 21］}，或通过清除起始烷氧基自由基和其他重排产物来抑制铁死亡的发生^［22］。为了明确FER-1是否对MG诱导的MH-S细胞的GPX4和ACSL4蛋白水平产生影响，本研究发现在FER-1 10 μmol/mL的浓度下，GPX4蛋白水平回升，ACSL4蛋白水平降低；同时还检测了不同组细胞的脂质过氧化物水平，其中MG组脂质过氧化物水平升高，而在MG+FER-1处理组脂质过氧化物水平降低。过往的研究表明，MG可以修饰赖氨酸和精氨酸等游离氨基以产生晚期糖基化终末产物（AGEs）^［23］，它与免疫球蛋白超家族的跨膜受体 RAGE 相互作用，启动对组织损伤和炎症的免疫反应，RAGE 也能激活多种细胞内信号通路，包括促炎介质的产生和ROS。本研究通过检测细胞活性氧含量发现，MG组中细胞活性氧的含量显著上升，而在使用FER-1处理后，其含量显著下降。线粒体是细胞内ROS的主要来源，其产生的ROS通过促进脂质过氧化导致铁死亡^［24］。Lin等^{［25， 26］}发现，线粒体融合过程中ROS和脂肪酸供应的增加会促进铁死亡 ，所以线粒体的稳定性在维持细胞内活性氧水平发挥着重要作用，而线粒体膜电位检测是评估线粒体稳定性可靠指标。本研究通过荧光强度检测线粒体的膜电位，结果显示，MG诱导的MH-S细胞中线粒体膜电位失衡，而在使用FER-1处理后，膜电位恢复到对照组水平。PUFA脂质的过氧化是由促进芬顿反应的不稳定铁池驱动的，所以亚铁离子水平也是判断铁死亡的重要标准^{［27， 28］}，本研究通过比色法检测了细胞内亚铁离子的水平，在MG组，亚铁离子含量增加，而FER-1处理后亚铁离子水平降低。

总之，我们通过铁死亡相关指标的检测证实， MG作为独立因素可以诱导MH-S细胞铁死亡的发生。可能的机制是高浓度的MG通过AGE/RAGE通路激活MH-S细胞内炎症和活性氧相关通路，导致胞内活性氧增加、GPX4蛋白消耗、亚铁离子水平增加，ACSL4上调，从而使得更多的胞膜磷脂过氧化，最终胞内高浓度的脂质过氧化物促使MH-S细胞铁死亡的发生，这一结果很可能是糖尿病合并肺炎的主要原因之一，而上述过程可以被FER-1所挽救。

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