血清色氨酸用于乙肝相关慢加急性肝衰竭90 d死亡风险分层管理的潜在价值：一项多中心回顾性研究

Value of serum tryptophan in stratified management of 90-day mortality risk in patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure: a multicenter retrospective study

摘要

目的 探索血清色氨酸与乙肝相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）死亡风险之间的相关性。 方法 回顾性纳入180例HBV-ACLF患者，根据确诊后90 d结局为患者分为存活组和死亡组；采用高效液相色谱法测定两组患者外周血中的血清色氨酸含量；比较两组患者基线血清色氨酸水平的差异；通过单因素及多因素回归分析基线血清色氨酸水平对于HBV-ACLF患者确诊后90 d病死率的影响；通过受试者曲线下面积探讨血清色氨酸对HBV-ACLF 90 d死亡风险的潜在预测价值。 结果 90 d随访期内，53例（29.4%）HBV-ACLF患者因疾病死亡，127例（70.6%）存活。死亡患者的基线色氨酸水平低于存活患者（P<0.001）；经多因素回归分析校正混杂因素显示，色氨酸水平是HBV-ACLF死亡风险的独立预测因素。HBV-ACLF患者入组时低水平色氨酸（<10.14 pg/mL）与高水平色氨酸（≥10.14 pg/mL）相比具有更高的90 d死亡风险（43.3% vs 15.6%，HR：3.157，95% CI：1.713-5.817）；同时合并肾功能不全和低水平色氨酸的90 d死亡风险更高（73.3% vs 15.0%，HR：7.558，95% CI：3.369-16.960）；血清色氨酸水平用于预测HBV-ACLF患者的90 d死亡风险具有一定潜在价值（ROC=0.771，95% CI：0.699-0.844）。 结论 血清色氨酸与 HBV-ACLF预后密切相关；低水平的血清色氨酸预示90 d高死亡风险；尤其是同时合并肾功能不全的患者90 d死亡风险更高。

Abstract

Objective To explore the correlation of serum tryptophan level with 90-day mortality risk in patients with hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure (HBV-ACLF). Methods This retrospective study was conducted among 108 patients with HBV-ACLF, whose survival outcomes within 90 days after diagnosis were recorded. The correlation of baseline serum tryptophan levels measured by high-performance liquid chromatography with 90-day mortality of the patients was analyzed, and the predictive value of serum tryptophan for 90-day mortality was explored. Results Within 90 days after diagnosis, 53 (29.4%) of the patients died and 127 (70.6%) survived. The deceased patients had significantly lower baseline serum tryptophan levels than the survivors (7.31±3.73 pg/mL vs 13.32±7.15 pg/mL, P<0.001). Multivariate analysis suggested that serum tryptophan level was an independent factor correlated with mortality of HBV-ACLF after adjustment for confounding variables. The patients with serum tryptophan levels below the median level (10.14 pg/mL) at admission had significantly higher 90-day mortality risks than those with higher tryptophan levels (43.3% vs 15.6%, HR: 3.157, 95% CI: 1.713-5.817), and the complication by kidney dysfunction further increased the risk to 73.3% as compared with patients with higher serum tryptophan levels with normal kidney function (15.0%; HR: 7.558, 95% CI: 3.369-16.960). Serum tryptophan levels had an area under the receiver operating characteristic curve of 0.771 (95% CI: 0.699-0.844) for predicting 90-day mortality. Conclusion Serum tryptophan level is closely correlated with the survival outcomes of patients with HBV-ACLF, and a decreased tryptophan level indicates a high 90-day mortality risk, which can be further increased by the complication by kidney dysfunction.

Graphical abstract

关键词

肝衰竭 / 预后 / 色氨酸 / 乙型肝炎病毒 / 肾功能不全

Key words

liver failure / prognosis / tryptophan / hepatitis B virus / kidney dysfunction

乙肝相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）是乙型肝炎病毒慢性感染基础上出现的急性严重肝损伤，具有病情进展迅速、短期内高病死率的特点^{［1， 2］}；但HBV-ACLF具有潜在可逆性，即渡过急性损伤期后可恢复至发病前状态^{［3， 4］}。因此，基于HBV-ACLF的转归差异实现风险人群的风险管理，能够合理利用医疗资源，有效提升医疗救治水平，一直是该领域的热点问题。

HBV-ACLF临床表现为急剧的肝功能失代偿，具有全身性炎症反应和器官衰竭等典型特征^{［5， 6］}，由于系统性炎症反应导致广泛的蛋白水解已被证实^{［7， 8］}。免疫代谢广泛参与HBV-ACLF 的发病机制^{［9， 10］}；严重的代谢紊乱已被证实与慢加急性肝衰竭的免疫炎症反应和免疫抑制特征密切关联 ^{［11， 12］}，尤其是与系统性炎症相关的免疫代谢紊乱；因此，发掘具有潜能的免疫代谢标志物可望建立HBV-ACLF临床转归的风险预测。已知色氨酸代谢是重要的免疫调节因子，参与炎症反应的免疫调控，与免疫耐受甚至免疫麻痹密切相关，进而影响疾病进程；已有研究证实色氨酸分解代谢与ACLF的器官功能衰竭和系统性炎症反应息息相关^［13］。因此，本研究旨在探索血清色氨酸对HBV-ACLF患者临床结局的影响。然而，色氨酸代谢是否关联HBV-ACLF预后尚不清楚。因此，本研究旨在探索血清色氨酸与HBV-ACLF临床转归的相关性，探讨色氨酸预测HBV-ACLF死亡风险的潜在价值。

1 资料和方法

1.1 病例来源

本研究属于2012~2014年多中心开展的国家重大专项（注册号：ChiCTR-TRC-00000766）的分项研究；所有受试者均来自中国大陆地区18家临床医疗机构。本研究纳入对象均符合HBV-ACLF诊断标准，非乙肝相关慢加急性肝衰竭如免疫性、药物性、酒精性、中毒性、肝癌、寄生虫或重叠其他嗜肝、非嗜肝病毒感染均被排除；所有病例均有确诊后90 d完整随访记录，入院后均接受包括核苷（酸）类似物在内的标准内科治疗方案，失访或退出试验或接受肝移植治疗者均被排除。本研究已获得中国人民解放军总医院第五医学中心伦理委员会（原中国人民解放军第三〇二医院医学伦理委员会）批准（伦理批号：2017006D）。本研究为回顾性研究，已豁免患者知情同意。

1.2 诊断标准

HBV-ACLF定义为已知或先前未诊断的HBV慢性病毒感染者基础上出现以急性黄疸加深、 凝血功能障碍为肝衰竭表现的综合征，且符合国际标准化比值（INR）≥1.5和总胆红素≥5 mg/dL，伴有腹水和（或）肝性脑病^［6］。

1.3 方法

回顾性纳入180例HBV-ACLF患者，所有患者根据确诊后90 d临床结局分为死亡组、存活组；采用靶向氨基酸代谢组学获取基线血清氨基酸含量，分析两组的基线特征，对比基线血清色氨酸的差异，分析血清色氨酸对于90 d死亡的影响，评估血清色氨酸对90 d死亡风险的预测能力。

1.4 血清色氨酸检测

采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）系统定量血清色氨酸水平（ExionLC™ AD UHPLC-QTRAP® 6500+，AB SCIEX Corp.）。将样品（100mg）用液氮重悬，然后0.9 mL水混合，涡旋搅拌，制备10倍稀释样品。稀释50倍后，取50 μL样品与200 μL含有混合内标物的乙腈/甲醇（1∶1）混合，涡旋均质。然后将这些样品在冰上沉淀30 min，再以12 000 r/min的转速离心10 min。然后将上清液注入LC-MS/MS系统进行进一步检测。

采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）进行分离，色谱柱温度保持在50 ℃。流动相流速为0.30 mL/min，包括溶剂A（0.1%甲酸溶于5 mmol/L乙酸铵）或溶剂B（0.1%甲酸溶于乙腈）。溶剂梯度的设定参数如下：初始80%B，0.5 min；80%~70%B，2 min；70%~45%B，4 min；45%~80%B，6 min；80% B，9 min；同时，离子喷雾电压：5500 V，帘气压力：35 psi，离子源温度：550 ℃，离子源气体压力：35 psi：同时，离子喷雾电压：5500 V，帘式气体压力：35 psi，离子源温度：550 ℃，离子源气体压力分别为50 psi和60 psi。为评估标准溶液的线性，标准浓度在横坐标上绘制，内部标准峰面积比在纵坐标上。定量极限由信噪比确定，信噪比将从标准溶液浓度检测到的信号与空白矩阵的信号进行比较。通常，10∶1的信噪比指定相应的定量极限浓度。

1.5 统计学分析

本研究中定量数据采用均数±标准差表示，定性数据以频数和百分比表示。采用Mann-Whitney U检验对不符合正态分布的定量资料进行组间比较，t检验用于正态分布的定量资料组间比较；卡方检验用于定性资料的组间比较。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并比较组间累积死亡率的差异。采用Cox 分析以评估低血清色氨酸水平与肾功能不全之间的相互作用，同时控制潜在的混杂因素；根据临床经验和单因素分析纳入混杂因素进行校正，评估各因素对90 d死亡率的影响；如果两个因素之间不存在明显的相互作用，则该模型可用于独立估计两个因素的综合效应。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基线特征

本研究患者，平均年龄为44.6±10.6岁，162例（90%）为男性；MELD评分、MELD-Na评分和AARC评分分别为24.2±4.8、25.9±6.8、7.8±1.3；其总胆红素值为19.7±7.1 mg/dL，INR值为2.2±0.6。其余基线特征见表1。

90 d随访期内，53例（29.4%）因疾病死亡，127例（70.6%）存活。28 d、90 d累积病死率分别为6.7%、29.4%（表1）。死亡组与存活组虽然在性别分布无差异，但是在年龄、部分肝功能指标、血小板计数等方面的差异具有统计学意义（P<0.05，表1）。与存活患者相比，死亡患者具有更高比例的肝性脑病、肾功能不全（肝性脑病：P=0.001；肾功能不全：P=0.003）；其基线的MELD评分，MELD-Na评分，和AARC评分均升高（MELD：P=0.011；MELD-Na：P=0.005；AARC：P=0.001）；此外，死亡患者基线血清色氨酸水平低于存活患者（P<0.001，表1）。

2.2 血清色氨酸独立影响HBV-ACLF患者临床结局

经不同模型控制混杂因素后，结果均显示血清色氨酸独立影响HBV-ACLF死亡风险，低水平的血清色氨酸预示HBV-ACLF 90 d高死亡风险；不同模型计算的校正HR分别为0.853、0.858、0.847和0.861（表2）。

2.3 血清色氨酸预测HBV-ACLF患者临床结局的潜在价值

血清色氨酸预测90 d死亡结局的能力优于MELD、MELD-Na和AARC评分（P<0.05）；血清色氨酸预测28 d死亡结局的能力更差（P<0.05，表3）。

2.4 血清色氨酸对HBV-ACLF患者死亡结局的影响

根据本研究患者的血清色氨酸中位水平（10.14 pg/mL），将患者分为血清色氨酸高水平组（≥10.14 pg/mL，n=90）和低水平组（<10.14 pg/mL，n=90）；低水平组90 d累积病死率高于高水平组（43.3% vs 15.6%；HR：3.157，95% CI：1.713-5.817）（图1）。

与基线高水平色氨酸组相比，低水平组的肾功能不全比例更高（P=0.037）；但是在肝性脑病、腹水、凝血功能不全、肝衰竭等方面差异无统计学意义（P>0.05，表4）。多因素分析显示色氨酸水平和肾功能不全无交互作用（P=0.483）。HBV-ACLF患者合并低水平色氨酸和肾功能不全时90 d累积死亡率为73.3%，高于高水平色氨酸且无肾功能不全的患者90 d死亡率15.0%（P<0.001）。Cox多因素回归分析结果显示，与无低水平色氨酸或肾功能不全的HBV-ACLF患者相比，HBV-ACLF患者仅合并低水平色氨酸的90 d死亡风险升高（HR=2.629；95% CI：1.362-5.078）； HBV-ACLF患者合并低水平色氨酸和肾功能不全的死亡风险进一步升高（HR=7.558；95% CI：3.369-16.960）（表5、图2）。

3 讨论

本研究发现血清色氨酸与HBV-ACLF临床转归密切关联；低水平色氨酸预示90 d高死亡风险；值得关注的是，低水平色氨酸合并肾功能不全时，其死亡风险更高。除此之外，本研究结果显示血清色氨酸具有一定的预测90 d死亡结局的能力。已有研究发现增强的色氨酸分解代谢可能与ACLF高死亡风险相关^［13］，这与我们的发现是相似的。另外，我们还发现合并低水平血清色氨酸与肾功能不全对于死亡结局的增强效应；提示HBV-ACLF合并低水平血清色氨酸和肾功能不全不良转归风险尤为高，更值得临床关注。

我们推测低水平色氨酸与HBV-ACLF高死亡风险密切相关，其机制可能与色氨酸代谢在体内发挥的的免疫抑制功能有关。正常状态下，体内色氨酸稳态主要依靠色氨酸2，3-双加氧酶^{［14， 15］}，游离色氨酸进入肝脏主要用于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生物合成（NAD+）；后者主要用于维持细胞稳态和能量支持^［16］。全身炎症条件下，能量需求增加，细胞内NAD+耗竭会导致ATP合成受阻^［17］，NAD+合成代谢被阻能够继而促进炎症损伤^［18］。全身炎症反应被认为是ACLF的标志，是导致多器官衰竭和高死亡率的主要原因^{［19， 20］}；本研究中死亡人群患者中色氨酸水平低可能与剧烈炎症导致其分解代谢有关；对于高死亡风险ACLF患者而言，随着全身炎症的加剧以及能量需求增加，色氨酸分解代谢增强，进而愈发促进炎症，从而面临更高的不良转归。肝外器官如肾脏和免疫细胞主要通过犬尿氨酸途径代谢色氨酸，将色氨酸转化为喹啉酸等代谢产物^{［21，22］}；而促炎刺激下，犬尿氨酸通路产生代谢产物具有抑制T细胞免疫反应^{［23，24］}。已有的研究证实，色氨酸分解代谢通过代谢产物蓄积和色氨酸耗竭导致免疫耐受^［25］；全身炎症则通过激活色氨酸分解代谢从而导致多种疾病过程中的器官损伤^{［26，27］}。有研究亦表明犬尿氨酸代谢途径活性与ACLF的发展和恶化有关^［13］。由此提示低水平色氨酸人群合并肾脏器官功能衰竭出现更高的死亡风险，可能与分解代谢产物蓄积带来的免疫抑制甚至麻痹状态有一定关联。

综上所述，本研究从临床角度初步提供了色氨酸代谢与HBV-ACLF临床结局之间关联性的数据支撑，揭示其临床关联性，初步明确色氨酸用于预测90 d死亡风险的潜在价值；值得关注的是，当HBV-ACLF合并低水平色氨酸和肾功能不全时，需警惕高风险的不良转归。本研究从色氨酸代谢角度为HBV-ACLF的死亡风险管理提供一定的临床依据，但有关深层机制仍需进一步探索。

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