重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂可通过调节炎症微环境对“二次打击”脓毒症小鼠发挥治疗作用

Schistosoma japonicum cystatin has protective effects against "two-hit" sepsis in mice by regulating the inflammatory microenvironment

摘要

目的 探讨重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（rSj-Cystatin）对“二次打击”脓毒症小鼠的干预作用。 方法 64只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组（A组）、蛋白组（B组）、“二次打击”造模组（C组）、蛋白干预组（D组），16只/组。A组和B组小鼠首先腹腔注射PBS（100 μL/只），24 h后开腹探查盲肠，但不进行盲肠结扎和穿刺（CLP），术后30 min，分别腹腔注射PBS（100 μL/只）或含25 μg rSj-Cystatin 蛋白的PBS（100 μL/只）；C组和D组小鼠首先腹腔注射含LPS（5 mg/kg）的PBS（100 μL/只），24 h后行 CLP手术，术后30 min，分别腹腔注射PBS（100 μL/只）或含25 μg rSj-Cystatin 蛋白的PBS（100 μL/只）。每组随机抽取6只，造模12 h后取小鼠血清、脾、肝、肺和肾组织。肝、肺和肾组织HE染色观察其病理损伤并进行评分；酶联免疫吸附实验（ELISA）检验血清和肝、肺、肾组织匀浆中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）水平以及组织中巨噬细胞极化标志物iNOS和Arg-1水平；流式细胞术检测脾脏CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T的比例变化；剩余小鼠造模后记录72 h生存率并观察小鼠状态。 结果 与A、B组（100%）相比，C组（0%）72 h生存率降低，经rSj-Cystatin蛋白治疗后，D组生存率较C组增高（20%）。与A、B两组相比，C组肝、肺、肾组织切片病理损伤加重，血清和组织匀浆中TNF-α、IL-6水平明显升高（P<0.05）； 经蛋白治疗后，病理损伤程度减轻，血清和组织匀浆中TNF-α、IL-6水平降低（P<0.05），调节因子IL-10、TGF-β水平明显升高（P<0.05），同时CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T比例升高（P<0.05）；与A、B两组相比，C组各器官组织中iNOS水平均升高，而Arg-1水平呈差异性，仅在肾中呈下降趋势（P<0.01）；与C组相比，D组iNOS水平下降（P<0.05），Arg-1水平升高（P<0.001）。 结论 rSj-Cystatin可通过调节炎症微环境进而对 “二次打击”脓毒症起到明显的治疗作用。

Abstract

Objective To evaluate the protective effect of Schistosoma japonicum cystatin (rSj-Cystatin) in a mouse mode of "two-hit" sepsis. Methods Sixty male C57BL/6 mice randomized equally into sham-operated group, protein group, "two-hit" modeling group, and protein intervention group. In the former two groups, the mice received an intraperitoneal injection of 100 μL PBS followed by exposure of the cecum and then by intraperitoneal injection of 100 μL PBS or 25 μg rSj-Cystatin 30 min later; In the latter two groups, 100 μL PBS containing LPS (5 mg/kg) was injected intraperitoneally 24 h before cecal ligation and puncture (CLP), and 100 μL PBS or 25 μg rSj-Cystatin were injected 30 min after CLP. At 12 h after rSj-Cystatin treatment, 6 mice from each group were sacrificed for detection of TNF-α, IL-6, IL-10, TGF-β, iNOS and Arg-1 in the serum, spleen, liver, lung and kidney tissues using ELISA, for examinations of liver, lung and kidney pathologies with HE staining, and for analysis of CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T cell percentage in the spleen using flow cytometry. The remaining mice were observed for general condition and 72-h survival. Results The 72-h survival rates in the 4 groups were 100%, 100%, 0% and 20%, respectively, showing significant differences between the latter two groups. The mouse models of "two-hit" sepsis exhibited obvious tissue pathologies and significant elevations of TNF-α and IL-6 in both the serum and tissue homogenate, which were significantly ameliorated by rSj-Cystatin treatment. Treatment with rSj-Cystatin also increased IL-10 and TGF-β levels and spleen CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T cell percentage. The septic mouse models also showed increased iNOS levels in all the detected tissues and a decreased Arg-1 level in the kidney, and these changes were obviously improved by rSj-Cystatin treatment. Conclusion rSj-Cystatin has a protective effect against "two-hit" sepsis in mice by regulating the inflammatory microenvironment.

Graphical abstract

关键词

重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂 / 脂多糖 / 盲肠结扎穿刺 / 脓毒症 / 免疫调节因子

Key words

Schistosoma japonicum cysteine protease inhibitors / lipopolysaccharide / cecal ligation and puncture / sepsis / immunoregulatory cytokines

脓毒症是一种因宿主对感染反应失调而死的多器官功能障碍，涉及到凝血、细胞和代谢功能等多种机制^［1-3］。在创伤患者中，初始创伤（如失血性休克、缺血-再灌注损伤、烧伤等）会导致机体出现异常的免疫或炎症反应，诱导TNF-α、IL-6和白细胞介素-1β（IL-1β）等各种炎症因子的分泌，最终触发全身炎症反应综合征（SIRS）^［4-6］。而第二次打击（如继发感染）时，会进一步导致全身炎症反应加剧，最终可能引起脓毒性休克及多器官功能障碍综合征（MODS），而这些炎症变化被称为“二次打击”假说^［7］。炎症反应在“二次打击”过程中扮演着核心作用，决定着患者的早中期临床表现^［8］。因此，如何调控炎症反应，促进免疫平衡是治疗“二次打击”脓毒症进而改善早期临床症状的重要策略。

近年来，流行病学以及大量实验研究表明，蠕虫寄生过程可诱导宿主产生特异性免疫应答，进而对自身免疫性和过敏性疾病所导致的过度免疫反应产生显著的抑制效果^［9］。研究者们通过蠕虫感染或虫源性蛋白干预脓毒症取得了一定的成果，显示蠕虫衍生蛋白在治疗免疫失调性疾病中的潜在应用价值^{［10， 11］}_。在虫源性分子中，不同蠕虫来源的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）被证实在调控宿主的免疫反应中均发挥重要作用^［12-14］。本实验所选用的重组日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（rSj-Cystatin）已被证实对多种免疫性疾病均有较好的治疗作用，如溃疡性结肠炎、胶原性关节炎和动脉粥样硬化性肾损伤等^［15-17］，尤其是此前已证实该蛋白可通过调控肠道免疫微环境从而改善溃疡性结肠炎的临床症状，由于肠道被认为是人类最大的免疫器官，肠道与远隔器官之间存在相互作用，其可能通过肺-肠轴、肠-肝轴和肠-肾轴等途径实现，进一步影响全身炎症反应^［18］。而rSj-Cystatin是否仍能够有效缓解“二次打击”脓毒症症状，改善其他组织器官损伤以及其相关机制尚不清楚。基于此，本研究首先对小鼠进行腹腔注射5 mg/kg LPS造成初始脓毒症损伤^［19］。其次，进行CLP操作，产生亚急性感染性腹膜炎并放大炎症反应，即建立了“二次打击”脓毒症经典模型^{［20， 21］}；接着通过腹腔注射25 μg rSj-Cystatin进行干预治疗；通过评价生存率、不同组织病理损伤和全身及局部炎症反应，Treg细胞比例以及各组织脏器巨噬细胞极化标志物水平等，明确了rSj-Cystatin对“二次打击”脓毒症的治疗效果，并初步探究其潜在机制，以期为蠕虫疗法应用于临床提供了实验基础和理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验所需动物选用雄性C57BL/6小鼠，约6~8周龄，体质量20~22 g，清洁级，动物实验经蚌埠医科大学实验动物管理和伦理委员会批准（伦理批号：BBMC-2023-539）。

1.2 主要试剂与仪器

脂多糖（LPS）（索莱宝），ELISA试剂盒（达科为、Elabscience），酶标仪Model 550（BIO-Rad），GST标签蛋白纯化试剂盒（BD），内毒素去除试剂盒（Thermo Scientific），BCA定量试剂盒（Biosharp），PBS（Gibco），苏木-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝）；anti-mouse CD4-FITC，anti-mouse CD3-PE/CY7，anti-mouse CD25-APC，anti-mouse FOXP3-PE，Rat IgG2b，k Isotype Ctrl-PE（Biolegend）；Fixation/Permeabilization Concentrate，eBioscience^TMFixation Perm Diluent，Permeabilization Buffer 10×（Invitrogen）。

1.3 重组Sj-Cys蛋白的表达和提纯

参照文献［22］的制备方法，经测序确认的重组质粒被转化到大肠杆菌BL21/DE3 后，经37 ℃ IPTG诱导5 h。收集细菌，使用GST标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，并依次经凝血酶酶切、SDS-PAGE 鉴定纯化效果后，去除纯化蛋白内毒素，BCA 法测定蛋白浓度后分装冻存于-80 ℃备用。

1.4 实验小鼠分组和模型的建立

采购雄性C57BL/6小鼠，实验室适应性饲养1周后，取64只健康雄性小鼠随机分为4组，即假手术组（A组）、蛋白组（B组）、“二次打击”造模组（C组）、蛋白干预组（D组）。A组和B组实验小鼠首先腹腔注射PBS（100 μL/只），24 h后吸入异氟醚麻醉，开腹探查盲肠，但不进行盲肠结扎和刺穿，术后30 min，A组腹腔注射PBS（100 μL/只），B组腹腔注射含25 μg rSj-Cystatin 蛋白的PBS（100 μL/只）。C组和D组参照文献［18］的造模方法，以每千克小鼠注射5 mg LPS的换算关系，计算每只小鼠注射LPS的量， PBS缓冲液 100 μL进行稀释后腹腔注射。24 h后小鼠吸入异氟醚麻醉，然后用3-0号无菌手术线结扎盲肠远端三分之一，用25号针头刺穿，轻轻挤压盲肠，挤出粪便后，将盲肠复位。酒精擦拭腹部，腹壁和皮肤分两层用4-0号无菌手术线缝合。其中D组小鼠在建模30 min后腹腔注射含25 μg rSj-Cystatin 蛋白的PBS（100 μL/只），C组腹腔注射PBS（100 μL/只）。造模12 h后，每组各随机取6只小鼠麻醉，采集小鼠血清、脾脏和各组织脏器以备后续检测。剩余10只小鼠用于术后72 h内各个时间段死亡/生存小鼠，根据存活小鼠占比计算小鼠生存率并且绘制生存曲线。

1.5 ELISA法检测小鼠血清中细胞因子的变化

将小鼠麻醉后眼球取血，常温静置30 min后，4500 r/min，离心15 min，收集上层血清，-80 ℃保存。ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β水平。

1.6 流式细胞术检测脾脏Treg的比例变化

小鼠采取左侧卧位，喷洒酒精，在小鼠肋下剪开3~5 cm切口，暴露脾脏，将新鲜摘取的脾脏研磨制成细胞悬液，将CD3、CD4、CD25流式抗体与工作液按着1∶400比例配制，100 μL/孔，孵育20 min，破膜固膜后染Foxp3抗体，Foxp3∶1×Buffer=1∶150的比例配制，孵育30 min，离心后加入工作液，重悬细胞，流式上机。

1.7 HE染色评价各组织病理变化

小鼠取血死亡后，打开胸腹腔后用PBS进行心脏灌流。摘取肝、肺和肾器官，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色。镜下观察各组小鼠组织切片的病理变化。

1.8 双盲法评定病理损伤

肝细胞坏死、出血和炎症细胞浸润对肝损伤进行组织学评分（表1）；肺泡充血、出血、中性粒细胞浸润和血管壁、肺泡壁透明膜形成厚度对肺损伤进行评分（表2）；肾小管损伤和肾小球萎缩的严重程度对肾损伤进行评分（表3）。

1.9 ELISA检测局部组织中细胞因子的变化

小鼠取血死亡后，打开胸腹腔后用PBS进行心脏灌流。摘取肝、肺、肾器官，各自称量50 mg放入EP管中，加入无酶磁珠和450 μL PBS溶液，使用组织研磨机65 HZ，研磨60 s；4 ℃，3000 r/min，离心15 min 取上清备用。BCA检测组织匀浆蛋白浓度，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β水平。

1.10 ELISA检测局部组织中巨噬细胞极化标志分子的变化

按照1.9方法收集各组织匀浆，采用ELISA法检测iNOS和Arg-1的水平。

1.11 统计学分析

应用 GraphPad Prism 8.01 统 计软件进行统计学分析，所有正态分布数据均采用均数±标准差表示，两组间生存率的比较采用 Log-rank检验，多组间差异的比较采用单因素方差分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rSj-Cystatin提高“二次打击”脓毒症小鼠生存率

A组和B组小鼠术后可正常饮食，活动自如，不抱团，体毛顺滑。C组小鼠术后基本不进食，抱团不活动，眼睛大部分闭合，眼角黄白色分泌物明显增多，毛发暗淡杂乱，死亡时间主要集中于36 h内。结果显示：72 h内，C组小鼠生存率为0，与A组和B组相比，明显下降（P<0.001，图1）；D组相比于C组，小鼠的精神、活力、食量均有所好转，且72 h存活率提高到20%，差异有统计学意义（P<0.01，图1）。

2.2 rSj-Cystatin改善“二次打击”脓毒症引起的病理损伤

病理检查情况（图2）可见：肝脏HE染色结果可见A组和B组肝小叶结构正常，细胞核居中呈辐射状排布，未见细胞水肿、炎性细胞浸润等异常现象；而C组小鼠正常肝小叶结构消失，肝细胞明显水肿，排布紊乱，较多炎性细胞浸润，与A组相比，肝脏病理损伤评分明显升高（P<0.001，图2）；与C组相比，D组肝细胞水肿减轻，炎性细胞浸润减少，损伤评分降低（P<0.001，图2）。肺脏HE染色结果显示（图2）：A和B组肺泡、肺间隔结构正常，无充血现象；与A组相比，C组肺泡结构杂乱无章，肺泡缺损或肿胀，肺泡隔明显增厚，病理损伤评分升高（P<0.001，图2）；经rSj-Cystatin治疗后，肺泡轮廓较为完整，肺泡隔增厚程度较轻，损伤评分降低（P<0.001，图2）。肾脏HE染色结果表明（图2）：A和B组肾小球以及肾小管结构正常（图2）；“二次打击”后，小鼠肾小球明显皱缩，肾小管细胞结构破坏，病理损伤评分显著增加（P<0.001，图2）；经rSj-Cystatin治疗后，肾小球皱缩改善，肾小管损伤情况好转，病理损伤评分下降（P<0.001，图2）。

2.3 rSj-cystatin调控“二次打击”脓毒症小鼠脾脏CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的比例

实验分选了各小鼠脾脏CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞，统计其比例。按照图3所示的圈门策略在CD3⁺CD4⁺T细胞中分析CD25⁺Foxp3⁺T细胞的比例变化，结果显示：与A组相比，C组CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞占脾脏细胞的比例升高（P<0.05，图3），而经蛋白干预后，D组CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞比例进一步升高（P<0.01，图3）。

2.4 rSj-Cystatin调控“二次打击”脓毒症小鼠血清的炎症因子水平

采用ELISA检测小鼠血清中细胞因子水平，结果显示：与A组相比，C组小鼠“二次打击”后促炎因子IL-6和TNF-α水平升高（P<0.001，图4）； 经rSj-Cystatin干预后，D组IL-6和TNF-α水平下降（P<0.01，图4），且抑炎因子IL-10和TGF-β均升高（P<0.001，图4）。

2.5 rSj-Cystatin调控“二次打击”脓毒症小鼠肝、肺、肾组织炎症因子水平变化

与A组相比，C组小鼠“二次打击”后肝脏促炎因子IL-6和TNF-α水平升高（P <0.001，图5）；经rSj-Cystatin干预后，D组IL-6和TNF-α水平下降（P<0.001，图5），同时抑炎因子IL-10和TGF-β水平升高（P<0.05，图5）；肺脏和肾脏细胞因子水平变化趋势同肝脏相似，与C组相比，D组IL-6和TNF-α水平明显下降（P<0.05，图5）；经rSj-Cystatin干预后，D组抑炎因子IL-10和TGF-β明显升高（P<0.05，图5）。

2.6 rSj-Cystatin调控“二次打击”脓毒症小鼠肝、肺、肾组织巨噬细胞表面标志物水平变化

ELISA检测结果显示： 与A组相比，C组小鼠“二次打击”后肺脏、肝脏和肾脏iNOS的水平升高（P<0.001，图6）；与C组相比，D组各脏器的iNOS的水平呈下降趋势，尤以肾脏显著（P<0.05，图6），同时Arg-1表达明显上升（P<0.001，图6）。

3 讨论

脓毒症作为外科或重症监护病房患者死亡的主要原因之一，在全球范围内影响着约4890万人，每年导致1100万人死亡 ^［23-26］。研究证实，在脓毒症早期便可引起严重的机体损伤，主要通过IL-6、TNF-α等大量炎性因子的释放导致“炎症风暴”，从而致使全身炎症反应^［27-28］。失控的炎症最终会导致多器官衰竭甚至死亡。

近些年源自蠕虫的虫源性分子通过调控宿主免疫稳态显著改善部分免疫失衡性疾病已经成为寄生虫学研究领域最热门的研究任务之一。在虫源性分子防治脓毒症的研究中，已有实验证实来自旋毛虫成虫排泄分泌蛋白、华支睾吸虫亲环素A、魏氏棘唇线虫衍生抗原ES-62对脓毒症有改善效果，体现出潜在的临床应用价值^［29-31］_。本课题组选用源自日本血吸虫的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂rSj-Cystatin干预治疗脓毒症，其前期已被证实可通过抑制抗原呈递，减少模式识别受体的表达，降低炎性因子的分泌等方式控制溃疡性结肠炎、胶原诱导的关节炎和心肌梗死等疾病的治疗过程中疗效显著^{［15-16， 32］}。

基于此，本课题组研究了rSj-Cystatin对具有更严重炎症反应，可能导致更早死亡的“二次打击”脓毒症模型的影响。结果显示：与C组相比，经rSj-Cystatin治疗可降低脓毒症的严重程度，存活率在72 h观察期内提高到20%，其生存率的提高还体现在肝、肺和肾等重要脏器的病理损伤的减轻以及炎症微环境的改善。研究表明，与 “二次打击”造模组相比，蛋白干预治疗组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞比例显著升高，外周循环中抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β大量释放，改善了“二次打击”脓毒症的炎症微环境。进一步研究发现，调控炎症和减少组织损伤潜在的免疫机制还可能与rSj-Cystatin诱导巨噬细胞M1、M2极化相关，与C组相比，D组小鼠肝、肺和肾组织中，M1相关标志物iNOS的表达水平降低而M2标志物Arg-1的表达水平增加，血清与组织匀浆中调节细胞因子IL-10和TGF-β水平的升高和促炎细胞因子TNF-α、IL-6水平的降低，与小鼠组织中巨噬细胞M2极化一致。

本实验结果表明，rSj-Cystatin可有效提高 “二次打击”脓毒症小鼠的生存率，调节细胞因子平衡，增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞比例，显著改善多器官的病理损伤，从而改善脓毒症的临床症状，其治疗效果与之前研究相似^［33-35］。但这些疾病模型仍然存在一定的局限性，小鼠品系、性别以及环境的影响可能会影响研究结果。本实验为rSj-Cystatin治疗脓毒症且进一步应用于临床提供了大量的理论依据和实验支持，但其作用的具体机制仍需进一步研究。

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基金资助

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蚌埠医科大学研究生科研创新计划项目(Byycx22011)

蚌埠医科大学研究生科研创新计划项目(Byycx23082)

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