化橘红配方颗粒通过维持铁稳态并抑制脂质过氧化和铁死亡缓解斑马鱼脂肪性肝病

Exocarpium Citri Grandis formula granules alleviate fatty liver disease in Zebrafish by maintaining iron homeostasis and suppressing lipid peroxidation and ferroptosis

摘要

目的 探讨化橘红配方颗粒治疗脂肪性肝病（FLD）的药效作用和具体机制。 方法 将受精后3 d的斑马鱼幼鱼随机分为空白组、模型对照组、化橘红配方颗粒处理组（16、32、64 μg/mL），分别构建斑马鱼幼鱼非酒精性脂肪肝（NAFLD）和酒精性脂肪肝（ALD）模型，采用生存分析、病理组织切片、全鱼油红O染色和实时定量荧光PCR实验评价化橘红配方颗粒治疗FLD的药效，并从CAV1和铁代谢及铁死亡角度探讨其治疗FLD的具体机制，通过普鲁士蓝染色、DCFH-DA活体探针、丙二醛含量检测、实时定量荧光PCR实验和CAV1免疫组织化学染色分析化橘红配方颗粒治疗FLD的药效验证和具体机制。 结果 化橘红配方颗粒能减轻斑马鱼幼鱼NAFLD和ALD模型中的脂质累积，减少脂肪酸合成酶、固醇调节元件结合蛋白1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、肿瘤坏死因子-α和白介素6的表达水平，升高载脂蛋白A1和PPARα表达水平。化橘红配方颗粒可以减少斑马鱼幼鱼NAFLD和ALD模型中肝脏的铁沉积，减少幼鱼体内的丙二醛和活性氧含量（P<0.05）。NAFLD状态下，不同浓度的化橘红配方颗粒可升高Tf、TfR、FPN和SLC7A11表达（P<0.05），中、高浓度的化橘红配方颗粒可升高谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达（P<0.05）；ALD状态下，斑马鱼幼鱼的Tf、TfR和FPN表达升高，不同浓度的化橘红配方颗粒可降低这些基因的表达（P<0.05）。化橘红配方颗粒对ALD状态下SLC7A11的表达无明显影响，但高浓度的化橘红配方颗粒可升高GPX4的表达（P<0.05），免疫组织化学染色和实时定量荧光PCR实验结果显示，在NAFLD和ALD状态下，斑马鱼幼鱼肝脏的CAV1升高，而中、高浓度的化橘红配方颗粒可明显改善评价两种脂肪肝状态下斑马鱼幼鱼肝脏的CAV1表达。 结论 化橘红配方颗粒可减轻NAFLD和ALD的脂质累积和炎症反应，并通过减少CAV1的表达纠正NAFLD和ALD的铁稳态失衡、脂质过氧化和铁死亡。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect of Exocarpium Citri Grandis formula granules (ECGFG) on fatty liver disease (FLD) in zebrafish and explore the underlying mechanism. Methods Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and alcoholic fatty liver disease (ALD) models were established in zebrafish larvae at 3 days post fertilization (dpf), in which the treatment efficacy of 16, 32, or 64 μg/mL ECGFG was evaluated by examining zebrafish survival and liver pathologies and using whole-fish oil red O staining and RT-qPCR. The therapeutic mechanism of ECGFG for FLD was investigated using Prussian blue staining, DCFH-DA probe, MDA content detection, RT-qPCR assay and immunohistochemical staining for CAV1. Results In zebrafish models of NAFLD and ALD, treatment with ECGFG significantly reduced lipid accumulation and the expression levels of FASN, SREBP1, HMGCRA, TNF-α and IL-6, increased the expressions of Apoa1 and PPARα, and reduced iron deposition and the contents of MDA and ROS in the liver. In zebrafish models of NAFLD, treatment with ECGFG at the 3 doses significantly increased hepatic expressions of Tf, TfR, FPN and SLC7A11, and at the doses of 32 and 64 μg/mL, ECGFG obviously increased hepatic expression of GPX4. ALD fish models showed significantly increased hepatic expressions of Tf, TfR and FPN, which were effectively lowered by treatment with ECGFG at the 3 doses. ECGFG did not obviously affect the expression of SLC7A11, but its high dose (64 μg/mL) caused significant elevation of GPX4 expression. Both zebrafish models of NAFLD and ALD showed obviously increased CAV1 expression level in the liver, which was significantly reduced by treatment with 32 and 64 μg/mL ECGFG. Conclusion In zebrafish models of NAFLD and ALD, ECGFG can alleviate lipid accumulation and inflammatory response and lower the expression level of CAV1 to restore iron homeostasis and suppress lipid peroxidation and ferroptosis in the liver.

Graphical abstract

关键词

脂肪性肝病 / 化橘红 / 配方颗粒 / 斑马鱼 / 铁死亡

Key words

fatty liver disease / Exocarpium Citri Grandis / formula granules / zebrafish / iron homeostasis

化橘红为芸香科植物化州柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮^［1］。化橘红的临床应用历史悠久，具有化痰理气、抗炎、抗氧化的功效^［2］。脂肪性肝病（FLD）是由多种病因引起的肝脏脂质代谢紊乱及动态平衡失调，以致肝细胞内脂质蓄积、肝细胞脂肪变性，从而产生的一系列临床病理综合征，主要包括酒精性脂肪性肝病（AFLD）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）^［3］。中医虽无FLD的病名，但基于其症状和病因病机分析，NAFLD在中医一般归于“痰证”、“痰浊”、“肥气”等范畴^［4］，而AFLD与“酒病”、“酒癖”等疾病相对应，是痰饮水湿、气滞血瘀与酒热之毒互结的结果^［5］，近年来，基于“从痰论治”的治疗策略已被应用于FLD治疗，化橘红作为化痰要药，与FLD的病理机制不谋而合，在临床上常被用于FLD的治疗，且实验研究已证明其降脂^［6］、解酒^［7］的作用，并通过减轻脂质积累和铁代谢紊乱来缓解 NAFLD 恶化^［7］。

中药配方颗粒不仅保持了传统饮片煎剂的组方灵活、加减随机等优势，更有携带方便、剂型稳定、易于保存、稳定可控，安全有效的优点^［9］。目前化橘红配方颗粒的制作工艺已成熟，化橘红配方颗粒与化橘红饮片汤剂的共有药效组分相似，主要成分含量相当^［10］，相较于传统饮片，化橘红配方颗粒性质更稳定、吸湿性小且便于控制剂量，服用简单且易于贮藏，因而在临床上广泛使用。但化橘红配方颗粒的降脂作用和治疗FLD的药效验证研究仍是空缺。因此，本文将通过构建斑马鱼非酒精性脂肪肝模型和酒精性脂肪肝模型，评估化橘红配方颗粒治疗FLD的药效，并探究其具体机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

斑马鱼亲本为同批次野生型AB系的雄、雌性斑马鱼和肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼［Tg （ lFabp10α：egfp）］的雄、雌性斑马鱼（国家斑马鱼资源中心），饲养在南方医科大学中医药学院人类疾病斑马鱼模型与药物筛选实验室。在28 ℃下保持14 h/10 h光照时间，养殖水pH值7.0~8.0，导电率450~500 μs/cm。每天早晚饲喂孵化好的丰年虾各1次。所有斑马鱼实验程序均已获得南方医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（伦理批号：L2020044）。

1.1.2 主要试剂与仪器

化橘红配方颗粒（广东一方制药有限公司），硫代乙酰胺（Sigma），4%多聚甲醛（科晶），三卡因、1，2-丙二醇、0.5%油红O（Sigma），丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（索莱宝），活性氧检测试剂盒（碧云天），普鲁士蓝染色试剂盒（DAB增强法）（雷根生物），Caveolin-1 Polyclonal antibody（Proteintech），PCR引物（擎科生物），Trizol Reagent（Ambion），Evo M-MLV反转录预混型试剂盒（含去除gDNA试剂，用于RT-PCR）Ver.2（AG艾科瑞生物），RT-PCR SYBR Master Mix （low rox plus）试剂盒（翌圣生物科技）。

集中式斑马鱼养殖系统（北京爱生公司净水系统），养殖水由反渗透净水机制备。DS-11+ Spectrophotometer分光光度计（DeNovix丹诺尔公司）、体视显微镜（奥林巴斯）、Eclipse Ni-U光学显微镜（Nikon）、数字切片扫描仪（江丰生物）、实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 配鱼与鱼卵收集

将亲本AB系的雄、雌性斑马鱼和肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼［Tg （lFabp10α：egfp）］的雄、雌性斑马鱼按雌∶雄=2∶3的比例放置于底部带有筛孔隔离板的鱼缸中，待产卵后将鱼卵收集于培养皿，加入孵化液（0.8 mg/L亚甲基蓝），去除未受精卵及其余杂物，转移至28 ℃恒温培养箱中孵育，每日更换孵化液，除死卵和卵膜，观察幼鱼发育情况。

1.2.2 化橘红配方颗粒供试品制备

将化橘红配方颗粒加入纯净水进行溶解，配成浓度为0.1 g/mL的化橘红配方颗粒溶液供试品。

1.2.3 斑马鱼急性毒性实验

将亲本斑马鱼按雌∶雄=2∶3的比例放置于底部带有筛孔隔离板的鱼缸中，待产卵后将鱼卵收集于24孔，随机分配为14组，40条/组，设置1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL及1、2、4、8 mg/mL的浓度组，观察96 h，统计生存率，于给药后96 h观察斑马鱼的发育状况和心率。

1.2.4 造模及给药方法

斑马鱼幼鱼非酒精性脂肪肝模型：将受精后3 d的斑马鱼幼鱼（3 dpf）随机分为8组：对照组（在孵化液饲养）、模型组［0.4 mg/mL硫代乙酰胺（TAA）处理］、化橘红配方颗粒低、中、高浓度组（16、32、64 μg/mL），置于6孔板中，分别按组处理72 h。

斑马鱼幼鱼酒精性脂肪肝模型：将受精后3 d的斑马鱼幼鱼（3 dpf）随机分为8组：对照组（在孵化液饲养）、模型组（2%乙醇）、化橘红配方颗粒低、中、高浓度组（16、32、64 μg/mL），置于6孔板中，分别按组处理72 h。

1.2.5 HE染色观察斑马鱼幼鱼肝脏病理情况

造模后，将斑马鱼幼鱼收集于1.5 mL EP管中，用4%甲醛固定24 h，将固定好的斑马鱼幼鱼样本进行乙醇梯度浓度的脱水。脱水结束后，用二甲苯除去乙醇，浸蜡并包埋在石蜡块中。在切片机上将石蜡块切成4 μm厚的石蜡薄片，收集在载玻片上，对制好的石蜡切片进行脱蜡、再水化、HE染色、脱水、中性树胶封片后晾干，用数字切片扫描仪进行扫描。

1.2.6 全鱼油红染色

造模后，将斑马鱼幼鱼收集于1.5 mL EP管中，用4%甲醛固定24 h，固定结束后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤3次，5 min/次，分别用20%、40%、80%、100%的1，2-丙二醇渗透15 min。用0.5%油红O在黑暗状态下，65 ℃温度条件中染色1 h，染色完成后用100% 1，2-丙二醇中洗脱多余染色液至幼鱼尾巴无色透明，并用80%、40%、20%的1，2-丙二醇梯度复水5 min，保存于75%丙三醇中，用体视显微镜观察幼鱼鱼肝脂滴情况。

1.2.7 普鲁士蓝染色

斑马鱼幼鱼石蜡切片用二甲苯脱蜡，用80%、95%、100%乙醇梯度复水，按照普鲁士蓝染色试剂盒（DAB增强法）说明书进行染色，最后用中性树胶密封。用数字切片扫描仪进行扫描。

1.2.8 斑马鱼幼鱼活性氧（ROS）含量测定

野生型AB系斑马鱼幼鱼造模后，将其收集于24孔板管中，用10 μmol/L DCFH-DA探针溶液在28 ℃、黑暗中孵育30 min，用养鱼水洗净残余探针，将斑马鱼幼虫置于琼脂糖平板上，用0.2%三卡因麻醉，用体视显微镜观察幼鱼体内ROS水平

1.2.9 斑马鱼幼鱼脂质过氧化水平测定

将斑马鱼幼鱼收集于1.5 mL EP管中，养鱼水清洗2次后用吸管吸干水，加入丙二醛（MDA）含量检测试剂盒中的提取液，匀浆后8000 g，4 ℃离心10 min，取上清，根据试剂盒说明书进行操作。

1.2.10 RT-PCR

造模后，将斑马鱼幼鱼收集于2 mL研磨管中，根据RNA提取试剂盒说明书（Ambion™）提取总RNA。根据 Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒（含去除gDNA试剂，用于RT-PCR）Ver.2的说明书进行逆转录。根据TB RT-PCR SYBR Master Mix（low rox plus）说明书进行RT-PCR，检测脂质代谢相关基因的表达，包括脂肪酸合成酶（FASN）、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A （HMG-CoA） 还原酶（ HMGCRA）、载脂蛋白A1（Apoa1）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）；检测炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素6（IL-6）的表达；检测铁代谢相关的基因表达，包括转铁蛋白（Tf）、转铁蛋白受体蛋白（TfR）、铁泵蛋白（FPN）、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）。基因引物由擎科生物合成，引物序列见表1，以β-肌动蛋白基因为内参基因，CT值计算公式为：2^-ΔΔCt。

1.2.11 免疫组化检测

斑马鱼幼鱼石蜡切片用二甲苯脱蜡，用80%、95%、100%乙醇梯度复水，用柠檬酸钠煮沸10 min进行抗原修复，冷却至室温。用3% H₂O₂ 封闭15 min，用PBS洗涤3次，5 min/次。用封闭缓冲液（5%山羊血清和0.1% Triton-X PBS溶液）密封2 h后，将切片与CAV1一抗兔在4 ℃下孵育过夜。第2天用PBS洗涤石蜡切片3次，在室温下与山羊抗兔抗体孵育2 h。用PBS洗涤切片，在显微镜下进行DAB染色，用冰水终止。自来水冲洗1 min，用苏木精染细胞核，脱水，最后用中性树胶密封。用数字切片扫描仪进行扫描。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism Version 9.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析、Tukey多重比较检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化橘红配方颗粒的斑马鱼急性毒性实验结果

浓度16~64 μg/mL的化橘红配方颗粒在96 h内均未对斑马鱼的生长发育和心率造成影响（图1），死亡率和致畸率均为0%。因此，选择16、32、64 μg/mL作为后续实验浓度。

2.2 化橘红配方颗粒治疗非酒精性脂肪肝的药效评价

HE染色结果显示，经0.4 mg/mL TAA处理后，斑马鱼幼鱼肝脏呈明显脂质累积和气球样变，与模型组相比，低、中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善TAA诱导的脂质沉积，其中以64 μg/mL化橘红配方颗粒更为明显（图2A）。

斑马鱼全鱼油红染色结果与HE染色结果一致，经0.4 mg/mL TAA处理后，斑马鱼幼鱼肝脏部位脂质沉积明显，而中、高浓度的化橘红配方颗粒可有效改善斑马鱼幼鱼肝脏的脂质沉积（图2B）。

RT-PCR结果显示，经0.4 mg/mL TAA处理后，脂质代谢相关的FASN、SREBP1、HMGCRA、Apoa1的表达水平升高（P<0.05），而PPARα的表达水平降低，炎症相关的TNFα和IL-6表达升高（P<0.05），中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善TAA诱导的脂质代谢紊乱和肝脏炎症（图2C）。

2.3 化橘红配方颗粒治疗酒精性脂肪肝的药效评价

HE结果显示，经2%乙醇处理后，斑马鱼幼鱼肝脏呈明显脂质累积和气球样变，与模型组相比，低、中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善TAA诱导的脂质沉积，其中以64 μg/mL化橘红配方颗粒更为明显（图3A）。

斑马鱼全鱼油红染色结果与HE结果一致，经2%乙醇处理后，斑马鱼幼鱼出现明显的心包水肿、肝脏部位脂质沉积明显，而中、高浓度的化橘红配方颗粒可有效改善斑马鱼的心包水肿和脂质沉积（图3B）。

RT-PCR结果显示，经2%乙醇处理后，脂质代谢相关的FASN、SREBP1、HMGCRA的表达水平升高（P<0.05），而Apoa1和PPARα的表达水平降低（P<0.05），炎症相关的TNFα和IL-6表达升高，中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善TAA诱导的基因表达（图3C）。

2.4 化橘红配方颗粒对非酒精性脂肪肝铁代谢和铁死亡的作用评估

经0.4 mg/mL TAA处理后，斑马鱼幼鱼肝脏出现气泡样改变和棕色沉积，给予化橘红配方颗粒后，各组斑马鱼幼鱼肝脏棕色沉积改善（图4A）。

采用DCFH-DA探针检测斑马鱼幼鱼NAFLD模型体内ROS的表达，结果显示，经0.4 mg/mL TAA处理后，斑马鱼幼鱼体内ROS含量升高，低、中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善斑马鱼幼鱼体内ROS生成（图4B）。检测斑马鱼幼鱼体内的MDA含量显示，与对照组相比，模型组的0.4 mg/mL TAA暴露导致斑马鱼幼鱼MDA含量上升，低、中、高剂量的化橘红配方颗粒均能减少斑马鱼幼鱼的MDA含量（P<0.05，图4C）。

RT-PCR结果显示，NAFLD状态下，斑马鱼幼鱼的Tf、TfR、FPN和SLC7A11表达降低，而不同浓度的化橘红配方颗粒可升高这些基因的表达（P<0.05）。模型组GPX4的表达与对照组差异无统计学意义，但整体仍比对照组表达量升高，而中、高浓度的化橘红配方颗粒可升高GPX4的表达（P<0.0001，图4D）。

2.5 化橘红配方颗粒对酒精性脂肪肝铁代谢和铁死亡的作用评估

经2%乙醇处理后，斑马鱼幼鱼肝脏出现浅棕色沉积，给予化橘红配方颗粒后，各组斑马鱼幼鱼肝脏棕色沉积改善（图5A）。采用DCFH-DA探针检测斑马鱼幼鱼ALD模型体内ROS的表达（图5B），结果显示，经2%乙醇处理后，斑马鱼幼鱼体内ROS含量升高，低、中、高浓度的化橘红配方颗粒均不同程度改善斑马鱼幼鱼体内ROS生成。检测斑马鱼幼鱼体内的MDA含量显示（图5C），2%乙醇处理会导致斑马鱼幼鱼体内MDA的含量升高，低、中、高剂量的化橘红配方颗粒均能减少MDA含量（P<0.001）。检测ALD状态下铁代谢的相关基因表达结果显示（图5D），ALD状态下，斑马鱼幼鱼的Tf、TfR和FPN表达升高，而不同浓度的化橘红配方颗粒可降低这些基因的表达（P<0.001）。化橘红配方颗粒对ALD状态下SLC7A11的表达无明显影响（P>0.05），且模型组GPX4的表达与对照组差异无统计学意义，但整体仍比对照组表达量升高，而高浓度的化橘红配方颗粒可升高GPX4的表达（P<0.0001）。

2.6 化橘红配方颗粒可能通过CAV1调控肝铁代谢及铁死亡

NAFLD和ALD状态下，斑马鱼幼鱼肝脏的CAV1升高，而化橘红配方颗粒的中、高浓度可明显改善评价两种脂肪肝状态下斑马鱼幼鱼肝脏的CAV1表达（图6A、C）。RT-PCR结果也显示化橘红配方颗粒可抑制FLD状态下斑马鱼幼鱼的CAV1表达（P<0.0001，图6B、D）。

3 讨论

脂肪性肝病已成为我国最主要的慢性肝病之一，全国名中医张小萍教授认为NAFLD辨证应从“痰、食、湿、瘀”入手^［11］，国医大师田德禄教授认为，气血痰湿结聚成癖是ALD中期病机，调肝理气、化痰消瘀是治疗关键^［12］，可见“痰”是两种脂肪性肝病的主要病机，从痰论治是脂肪性肝病的临床经验治法。化橘红作为治痰要药，含有多糖、黄酮、香豆素、挥发油等成分，具有显著的化痰止咳，抗炎、抗氧化、免疫调节^［13］、调节血脂^［14］、解酒^［15］等作用，临床常用于FLD 治疗。

现代药理学研究证明，化橘红饮片、标准汤剂与配方颗粒的化学成分基本一致，三者质量具有良好的正相关性^［16］，化橘红配方颗粒主要成分柚皮苷和野漆树苷的含量与化橘红饮片均相当，化橘红配方颗粒与化橘红饮片止咳祛痰作用效果相当^［22］。但目前未见化橘红配方颗粒的降脂效果研究、治疗FLD药效验证及具体机制研究，因此本研究着眼于这一关键问题，通过构建斑马鱼幼鱼NAFLD和ALD模型，以探明化橘红配方颗粒治疗FLD药效验证及具体机制。实验结果表明，化橘红配方颗粒具有改善肝脏脂肪沉积、抗炎的作用。

铁是维持人类生命的最重要的金属之一^［17］ ，膳食铁被肠细胞中的二价金属转运蛋白 1 （DMT1）吸收，并通过铁转运蛋白（FPN）转运到门静脉血中，与转铁蛋白结合，通过转铁蛋白受体1（TfR1）被肝细胞、巨噬细胞和骨髓细胞吸收^［18］。肝脏在铁代谢中起着核心作用，表达一系列复杂的分子参与铁的运输和铁稳态的调节，如TfR、FPN等^［19］。铁代谢失衡与各种疾病有关，临床研究显示约1/3的NAFLD患者表现出铁稳态失衡^［20］。NAFLD的进展与“平行多重打击”有关，包括氧化应激诱导和铁超载^［21］，为探明化橘红配方颗粒对非酒精性脂肪肝的治疗作用，本实验重点探讨化橘红配方颗粒对斑马鱼幼鱼NAFLD状态下铁离子代谢的影响和可能存在的作用机制。普鲁士蓝染色方法证实，NAFLD状态下斑马鱼幼鱼肝脏存在铁沉积，Tf、TfR、FPN表达降低，而化橘红配方颗粒可降低肝脏铁离子的含量，升高Tf、TfR、FPN表达，表明化橘红配方颗粒可以通过调控相关铁代谢基因以纠正铁稳态失衡起对NAFLD的治疗作用。有研究表明，NAFLD 的风险与的血清转铁蛋白水平呈负相关，转铁蛋白每增加20（0.65 g/L），NAFLD 风险降低 0.65%^［28］。美国一项关于血清铁状况与MAFLD之间的全国性横断面研究表明，较低的转铁蛋白饱和度（TSAT）与较高的MAFLD患病率相关（OR=0.981）^［23］。虽然在小鼠高脂饮食诱导的NAFLD模型下，Fpn1水平的表达水平下降，而Tf、TfR的表达升高，化橘红饮片治疗后可降低Tf、TfR的表达，并升高Fpn1的表达水平^［24］，与本文结果不符，但考虑临床研究结果、斑马鱼与小鼠的物种差异性以及相关造模剂的不同，后续将选用相应的基因调控小鼠和细胞进一步探讨，以明确化橘红颗粒对NAFLD状态下Tf、TfR、FPN等铁代谢相关基因的表达。

有研究证实酒精性肝病通常表现出肝铁水平高，在肝脏的实质和非实质细胞中均可观察到铁沉积，伴随着TfR等蛋白升高，且过量的铁和酒精的结合会增强氧化应激并加重酒精性肝病的病理学^［25］，因此，为进一步揭示化橘红配方颗粒对酒精性脂肪肝的治疗作用，本实验重点探讨了化橘红对斑马鱼幼鱼铁离子代谢的影响和可能存在的作用机制。普鲁士蓝染色方法证实，酒精暴露会导致斑马鱼幼鱼肝脏铁沉积，并使铁代谢相关的基因Tf、TfR和FPN表达升高。这与Li等^［26］总结的酒精性肝病中铁超负荷状态下相关基因表达趋势相符。化橘红配方颗粒可降低肝脏铁离子的含量，并降低Tf、TfR和FPN表达，表明化橘红配方颗粒可以通过调控相关铁代谢基因纠正铁稳态失衡起对酒精性脂肪肝的治疗作用。

铁稳态失衡、铁摄取增加和铁储存减少可导致铁过载，而铁过载介导的芬顿反应和酶氧合引起脂质过氧化和毒性ROS累积可诱导铁死亡，研究表明铁死亡在FLD的发病机制中起重要作用^［27］，系统X_c^-介导的胱氨酸摄取及GSH产生和GPX4激活在保护细胞免受铁死亡中起核心作用，由SLC3A2和SLC7A11二聚体组成，嵌于细胞膜表面，而SLC7A11（xCT）是其发挥功能的主要亚基^［28］，也是铁死亡的关键调节蛋白，其下调可通过抑制半胱氨酸代谢通路，导致细胞内胱氨酸水平降低和谷胱甘肽（GSH）生物合成耗竭，间接抑制GPX4的活性，进而导致脂质过氧化物堆积，最终诱导细胞发生铁死亡^［29］。GPX4是一种关键的抗氧化剂过氧化物酶，在解毒脂质过氧化物方面起独特作用^［30］，是铁死亡的中枢抑制剂，可增加细胞在铁损伤过程中的抗氧化能力，抑制脂质ROS积累^［31］，其活性取决于胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白SLC7A11活化产生的谷胱甘肽^［32］。SLC7A11/ GPX4 轴主要参与胱氨酸摄入和GSH合成过程，该轴功能障碍可抑制胱氨酸摄入和GSH合成，从而导致脂质过氧化，进而导致铁死亡。GPX4被抑制可显著增强脂质积累，从而促进肝脂肪变性进展，SLC7A11对NAFLD相关调节通常依赖于GPX4^［33］。ALD状态下，蛋氨酸循环和转硫途径的失调，导致严重的GSH耗竭和GPX4的间接失活，但xCT的表达无显著变化^［34］。基于前人对NAFLD和ALD状态下SLC7A11/ GPX4 轴的研究，我们发现化橘红配方颗粒可提高NAFLD状态下斑马鱼幼鱼的SLC7A11和GPX4的表达，并降低斑马鱼幼鱼体内的MAD和ROS含量，虽然化橘红配方颗粒对ALD状态下斑马鱼幼鱼的SLC7A11表达无影响，但同样可通过提高GPX4的表达、降低斑马鱼幼鱼体内的MAD和ROS含量起解毒抗氧化的作用。以上结果表明，化橘红配方颗粒可通过抗氧化起治疗FLD的作用。

CAV1是胞膜窖的主要结构成分和标志性结构蛋白，调节多种分子途径，包括肝脂质积累^［35］、葡萄糖代谢和胰岛素抵抗^［36］、线粒体生物学^［37］和肝细胞再生^［38］等。Cav-1是肝功能的调节剂，对维持肝脏脂质稳态具有重要作用^［39］，研究表明，酗酒和慢性酒精中毒导致的脂肪肝病理情况下，肝脏CAV1表达升高^［40］，研究发现CAV1可增加Fpn的转录，增强了铁去除，进而抑制了成骨细胞中的铁死亡^［41］。有研究发现xCT（SLC7A11和SLC3A2）、GPX4表达水平的下调会导致铁过载和铁死亡，而铁死亡可通过提高CAV-1及相关蛋白导致纤维化^［42］。研究发现Xc^-系统中的SLC7A11可能作为CAV1调节的铁死亡的中间因子， CAV1表达与SLC7A11表达呈负相关^［43］。本课题组前期研究证明，Cav-1通过激活NAFLD中的铁蛋白轻链/重链通路来增强肝细胞的铁储存能力，是调节铁和脂质代谢稳态的重要靶蛋白^［14］，阐明Cav-1通过调节刀豆素（ConA）诱导的急性肝损伤中的xCT/GPX4轴来抑制INOS表达和RNS积累，在ConA诱导的肝细胞铁死亡方面发挥关键作用^［44］，且过表达Cav-1可诱导肝星状细胞铁死亡^［45］。基于上述研究，本实验重点探讨化橘红配方颗粒对肝铁稳态和铁死亡及CAV1的影响。我们采用免疫组织化学染色和RT-PCR证实NAFLD和ALD的状态下，斑马鱼幼鱼肝脏CAV1表达升高，而低、中、高浓度的化橘红配方颗粒均可降低CAV1的表达。根据前期研究基础及实验结果，TAA^［46］和乙醇^{［47， 48］}诱导肝脏ROS累积、脂质过氧化及肝铁沉积，促进铁死亡发生，CAV1应激性升高。但化橘红配方颗粒的治疗以及SLC7A11/GPX4系统对铁死亡的迅速响应，使CAV1所代表的保护机制并未得到充分激活或发挥，反而CAV1随着FLD的损伤表达升高，而化橘红配方颗粒可以减轻FLD，故在药物干预下出现CAV1表达下降的趋势。

综上所述，本研究证实化橘红配方颗粒可以改善NAFLD和ALD的脂代谢紊乱和炎症反应，可能通过CAV1调控FLD状态下的铁稳态失衡，并通过xCT/GPX4轴来抑制铁死亡起治疗FLD的作用，为临床应用化橘红配方颗粒治疗FLD提供新的实验证据。然而，化橘红配方颗粒成分众多，可多靶点、多层次治疗FLD，因此本研究仍存在一些局限性，其对CAV1和铁代谢相关基因调控仍需相应的基因调控小鼠和细胞来进一步探讨，后续将进一步明确化橘红配方颗粒及其活性成分干预FLD的具体作用机制。

参考文献

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典-一部: 2020年版[M]. 北京: 中国 医药科技出版社, 2020.

[2] 范会云, 邓乔华, 宋松泉. “一片值千金”: 化橘红[J]. 生命世界, 2020(9): 40-1.

[3] Musso G, Bo S, Cassader M, et al. Impact of sterol regulatory element-binding factor-1c polymorphism on incidence of nonalcoholic fatty liver disease and on the severity of liver disease and of glucose and lipid dysmetabolism[J]. Am J Clin Nutr, 2013, 98(4): 895-906.

[4] 中华中医药学会脾胃病分会, 张 莉, 季 光, 等. 非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识(2023)[J]. 中国中西医结合消化杂志, 2024, 10(1): 1-7.

[5] 毕占阳, 杨 柱, 郭 斌, 等. 基于酒伤理论探讨酒精性肝病的中医治疗[J]. 云南中医中药杂志, 2022, 43(5): 16-9.

[6] 李锦坤, 金刚亮, 王艳慧, 等. 化橘红提取物的制备工艺优化及其降脂作用[J/OL]. 现代食品 科技, 2024,06. 10.13982/j.mfst.1673-9078.2024.10.0892

[7] 吴道顺, 王梦晨, 张雪涟, 等. 化橘红水提物对酒精诱导的急性肝损伤保护作用[J]. 中国实验方剂学杂志, 2022, 28(19): 42-8.

[8] Deng GH, Liu C, Zhao JM, et al. Exocarpium Citri Grandis alleviates the aggravation of NAFLD by mitigating lipid accumulation and iron metabolism disorders[J]. J Ethnopharmacol, 2023, 313: 116559.

[9] 吴雄志, 卞兆祥, 陈新宇, 等. 中药配方颗粒临床应用国际专家共识[J]. TMR经典中医研究, 2021, 7(1): 19-26.

[10] 谭婉清, 王术玲, 刘潇潇, 等. 化橘红配方颗粒与饮片汤剂的化学等量性和药效等效性研究[J]. 中药新药与临床药理, 2023, 34(4): 541-9.

[11] 米永佳, 王茂泓, 李龙华, 等. 全国名中医张小萍教授治疗非酒精性脂肪肝经验[J]. 中国民族民间医药, 2024, 33(12): 80-3.

[12] 方俐晖, 郭志玲, 张轶斐, 等. 田德禄教授三期三脏辨治酒精性肝病经验[J]. 现代中医临床, 2021, 28(5): 38-42.

[13] 王艳慧. 化橘红的研究进展[J]. 世界科学技术-中医药现代化, 2017, 19(6): 1076-82.

[14] 苏志鹏. 化橘红活性成分的综合利用及对降血糖血脂活性的研究[D]. 广州: 广东药科大学, 2019.

[15] 吴 祎. 化橘红解酒功效与保健食品的研究[D]. 广州: 广州中医药大学, 2014.

[16] 黄凯伟, 任应宗, 张 辉, 等. 化橘红(柚)饮片、标准汤剂和配方颗粒相关性研究[J]. 中国药业, 2023, 32(17): 57-62.

[17] Silva B, Faustino P. An overview of molecular basis of iron metabolism regulation and the associated pathologies[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(7): 1347-59.

[18] Vogt AC S, Arsiwala T, Mohsen M, et al. On iron metabolism and its regulation[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(9): 4591.

[19] Graham RM, Chua AC, Herbison CE, et al. Liver iron transport[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(35): 4725-36.

[20] Aigner E, Weiss G, Datz C. Dysregulation of iron and copper homeostasis in nonalcoholic fatty liver[J]. World J Hepatol, 2015, 7(2): 177-88.

[21] Bessone F, Razori MV, Roma MG. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression[J]. Cell Mol Life Sci, 2019, 76(1): 99-128.

[22] Sun KX, Zhao JV, Nelson EAS, et al. Iron status and non-alcoholic fatty liver disease: a Mendelian randomization study[J]. Nutrition, 2024, 118: 112295.

[23] Yu GF, Liu L, Qin T, et al. Associations of serum iron status with MAFLD and liver fibrosis in the USA: a nationwide cross-section study[J]. Biol Trace Elem Res, 2024, 202(1): 87-98.

[24] Deng GH, Liu C, Zhao JM, et al. Exocarpium Citri Grandis alleviatesthe aggravation of NAFLD by mitigating lipid accumulation and iron metabolism disorders[J]. J Ethnopharmacol, 2023, 313: 116559.

[25] Ali N, Ferrao K, Mehta KJ. Liver iron loading in alcohol-associated liver disease[J]. Am J Pathol, 2023, 193(10): 1427-39.

[26] Li LX, Guo FF, Liu H, et al. Iron overload in alcoholic liver disease:mechanismsunderlying,effectsdetrimental, and therapeuticpotential targets[J]. Cell Mol Life Sci, 2022, 79(4): 201.

[27] Chen JY, Li XP, Ge CD, et al. The multifaceted role of ferroptosis in liver disease[J]. Cell Death Differ, 2022, 29(3): 467-80.

[28] Chen X, Li J, Kang R, et al. Ferroptosis: machinery and regulation[J]. Autophagy, 2021, 17(9): 2054-81.

[29] Koppula P, Zhuang L, Gan BY. Cystine transporter SLC7A11/xCT in cancer: ferroptosis, nutrient dependency, and cancer therapy[J]. Protein Cell, 2021, 12(8): 599-620.

[30] Xie YC, Kang R, Klionsky DJ, et al. GPX4 in cell death, autophagy, and disease[J]. Autophagy, 2023, 19(10): 2621-38.

[31] Stockwell BR. Ferroptosis turns 10: emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications[J]. Cell, 2022, 185(14): 2401-21.

[32] Chen X, Li JB, Kang R, et al. Ferroptosis: machinery and regulation[J]. Autophagy, 2021, 17(9): 2054-81.

[33] Sui YT, Geng X, Wang ZW, et al. Targeting the regulation of iron homeostasis as a potential therapeutic strategy for nonalcoholic fatty liver disease[J]. Metabolism, 2024, 157: 155953.

[34] Luo J, Song G, Chen NN, et al. Ferroptosis contributes to ethanol-induced hepatic cell death via labile iron accumulation and GPx4 inactivation[J]. Cell Death Discov, 2023, 9(1): 311.

[35] Fernández-Rojo MA, Gongora M, Fitzsimmons RL, et al. Caveolin-1 is necessary for hepatic oxidative lipid metabolism: evidence for crosstalk between caveolin-1 and bile acid signaling[J]. Cell Rep, 2013, 4(2): 238-47.

[36] Haddad D, Al Madhoun A, Nizam R, et al. Role of caveolin-1 in diabetes and its complications[J]. Oxid Med Cell Longev, 2020, 2020: 9761539.

[37] Jiang Y, Krantz S, Qin X, et al. Caveolin-1 controls mitochondrial damage and ROS production by regulating fission - fusion dynamics and mitophagy[J]. Redox Biol, 2022, 52: 102304.

[38] Fernández MA, Albor C, Ingelmo-Torres M, et al. Caveolin-1 is essential for liver regeneration[J]. Science, 2006, 313(5793): 1628-32.

[39] Fernandez-Rojo MA, Ramm GA. Caveolin-1 function in liver physiology and disease[J]. Trends Mol Med, 2016, 22(10): 889-904.

[40] Gao L, Zhou YC, Zhong WC, et al. Caveolin-1 is essential for protecting against binge drinking-induced liver damage through inhibiting reactive nitrogen species[J]. Hepatology, 2014, 60(2): 687-99.

[41] Tao L, Wang JP, Wang K, et al. Exerkine FNDC5/irisin-enriched exosomes promote proliferation and inhibit ferroptosis of osteoblasts through interaction with Caveolin-1[J]. Aging Cell, 2024, 23(8): e14181.

[42] Zhang T, Yang F, Dai XY, et al. Role of Caveolin-1 on the molybdenum and cadmium exposure induces pulmonary ferroptosis and fibrosis in the sheep[J]. Environ Pollut, 2023, 334: 122207.

[43] Liu WH, Luo GH. CAV1 inhibits Xc (-) system through IFNGR1 to promote ferroptosis to inhibit stemness and improves anti-PD-1 efficacy in breast cancer[J]. Transl Oncol, 2024, 50: 102149.

[44] Deng GH, Li YJ, Ma SY, et al. Caveolin-1 dictates ferroptosis in the execution of acute immune-mediated hepatic damage by attenuating nitrogen stress[J]. Free Radic Biol Med, 2020, 148: 151-61.

[45] Huang S, Wang YH, Xie SW, et al. Isoliquiritigenin alleviates liver fibrosis through caveolin-1-mediated hepatic stellate cells ferroptosis in zebrafish and mice[J]. Phytomedicine, 2022, 101: 154117.

[46] Amali AA, Rekha RD, Lin CJ, et al. Thioacetamide induced liver damage in zebrafish embryo as a disease model for steatohepatitis[J]. J Biomed Sci, 2006, 13(2): 225-32.

[47] Tacke F. Cenicriviroc for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis and liver fibrosis[J]. Expert Opin Investig Drugs, 2018, 27(3): 301-11.

[48] Bautista AP. Neutrophilic infiltration in alcoholic hepatitis[J]. Alcohol, 2002, 27(1): 17-21.

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