芪黄健脾滋肾颗粒可改善小鼠系统性红斑狼疮血小板减少：基于Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路介导的自噬

Qihuang Jianpi Zishen Granules improves thrombocytopenia in mice with systemic lupus erythematosus by suppressing platelet autophagy via the Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR signaling pathway

摘要

目的 基于Ca²⁺/CaMMK2/AMPK/mTOR信号通路介导的自噬探讨芪黄健脾滋肾颗粒（QJZG）对小鼠系统性红斑狼疮血小板减少的影响。 方法 将24只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为模型组、QJZG组、醋酸泼尼松（Pred）组、CaMKK2激活剂组，6只/组；另将6只C57BL/6小鼠设为正常对照（Control）组。Control组、模型组：予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃；QJZG组：芪黄健脾滋肾颗粒+生理盐水配成0.39 g/mL溶液灌胃，剂量3.9 g/（kg·d）；Pred组：予小鼠醋酸泼尼松片加生理盐水配成0.273 mg/mL的溶液灌胃，剂量2.73 mg/（kg·d）；激活剂组：予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，另将小鼠腹腔注射CaMKK2激活剂，5 mg/kg，2次/周。检测血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板体积（MPV）；ELISA法检测血清血小板生成素（TPO）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）水平；流式细胞术检测钙离子荧光强度；Real-time PCR法检测血小板CaMKK2、AMPK2α、mTOR、Beclin1、p62 mRNA表达水平；Western blotting检测血小板CaMKK2、p-CaMKK2、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、P62蛋白表达水平。 结果 与Control组相比，模型组PLT、PCT、IL-10、mTOR、p62 mRNA、p-mTOR、P62水平降低（P<0.01），PDW、MPV、TPO、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CaMKK2、AMPK 、Bcl-1 mRNA、p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量升高（P<0.01）。与模型组比较，QJZG组及Pred组PLT、IL-10、mTOR、p62 mRNA、p-mTOR、P62水平升高（P<0.01），MPV、TPO、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CaMKK2、AMPK、Bcl-1 mRNA、p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量降低（P<0.05）；CaMKK2激活剂组PLT、PCT、IL-10、mTOR、p62 mRNA、p-mTOR、P62水平降低（P<0.01），PDW、MPV、IL-6、TNF-α、IFN-γ、CaMKK2、AMPK、Bcl-1 mRNA、p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量升高（P<0.01）。 结论 QJZG可通过减轻炎症及影响Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路抑制血小板自噬改善系统性红斑狼疮血小板减少。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Qihuang Jianpi Zishen Granules (QJZG) for improving thrombocytopenia in a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE). Methods Twenty-four MRL/lpr lupus mice were randomized equally into 4 groups for treatment with daily gavage of saline, QJZG or prednisone (Pred) or intraperitoneal injection (twice a week) of CaMKK2 activator, with 6 C57BL/6 mice with saline gavage as the control group. After 8 weeks of treatment, the mice were examined for PLT, PCT, PDW, MPV, serum levels of TPO, IL-6, IL-10, TNF-α and IFN-γ, and calcium ion fluorescence intensity using ELISA or flow-through assay. RT-qPCR was used to detect platelet CaMKK2, AMPK2α, mTOR, Beclin1 and p62 mRNA expression levels, and the protein expressions of CaMKK2, p-CaMKK2, AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, LC3, Beclin1 and p62 were detected using Western blotting. Results The saline-treated MRL/lpr lupus mice showed significantly lowered levels of PLT, PCT, IL-10, mTOR, p62 mRNA, p-mTOR and P62 with increased PDW, MPV, serum TPO, IL-6, TNF-α and IFN-γ levels, and platelet expressions of CaMKK2, AMPK, Bcl-1 mRNA, p-CaMKK2, p-AMPK, LC3II and Beclin1. These abnormalities were significantly improved in QJZG group and Pred group but worsened after treatment with the CaMKK2 activator. Conclusion QJZG can ameliorate thrombocytopenia in mouse models of SLE by reducing inflammation and inhibiting platelet autophagy via regulating the Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

芪黄健脾滋肾颗粒 / 系统性红斑狼疮 / 血小板自噬 / Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路

Key words

Qihuang Jianpi Zishhen Granules / systemic lupus erythematosus / platelet autophagy / Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR signaling pathway

系统性红斑狼疮（SLE）是以免疫炎症为主的多系统参与的自身免疫性疾病，受遗传、免疫、内分泌和环境等因素影响，通过多种机制造成多个系统损伤，尤其血液系统损害^［1］。有研究显示，20%~40%的SLE患者出现血小板减少症（<100×10⁹/L），甚至是16%SLE患者的首发表现，这对SLE患者的预后有严重影响，具有更高的死亡率和多器官损伤风险^{［2， 3］}。SLE病因和发病机制十分复杂，目前关于SLE血小板减少的具体机制尚未清楚，亟需寻找新的治疗靶点与方法。前期研究发现，芪黄健脾滋肾颗粒（QJZG）能够降低多种炎性细胞因子的含量，改善免疫失衡，发挥治疗SLE血小板减少的作用，是临床治疗SLE血小板减少的经验效方^［4-6］。

多种自身免疫性疾病血小板减少的原因与细胞过度自噬密切相关^［7-9］。研究显示，细胞内钙离子超载后与钙调蛋白激酶激酶2（CAMKK2）结合形成复合物后，激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）和雷帕霉素受体（MTOR）途径促进细胞自噬^{［10， 11］}。然而，QJZG能否能够通过影响此信号通路介导的自噬从而治疗SLE血小板减少尚不清楚，仍需进一步探讨。因此，本研究拟通过动物实验进一步验证QJZG改善SLE血小板减少的具体途径，揭示其治疗作用的可能靶点，为其临床应用推广提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 实验动物

8~9周龄的MRL/lpr狼疮小鼠24只，C57BL/6小鼠6只，均购于上海灵畅生物科技有限公司（动物合格证号：20180003031192；许可证号：SYXK（沪）2018-0003），饲养于SPF级动物房中，所有实验操作均经安徽中医药大学伦理委员会批准（伦理批号：AHUCM-mouse-2022130），并严格遵守《实验动物管理和使用指南》。采用专用的灭菌饲料进行喂养，自由饮水，适应性喂养1周后开始实验。

1.1.2 药物

QJZG（10 g/袋，药物组成：黄芪、盐菟丝子、熟地黄、山药、麸炒白术、茯苓、覆盆子、金樱子，安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，皖药制备字20220041000）；醋酸泼尼松片（5 mg/片，天津天药药业股份有限公司，国药准字H12020689）；钙调磷酸酶激活剂（安徽中抗生物技术有限公司）。

1.1.3 试剂

小鼠血小板生成素（TPO）、小鼠γ干扰素（IFN-γ）、小鼠白介素6（IL-6）、小鼠白介素10（IL-10）、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）（武汉基因美科技有限公司）。HBSS试剂（BIOSS），Fluo 3-AM（DOJINDO）。引物合成（Sangon Biotech）。CaMKK2、Beclin1（abcam），p-CaMKK2、mTOR、p-mTOR、LC3（CST），GAPDH（Zsbio），AMPK、p-AMPK（bioss），P62（proteintech）。

1.1.4 仪器

全自动五分类动物血液细胞分析仪（MINDRAY）、流式细胞仪（BECKMAN）、普通PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）、荧光定量PCR仪（Thermo Scientific）、电泳仪（上海天能科技有限公司）、高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）、透射电镜（日本电子）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药

将24只SPF级雌性MRL/lpr狼疮小鼠随机分为模型组、QJZG组、醋酸泼尼松（Pred）组、CaMKK2激活剂组，6只/组；6只C57BL/6小鼠为正常对照（Control）组。每组小鼠在常规饲养基础上用药，Control组、模型组：予等量生理盐水灌胃（10 mL·kg^-1·d^-1）；QJZG组：QJZG+生理盐水配成0.39 g/mL溶液灌胃，根据人与动物间体表面积折算的等效剂量比值表^［12］折算成小鼠药物剂量为3.9 g/（kg·d）；Pred组：予小鼠醋酸泼尼松片加生理盐水配成0.273 mg/mL的溶液灌胃，剂量为2.73 mg/（kg·d）；激活剂组：予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，另将狼疮小鼠腹腔注射CaMKK2激活剂，5 mg/kg，2次/周。各组连续用药8周。

1.2.2 检测小鼠外周血中血小板参数

结束用药时从小鼠眼眶釆集静脉血，采用全自动五分类动物血液细胞分析仪（MINDRAY，BC-5300Vet）检测血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板体积（MPV）。

1.2.3 ELISA检测

给药结束后，小鼠禁食禁水8 h取血，将全血用2500 r/min离心5 min，取血清，-80 ℃保存，避免反复冻融，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组小鼠血清TPO、IL-6、IL-10、IL-11、TNF-α、IFN-γ水平。

1.2.4 流式细胞术检测血小板内钙离子浓度

小鼠静脉取血，离心得到富含血小板的血浆，继续离心，得到血小板。转载Fluo 3-AM探针，并用无钙HBSS清洗，上流式细胞检测钙离子。

1.2.5 透射电子显微镜观察芪黄健脾滋肾颗粒对血小板超微结构的影响

将1 mm³组织若干块立刻固定到2.5%戊二醛中24 h，把固定液倒入PBS缓冲液6 h，放入1%锇酸后固定2 h。用30%、50%乙醇、70%乙醇醋酸铀（包埋前染色）3 h或过夜，80%、89.5%、100%乙醇两次50 min、环氧丙烷脱水处理。纯环氧树脂包埋后入烤箱，后进行切片，铜网捞片。电子染色后（铅染色）用日本电子透射电镜拍照。

1.2.6 qRT-PCR 检测

小鼠静脉取血，予800 r/min离心10 min，取上清液，得到富含血小板的血浆。选取制备好的血小板悬液，具体步骤如下：取50~100 mg血小板组织用TRIzol法对RNA提取；在RT反应中，EP管中去除基因组 DNA 反应，离心，PCR仪中加热42 ℃ 2 min，再冰浴1 min，EP管中加入反应液（37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s），取出，即cDNA，-80 ℃保存备用；PCR反应在反应体系10 μL中进行，条件如下：95 ℃ 预变性1 min， 变性95 ℃ 20 s， 60 ℃1 min， 共40个循环。结果采用Relative Quantification Study分析，计算方法为2^-△△Ct，包括扩增曲线、溶解曲线和相对表达量。引物由安徽中抗生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.7 Western blotting检测

将各组小鼠摘眼球取血，经离心机分离出血小板悬液，取蛋白样品20 μg进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭。用CaMKK2（1∶2000）、p-CaKK2（1∶1000）、AMPK（1∶2000）、p-AMPK（1∶2000）、mTOR（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1000）、Beclin1（1∶2000）、p62（1∶1000）、GAPDH（1∶2000）一抗，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，二抗（1∶20000），室温孵育1.2 h，PBST洗膜3次，HRP化学发光底物曝光，使用ECL发光试剂盒来检测蛋白，全自动化学发光成像分析系统显影成像，拍照，保存图像。采用Image J图像分析软件统计分析条带蛋白灰度值。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0软件进行数据分析， GraphPad Prism和ImageJ软件处理图像，利用软件FlowJo_V10分析流式细胞术结果。计量数据用均数±标准差表示，两组比较采用t检验或秩和检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 QJZG对小鼠外周血中PLT、PCT、PDW、MPV水平的影响

与Control组相比，模型组PLT、PCT降低（P<0.01）；PDW、MPV水平升高（P<0.01）。与模型组比较，QJZG组及Pred组PLT水平升高（P<0.01），PDW、MPV水平下降（P<0.05），CaMKK2激活剂组PLT、PCT计数下降（P<0.05），MPV、PDW水平升高（P<0.01，表2）。

2.2 QJZG对小鼠血清TPO、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平的影响

与Control组相比，模型组TPO、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.01）。与模型组比较，QJZG组及Pred组IL-10升高（P<0.01），TPO、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平下降（P<0.01），CaMKK2激活剂组IL-10计数均下降（P<0.01），IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高（P<0.01，表3）。

2.3 QJZG对小鼠血小板内Ca²⁺荧光强度的影响

与Control组比较，模型组、Pred组和CaMKK2组血小板内钙离子荧光强度明显升高（P<0.05）。与模型组比较，QJZG组、Pred组血小板内钙离子荧光强度水平降低（P<0.05）；CaMKK2组血小板内钙离子荧光强度升高（P<0.01，图1）。

2.4 QJZG对小鼠血小板超微结构的影响

与 Control组比较， 模型组、CaMKK2组可见血小板重度减少，血小板外膜固缩，不规整，胞浆呈空洞，大泡状；与模型组比较，QJZG组、Pred组可见血小板明显聚集 ，血小板外膜完整，胞浆空洞明显减少；与QJZG组相比，Pred组血小板部分聚集低于QJZG组，部分血小板外膜完整。与其他各组相比，CaMKK2组血小板明显减少，血小板外膜固缩，不规整，胞浆呈空洞，大泡状（图2）。

2.5 QJZG对小鼠血清mRNA 表达量的影响

与Control组相比，模型组 CaMKK2、AMPK、Bcl-1 mRNA在血小板内表达量升高（P<0.05）；mTOR、p62 mRNA表达量降低（P<0.05）。与模型组比较，QJZG组及Pred组CaMKK2、AMPK、Bcl-1 mRNA在血小板内表达量降低（P<0.05）；mTOR、P62 mRNA表达量升高（P<0.05）；CaMKK2激活剂组CaMKK2、AMPK、Bcl-1 mRNA在血小板内表达量升高（P<0.05）；mTOR、p62 mRNA表达量降低（P<0.05，图3）。

2.6 QJZG对小鼠CaMKK2/AMPK/mTOR通路及血小板自噬相关蛋白水平的影响

各组CaMKK2蛋白、AMPK 蛋白、mTOR蛋白在血小板内的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与Control组相比，模型组p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白水平（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量升高（P<0.05）；p-mTOR、P62蛋白减少（P<0.05）。与模型组比较，QJZG组及Pred组p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白水平（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量降低（P<0.05）；p-mTOR蛋白、P62蛋白表达量升高（P<0.05）；CaMKK2激活剂组p-CaMKK2、p-AMPK及血小板自噬蛋白水平（LC3Ⅱ蛋白、Beclin1蛋白）在血小板内表达量升高（P<0.05）；p-mTOR蛋白、P62蛋白表达量减少（P<0.05，图4）。

3 讨论

SLE血小板减少症属免疫性血小板减少类型，其发病机制复杂，涉及B细胞和T细胞介导的免疫反应、Fc受体与巨噬细胞介导的血小板清除、固有免疫的激活、血小板自噬与凋亡以及遗传和环境因素的相互作用^{［13， 14］}。而血小板自噬的分子机制涉及多个信号通路和关键调控分子，mTOR、AMPK、Beclin-1、ATG蛋白家族等在自噬过程中起关键作用，调节自噬体的形成、成熟和降解。尽管已有研究揭示了一些关键机制，但血小板自噬的调控网络极为复杂，涉及多种信号通路的交互，如PI3K/AKT、AMPK/mTOR等^{［15， 16］}。既往多有研究细胞内Ca²⁺超载后激活CaMKK2/AMPK/mTOR通路引起细胞发生自噬^{［11， 17］}，本研究在透射电子显微镜下观察到血小板内发生自噬，并验证QJZG能够升高SLE血小板减少小鼠的PLT相关指标，降低炎症因子以及通过降低血小板内Ca²⁺浓度，抑制CaMKK2、AMPK的激活，促进mTOR激活来改善血小板自噬，从而达到治疗的作用。

SLE常引起血液系统问题，血小板减少是其中一种表现。其他血小板参数如MPV、PDW、PCT可反映血小板的活化状态，与炎症和疾病活动度相关^［18-20］。近年来有研究分析生物制剂类对SLE血小板减少的治疗作用，多只观察血小板^［21］。本研究通过动物实验验证中药复方QJZG对PLT、PCT升高的促进作用和降低PDW、MPV的作用，结果与临床观察一致。SLE患者血小板减少与Th1/Th2细胞分化失衡有关。Th1细胞分泌IFN-γ，抑制Th2细胞因子生成，而Th2细胞分泌IL-10，具有抑炎作用^［22］。IL-10通过促进Th0向Th2分化、抑制Th1分化，改变Th1/Th2平衡，诱导T细胞向Treg转化，抑制Th17细胞和树突细胞分泌促炎因子^［23］。IL-6由多种细胞产生，具有抗肿瘤和调节免疫功能，促进B细胞抗体分泌和T细胞活化，但B细胞抗体与血小板结合可导致血小板减少^［24］。IL-11能促进浆细胞增殖、T细胞依赖的B细胞发育，以及巨核细胞形成和成熟，有助于提高血小板数目^［25］。TNF-α主要由淋巴和巨噬细胞产生，具有免疫保护和致炎双重作用。过量的TNF-α与其他炎症因子共同作用，破坏免疫平衡，导致病理损伤^［26］。有研究表明，TNF-α、IL-6、IL-17等炎症因子在血小板减少患者中水平升高，这与本实验结果相对应，并显示可能通过促进自身抗体生成和激活JAK/STAT、NF-κB等信号通路导致免疫失衡及血小板生成抑制^{［27， 28］}。但当前研究对于炎症因子间的相互作用机制和针对这些因子的治疗干预手段仍不明确。本研究使用ELISA法测定上述细胞因子，结果证明QJZG对调节免疫炎症方面具有一定的作用。

自身免疫性相关的血小板减少和血小板本身发生的过度自噬有密切关系^［29］。研究发现血小板内部存在自噬体样液泡，SLE血小板减少的相关机制可能是血小板发生过度自噬，但具体机制尚不明确^［30］。Ca²⁺是细胞内普遍存在的第二信使，调节着大量的下游细胞信号通路，在信号转导过程中发挥重要作用^［31］。Ca²⁺作为重要的调节配体，CaM是其主要的细胞内受体，动态调节Ca²⁺依赖性靶蛋白及其下游通路，可直接作为细胞内受体与钙离子结合，从而形成Ca²⁺-钙调蛋白复合物进而刺激钙调蛋白依赖性蛋白激酶家族，该家族由钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶1（CaMKK1）和激酶2（CaMKK2）组成^［32］。CaMKK2在某些生理情况下可以激活其下游分子AMPK，以维持代谢平衡^［33］。AMPK是一种正性的自调节因子，在自噬的发展过程中发挥着重要作用。AMPK的激活，可以调节参与自噬的下游信号分子活动，导致细胞周期阻滞，从而导致细胞数目减少^［34］。而mTOR是AMPK的下游调节因子，mTOR磷酸化能够增加下游靶标的水平，以调节包括细胞凋亡、自噬在内的诸多不同的细胞过程。在代谢应激时，AMPK被激活并通过负调节mTOR以适应能量代谢、触发自噬流量来积极调节自噬和凋亡，这在调节细胞和系统能量稳态中起着关键作用^［35］。当细胞接收到自噬诱导信号时，细胞中自噬调节蛋白的表达也随之改变。其中，LC3的转换以及P62、Becline1的表达是观察是否发生自噬的标准^［36-38］。细胞内钙离子超载后引起下游通路的激活，细胞发生过度自噬，但目前多是关于神经细胞、心肌细胞和肾小管上皮细胞等的报道^［39-41］。为揭示QJZG改善血小板减少的具体机制，本研究使用CaMKK2激活剂，发现其血小板内钙离子荧光强度、CaMKK2和AMPK的表达量明显升高，mTOR活性受到抑制，电镜下血小板自噬水平升高。而芪黄组Ca ²⁺浓度明显降低，q-PCR、Western blotting结果显示，QJZG显著下调p-AMPK并上调p-mTOR蛋白的表达水平，这表明QJZG调节Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路或许是改善血小板自噬的潜在机制。

综上所述，本研究证实了钙离子在SLE小鼠血小板内水平升高，而QJZG可以通过减轻炎症及影响Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路改善SLE血小板减少；也揭示QJZG作为一种中药复方，具有抑制细胞自噬的潜在作用，并证明其作为SLE血小板减少症的潜在治疗价值，这对未来寻找SLE血小板减少治疗相关分子靶点提供了重要帮助。

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