高表达CRTAC1通过调控PI3K信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移及免疫浸润

High expression of CRTAC1 promotes proliferation, migration and immune cell infiltration of gastric cancer by regulating the PI3K/AKT signaling pathway

摘要

目的 探究软骨酸性蛋白1（CRTAC1）参与影响胃癌生物学行为和免疫浸润的机制。 方法 采用转录组分析CRTAC1在胃癌肿瘤细胞中表达与预后的关系，GO和KEGG富集分析CRTAC1表达水平可能参与细胞的功能及信号通路。ESTIMATE算法分析CRTAC1表达对肿瘤微环境及肿瘤突变负荷的影响。CCK-8、EdU、克隆形成以及流式细胞周期实验检测CRTAC1参与胃癌细胞的增殖。流式细胞凋亡、Hoechst和Western blotting实验检测CRTAC1抑制胃癌细胞凋亡。划痕伤口愈合、Transwell以及Western blotting实验分析CRTAC1参与胃癌迁移的机制。 结果 生物信息学分析结果显示：CRTAC1在胃癌和癌旁组织中的表达量差异有统计学意义（P<0.05）；单因素Cox和多因素Cox回归分析表明年龄和分期分别是CRTAC1高表达胃癌患者的预后风险因素（P<0.001）。采用ESTIMATE算法结果显示：CRTAC1的表达增加免疫细胞浸润丰度（P<0.001）；同时CRTAC1高表达减少肿瘤突变负荷（P<0.001）。采用CCK-8、EdU、克隆形成实验检测敲低CRTAC1后明显抑制细胞增值（P<0.001）；流式细胞周期实验检测敲低CRTAC1后细胞阻滞在G1期（P<0.001）。流式细胞凋亡、Hoechst实验结果显示敲低CRTAC1后细胞凋亡增加（P<0.001）；生物信息学预测胃癌患者中CRTAC1与凋亡相关蛋白BAX和BCL2的关系（P<0.05），Western blotting实验验证敲低CRTAC1后CRTAC1、BAX和BCL2的表达水平变化（P<0.05）。划痕伤口愈合、Transwell实验显示，敲低CRTAC1可抑制细胞的增值迁移（P<0.001）；生物信息学预测胃癌患者中CRTAC1与EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin与CRTAC1的关系（P<0.05），Western blotting实验验证敲低CRTAC1后E-cadherin和Vimentin的表达水平改变（P<0.01）。KEGG富集分析显示，CRTAC1生物功能可能与PI3K/AKT信号相关，Western blotting实验证实CRTAC1可促进p-PI3K、AKT2、p-AKT、p-mTOR的表达（P<0.05）。 结论 CRTAC1在胃癌组织中高表达影响患者的免疫治疗效果和预后，可能通过调控肿瘤突变负荷和肿瘤微环境，以及PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞EMT进程相关。

Abstract

Objective To investigate the expression of cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) in gastric cancer (GC) and its effect on biological behaviors and immune cell infiltration of GC. Methods Transcriptomic, GO and KEGG analyses were conducted to investigate the association of CRTAC1 expression with prognosis of GC patients and its involvement in cell function and signaling pathways. ESTIMATE algorithm was used to analyze the effect of CRTAC1 expression on the tumor microenvironment and the tumor mutation load. In two GC cell clines (HGC-27 and MKN-74), CCK8, EdU and clone formation assays, flow cytometry, and Hoechst staining were used to examine the effects of CRTAC1 knockdown on cell proliferation, cell cycle changes and apoptosis. Wound healing assay, Transwell assay, and Western blotting were performed to analyze the effect of CRTAC1 knockdown on GC cell migration and the underlying mechanism. Results Bioinformatics analysis showed significantly higher expression of CRTAC1 in GC tissues than in adjacent tissues (P<0.05). Age and tumor stage were both prognostic risk factors in GC patients with high CRTAC1 expression (P<0.001). Analysis using ESTIMATE algorithm showed that CRTAC1 expression increased immune cell infiltration and decreased tumor mutational load in GC (P<0.001). In HGC-27 and MKN-74 cells, CRTAC1 knockdown significantly inhibited cell proliferation and migration and promoted cell apoptosis. Western blotting demonstrated that CRTAC1 knockdown significantly increased E-cadherin expression and reduced the expression levels of vimentin, p-PI3K, AKT2, p-AKT and p-mTOR in GC cells. Conclusion High expression of CRTAC1 in GC tissues affects immunotherapeutic efficacy and prognosis of the patients, possibly by promoting epithelial-mesenchymal transition via modulating tumor mutational load, tumor microenvironment, and the PI3K/AKT signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

CRTAC1 / 胃癌 / 免疫浸润 / 上皮间质转化

Key words

gastric cancer / CRTAC1 / immune infiltration / epithelial-mesenchymal transition

国际癌症研究机构2020年编制的全球癌症统计数据库（GLOBOCAN）显示，胃癌的全球发病率位居第5（5.6%），死亡率高居第4（7.7%）^［1］，给全人类健康造成了巨大负担^［2］。胃癌的治疗方式包括手术治疗、辅助放疗、化疗、免疫治疗等^［3］，然而接受手术的晚期胃癌患者5年生存率较低，术后胃功能紊乱难以避免^［4］。其中，转移是术后复发的主要原因，肝脏是胃癌转移的最常见部位，胃癌伴肝转移 （GCLM）的发生率为9.9%~18.7%，中位生存时间为11个月，5年生存率为<20%^［5］。此外，由于碱基错配修复缺陷（dMMR）和微卫星不稳定（MSI），胃癌患者对免疫治疗不敏感^［6］。因此，我们迫切需要找出可靠的生物标志物作为治疗靶点。

软骨酸性蛋白 1 （CRTAC1）基因编码一种糖基化细胞外基质蛋白^［7］，其组织特异性表达在正常胃组织中高度表达。内质网（ER）是一种储存细胞内钙离子的细胞器，其对细胞内钙浓度的调节由兰尼碱受体（RyR）和IP3R通道介导，将钙离子从内质网腔释放到细胞质中。CRTAC1作为一种钙结合蛋白，通过RyR通道来调控细胞内Ca²⁺的水平^［8］。Ca²⁺是人类细胞中含量最丰富的第二信使，参与基因转录、细胞周期控制、细胞活力、自噬和凋亡等生物学行为^［9］，异常的Ca²⁺转运可以调控肿瘤发生发展，恶性细胞中控制细胞内Ca²⁺信号传导的分子机制因其关键成分或相互作用物的表达水平改变和翻译后修饰而改变，这些缺陷可以导致细胞恶性转化及进展，并在治疗敏感性方面起到关键作用^［9］。因此，靶向Ca²⁺通道可能成为肿瘤治疗的有效方式。有研究指出CRTAC1在膀胱癌、尿路上皮癌中高表达并抑制肿瘤增殖及迁移^{［10， 11］}，此外，有研究采用CRTAC1作为关键基因之一构建胃癌风险预后模型^［12］，然而上述研究均未阐明CRTAC1影响胃癌恶性进展的具体分子机制。为此，本研究从生物信息学的角度探究CRTAC1在胃癌中的表达，关于胃癌的治疗有诸多方案，目前较为关注胃癌的肿瘤微环境免疫治疗，根据CRTAC1在肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关靶标，为胃癌的预后和免疫治疗预测提供理论依据，进而为胃癌的精准治疗提供新思路^［13］。本研究通过构建敲低CRTAC1胃癌细胞系验证CRTAC1促进胃癌增殖、转移的生物学行为，以期为胃癌的临床诊疗提供潜在治疗方案。

1 材料和方法1.1 数据库分析

1.1.1 数据来源

胃癌患者转录组数据、临床数据和肿瘤突变数据来源于TCGA数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。排除生存天数<30 d及其他临床数据不完整的肿瘤患者。

1.1.2 基因差异表达分析和临床预后分析

使用TIMER2.0数据库（https：//timer.cistrome.org/）分析CRTAC1在泛癌中的表达情况，使用“limma”R包从TCGA数据库中提取CRTAC1表达量，比较癌旁组织和肿瘤组织中CRTAC1的表达量差异。采用cBioPortal （http：//cBioPortal for Cancer Genomics.org/） 网站中“突变模块”，下载CRTAC1在胃癌中的突变位置。使用BEST网站（https：//rookieutopia.com/app_direct/BEST/）分析GSE18105、GSE21510、GSE39582和GSE41258中CRTAC1在癌旁组织和肿瘤组织中的表达差异。依据CRTAC1在肿瘤组织表达量的中位值将样品分为高、低表达两组，使用“survival”和“pheatmap”R包绘制Kaplan-Meier曲线分析CRTAC1与胃癌患者预后的关系。对CRTAC1在胃癌中的表达进行单因素和多因素Cox分析并可视化。

1.1.3 富集分析

使用R语言“ggplot2”、“limma”、“pheatmap”包进行以∣log2FC∣>1，P<0.05为界限分析CRTAC1高、低表达组间的差异表达基因并绘制火山图和热图进行可视化。在TCGA数据库中，使用R语言“limma”、“corrplot”、“circlize”包根据CRTAC1在胃癌中的表达水平与胃癌基因组进行共表达富集分析。使用R语言“ggplot2”包对进行GO和KEGG富集分析差异基因相关的功能和信号通路。

1.1.4 免疫浸润和肿瘤突变负荷分析

使用ESTIMATE算法计算出每个样本的肿瘤微环境评分，比较CRTAC1在高、低表达组间的基质细胞和免疫细胞评分差异。采用CIBERSORT算法计算样本中免疫细胞浸润差异和免疫功能差异，使用“reshape2”和“ggpubr”R包分析两组患者之间免疫检查点表达差异。1.2 细胞实验

1.2.1 细胞培养

人胃癌细胞株HGC-27和MKN-74（来源于中国科学院生化与细胞所-上海生命科学研究院）培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱常规培养。在细胞生长至70%~80%时，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、传代，选取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染

在6孔板中按1.5×10⁵/孔接种人胃癌细胞HGC-27、MKN-74，待16 h后细胞密度约为70%时，将含10%胎牛血清的DMEM培养基更换为无血清的DMEM培养基，按照Lipofectamine2000转染试剂盒（聚合美生物科技有限公司）方法转染siNC作为阴性对照组，转染siCRTAC1#1和siCRTAC1#2（吉玛基因）作为实验组，6 h后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，于48 h后收集细胞使用Western blotting检测干扰效果。siRNA干扰序列如下：siCRTAC1#1序列（5'-3'） CUCAACACCAAUAAUGCCUTT和反义序列AGGCAUUAUUGGUGUUGAGTT，siCRTAC1#2序列（5'-3'）GACAAUGAGAAUGGGCCUATT和反义序列UAGGCCCAUUCUCAUUGUCTT。

1.2.3 CCK-8实验

采用胃癌细胞HGC-27、MKN-74进行siRNA转染48 h，分别接种于96孔板中，以每孔2.5×10³/100 μL放入37 ℃，5% CO₂培养箱常规培养，待细胞24 h贴壁后加10 μL/孔CCK8试剂（Biosharp），37 ℃孵育2 h后使用酶标仪检测吸光度A_{450 nm}作为0 h，随后在24、48、72、96 h时分别检测各组细胞的增殖能力。

1.2.4 集落形成实验

将胃癌细胞HGC-27、MKN-74采用siRNA转染48 h，以500/孔分别接种在六孔培养板中。分别在37 ℃，5% CO₂培养箱常规培养下孵育10~14 d。先用PBS轻轻洗涤3次，并用4%多聚甲醛固定20 min。再用PBS洗涤3次，并用0.5%结晶紫溶液染色30 min。最后用PBS洗涤3次，风干并拍照。在100倍显微镜下计数含有<50细胞的集落数不予以计数。含50或更多细胞的菌落被计为菌落。

1.2.5 EdU实验

采用胃癌细胞HGC-27、MKN-74约2.0×10⁵分别接种在6孔板中，加入含有10%胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM）中，置入37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，待细胞密度达到70%~80%时予以siRNA转染。48 h后，按照EdU试剂盒（碧云天生物技术有限公司）将EdU（Invitrogen）以先配成20 μmol/L的浓度，加入孔板内与原培养基配成最终浓度为10 μmol/L。置入37 ℃，5% CO₂ 培养箱中孵育细胞2 h，去除培养基，使用 PBS洗涤3次。加入1 mL固定液，室温固定15 min，使用 PBS洗涤3次，3~5 min/次。去除洗涤液加入1 mL含0.3%TritonX-100的PBS，室温孵育15 min。去除含0.3%TritonX-100液体，使用PBS洗涤2次，3~5 min/次。加入配制Click反应液每孔0.5 mL，室温避光孵育30 min。去除Click反应液，再使用PBS洗涤3次，3~5 min/次。同时，为了更好检测细胞增殖比例，采用配制Hoechst33342液，每孔1 mL对细胞核进行染色，室温避光孵育10 min。去除Hoechst33342液，使用PBS洗涤3次，3~5 min/次。最后采用200 倍荧光显微镜予以记录细胞增殖详细情况。

1.2.6 流式细胞周期检测

使用胃癌细胞HGC-27、MKN-74进行siRNA转染48 h，将转染后的人胃癌细胞HGC-27、MKN-74重悬，PBS清洗2次后1500 r/min离心5 min收集细胞，用75%乙醇固定24 h，PBS清洗2次后采用碘化丙啶（PI）单染法染色30 min，利用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.7 流式细胞凋亡检测

将胃癌细胞HGC-27、MKN-74约1.0×10⁵分别接种在6孔板的孔中，加入含有10%胎牛血清 （FBS）的培养基（DMEM）中，置入37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，待细胞密度达到70%~80% 时予以siRNA转染48 h后。按照细胞凋亡试剂盒（APExBIO），使用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化，收集细胞，离心300×g/5 min弃培养基上清。使用预冷的PBS洗涤细胞离心300×g/3 min弃培养基上清。然后将细胞重悬于500 μL 1×Binding Buffer中。加入量为5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀，将细胞在室温下黑暗孵育15 min，反应结束后立即行流式细胞仪检测凋亡细胞。

1.2.8 Hoechst凋亡检测

胃癌细胞HGC-27、MKN-74以大约1.0×10⁵/孔分别接种在6孔板中，加入含有10%胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM）中，置入37 ℃，5% CO₂培养箱中培养，待细胞密度达到70%~80% 时予以siRNA转染48 h后。按照细胞凋亡-Hoechst试剂盒（碧云天生物有限公司）染色观察细胞核形态。用 PBS洗涤细胞3次，加入固定液0.5 mL /孔，固定10 min。用PBS洗涤细胞3次，3 min/次。去除PBS洗涤液，加入0.5 mL Hoechst染色液，染色5 min。去除染色液，使用PBS洗涤细胞3次，3 min/次。去除PBS洗涤液，加适量的抗荧光淬灭。通过200 倍荧光显微镜观察细胞形态变化。

1.2.9 划痕伤口愈合实验

采用胃癌细胞HGC-27、MKN-74进行siRNA转染48 h，将转染后的人胃癌细胞HGC-27、MKN-74接种于12孔板中，待汇合度达到90%后划痕，将培养基更换为不含血清的DMEM，40倍镜拍照记录0 h划痕状况，随后在24、48 h记录孔板相同位置的划痕状况，使用ImageJ软件计算划痕伤口愈合百分比。细胞迁移率（%）=（0 h划痕面积-48 h划痕面积）/0 h划痕面积。

1.2.10 Transwell实验

在胃癌细胞HGC-27、MKN-74进行siRNA转染48 h，将转染后的人胃癌细胞HGC-27、MKN-74用DMEM重悬，在Transwell上室接种5×10 ⁴细胞（不含血清的培养基），在Transwell下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，37 ℃，5% CO₂培养箱中培养72 h，取出Transwell小室，使用棉签擦去上室中未穿过Transwell小室底膜的细胞，用多聚甲醛固定30 min，5%结晶紫染色15 min后在100倍显微镜下观察记录。

1.2.11 Western blotting

本研究使用含蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液从HGC-27、MKN-74细胞中提取蛋白，采用BCA蛋白试剂盒（碧云天生物技术有限公司）对蛋白浓度进行定量分析。使用10% SDS-PAGE胶（雅酶生物）分离蛋白质后转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h后使用CRTAC1（Bioss，1∶1000）、Vimentin（Proteintech，1∶2000）、E-cadherin（Proteintech，1∶5000）、PI3K（Proteintech，1∶1000）、p-PI3K（Cell Signaling Technology，1∶1000）、AKT1（Proteintech，1∶5000）、AKT2（Proteintech，1∶1000）、p-AKT（Proteintech，1∶2000）、mTOR（Proteintech，1∶5000）、p-mTOR（Cell Signaling Technology，1∶1000）、BCL2（Abways，1∶1000）、BAX（Abways，1∶1000）、GAPDH（Proteintech，1∶10 000），抗兔 IgG（Abways，1∶5000）。一抗4 ℃孵育12 h，二抗室温孵育2 h后使用ECL显影试剂（Millipore）进行可视化，获得的条带用Image lab软件计算相对蛋白表达水平。

1.3 统计学分析

采用IBM SPSS 29.0软件对实验结果进行统计分析，多组间差异比较采用方差分析和LSD事后检验，P<0.05为组间差异具有统计学意义，所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 CRTAC1在胃癌组织中的表达水平降低

本研究从TIMER2.0数据库下载CRTAC1在泛癌中的表达，结果显示CRTAC1在胃癌等肿瘤中低表达（图1A）。采用cBioPortal，明确CRTAC1在胃癌中的突变位置（图1B）。TCGA数据库和BEST在线网站上分析的结果与上述结果一致（图1C~I）。根据TCGA数据库中CRTAC1表达水平ROC曲线绘制（图1J）。根据TCGA数据库中CRTAC1表达量的中位值，将胃癌患者分为高、低表达两组。Kaplan-Meier曲线结果显示，CRTAC1低表达组患者的总生存期（OS）高于CRTAC1高表达组患者（图1K）。此外，单因素和多因素Cox分析结果显示，CRTAC1表达是胃癌患者的高风险因素并具有独立预测预后的价值（图1L~M）。

2.2 CRTAC1的表达水平与肿瘤微环境显著相关

采用CIBERSORT算法计算各样本中基质细胞和免疫细胞浸润丰度，结果显示CRTAC1高表达组胃癌患者的基质细胞评分和免疫细胞评分均升高（图2A），ssGSEA结果显示胃癌患者的巨噬细胞M2型活化、单核细胞活化、肥大细胞休眠等免疫细胞含量增加（图2B、C）。此外，CRTAC1与HHLA2呈现负相关，在CD27、CD28、CD40等中正相关，避免胃癌细胞的免疫逃逸，增加了免疫细胞的抗肿瘤作用（图2D）。

2.3 CRTAC1在胃癌中的表达水平影响肿瘤突变负荷及预后

统计TCGA数据库中胃癌各样本的突变数并比较其与CRTAC1表达量的相关性，结果显示CRTAC1表达量与样本的肿瘤突变负荷（TMB）呈负相关（图3A）。绘制瀑布图分析CRTAC1高、低表达组突变率前20基因，高表达组TTN、MUC16等突变率增高，但LRP1B突变率降低（图3B）；将各样本的突变数分为高TMB组和低TMB组，Kaplan-Meier曲线显示低TMB组胃癌患者的预后较差（图3C）；胃癌患者TMB与免疫得分的风险分为高、低表达组（图3D），同时进行免疫得分的Kaplan-Meier曲线显示高风险组胃癌患者的预后较差（图3E）。依据CRTAC1表达量和TMB将患者分为4组，结果显示低TMB且低CRTAC1表达的胃癌患者预后最差，高TMB且低CRTAC1表达的胃癌患者预后最佳（图3F）。

2.4 CRTAC1的高表达促进胃癌细胞的生长增殖

采用siRNA-CRTAC1敲低的胃癌细胞，进行CCK8实验、集落形成实验和EdU实验检测敲低CRTAC1后对胃癌细胞增殖能力的影响，实验结果显示敲低CRTAC1后能够抑制细胞的增殖能力（图4A~J）。流式细胞周期检测发现敲低CRTAC1可以使胃癌细胞阻滞在G1期，从而进一步抑制细胞增殖（图4K~N）。

2.5 CRTAC1在胃癌中的高表达抑制细胞凋亡

流式细胞凋亡实验定量、Hoechst实验定性均表明敲低CRTAC1可以促进胃癌细胞的凋亡（图5A~H）。同时使用R语言ggplot2包对TCGA数据库中BAX、BCL2蛋白行表达相关性Spearman统计分析（图5I~J）；Western blotting结果显示CRTAC1敲低后抑制细胞凋亡蛋白BCL2表达降低，促进细胞凋亡蛋白 BAX表达增加（图5K~M）。

2.6 CRTAC1沉默抑制胃癌细胞迁移能力

采用划痕伤口愈合实验、Transwell实验均表明敲低CRTAC1表达可以抑制胃癌细胞的迁移能力（图6A~H）。同时使用R语言ggplot2包对TCGA数据库中EMT相关分子表达量进行预测，E-cadherin、Vimentin蛋白行表达相关性Spearman统计分析（图6I~J）； Western blotting进一步实验验证EMT相关分子表达量，结果表明敲低CRTAC1可以增加E钙黏蛋白表达，减少Vimentin蛋白表达（图6K~M）。

2.7 探索CRTAC1通过PI3K信号通路促进胃癌细胞增值及迁移的机制研究

在TCGA数据库中根据CRTAC1在胃癌中的表达水平与胃癌基因组进行的共表达分析（图7A），同时进行∣log2FC∣>1，P. adjst<0.05为界限筛选出与CRTAC1表达正相关的基因2935个，负相关的基因38个（图7B），并对这2973个差异基因进行GO和KEGG富集分析。分析结果显示CRTAC1参与化学突触传递、细胞外基质、离子通道活化、糖胺聚糖绑定、ECM-受体相互作用、细胞粘附、粘着斑等细胞功能（图7C、D）。同时使用R语言ggplot2包对TCGA数据库中AKT1、AKT2蛋白行表达相关性Spearman统计分析（图7E、F）；Western blotting进一步证实敲低CRTAC1后PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、AKT2、p-AKT、p-mTOR表达降低，PI3K、AKT1、mTOR无明显改变（图7G~I）。

3 讨论

内质网（ER）作为动物细胞最大的钙库，在维持细胞内Ca²⁺离子稳态中发挥重要作用，CRTAC1作为一种钙结合蛋白，通过兰尼碱受体（RyR）通道来调控细胞内Ca²⁺的水平^［8］，RyR是一种细胞内Ca²⁺位于肌节/内质网（SR/ER）上的释放通道释放Ca²⁺从细胞内储存到激活关键功能，包括肌肉收缩和神经递质释放^［14］。Ca²⁺作为细胞中最重要的信使之一，不仅是起到控制肌纤维伸缩、信号转导、蛋白激酶的活化，同时又是诱导蛋白质磷酸化的关键小分子^{［15， 16］}。近年来，Ca²⁺控制细胞多项生命活动，尤其是Ca²⁺在肿瘤恶性进展和治疗反应中的作用越来越受到人们的重视，肿瘤细胞中控制细胞内Ca²⁺信号传导的分子机制因其关键成分或相互作用物的表达水平改变和翻译后修饰而改变，这些缺陷导致恶性转化，促使肿瘤重塑和调控^［17］，进而在肿瘤耐药方面起到关键作用^［18］。

过去研究证明，肿瘤是由于过度的细胞繁殖和避免细胞死亡，且肿瘤细胞的扩散通过增强的细胞迁移，侵袭和血管形成，胞质内的Ca²⁺是这些恶性行为的重要核心^［19］，在肿瘤细胞迁移过程中钙离子扮演激活局灶性黏附分子和细胞的趋化作用，引导肿瘤细胞的定向运动^［20］。胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，早期临床表现不明显，且容易发生肝转移，手术切除效果欠佳^［5］。肿瘤转移是患者死亡的主要原因，然而与局部手术或放化疗治愈的原发性肿瘤不同，转移是一种全身性疾病^［21］。随着研究的不断深入，逐渐发现肿瘤的转移是经过一系列的转移级联步骤，且每个步骤都需要特定的功能，包括远处的组织浸润，免疫逃逸等^［22］。众所周知，肿瘤转移是导致患者死亡的主要原因，通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进胃癌、结直肠癌、肝癌、肺癌等众多肿瘤的增值迁移^［23-26］，其中AKT是PI3K信号通路的下游，主要由AKT1、AKT2、AKT3三个亚型组成^{［27， 28］}，AKT1和AKT2表达较为常见，且AKT2在胃癌中的高表达显著促进肿瘤的生长增值及迁移^{［29， 30］}。上皮-间充质转化（EMT）是促进癌症细胞转移的关键一环，参与生长发育、组织修复等，促使细胞间粘附的丧失、细胞极性的丧失、细胞骨架的形成及运动、抗细胞凋亡性等促使细胞迁移和侵袭特性的获得，进而促进癌症的进展迁移^［31-34］。EMT相关蛋白标志物包括E-钙黏蛋白、波形蛋白等已被证实是影响肿瘤转移的关键分子^{［35， 36］}。因此，在肿瘤治疗过程中靶向AKT2和EMT相关分子的上游或减少AKT2及EMT相关蛋白标志物的产生，可能作为肿瘤治疗的潜在方案。

在泛癌分析结果表明，CRTAC1在胃癌、结肠癌、肺癌、泌尿系统肿瘤等肿瘤中表达下调，这在肺癌、尿路上皮癌中有相关报道^{［8， 11］}，提示CRTAC1可能在多种癌症的发生发展过程中发挥作用，采用cBioPortal网站找到CRTAC1在胃癌中的突变位置。本研究利用TCGA和GEO数据库的转录组数据分析发现肿瘤样本中CRTAC1 mRNA水平表达量显著低于癌旁样本。Kaplan-Meier曲线显示，CRTAC1高表达的患者预后较差，且5年生存率较低。单因素及多因素Cox分析显示CRTAC1可以作为胃癌患者上述结果的独立预后预测因子，提示CRTAC1在胃癌中发挥了致癌作用，综上所述CRTAC1有可能作为临床诊断及治疗的靶分子。

CRTAC1相关表达差异基因的所有显著差异表达基因 （DEGs）进行GO和KEGG富集分析，分别富集细胞外基质组织、ECM受体相互作用及PI3K/AKT/mTOR信号通路等。为验证上述富集结果，本研究采用CCK8实验、集落形成实验、EdU实验和流式细胞周期实验，结果显示敲低CRTAC1可以有效地将胃癌细胞的增殖阻滞在G1期。采用流式细胞凋亡实验和Hoechst实验实验均表明CRTAC1可以显著促进胃癌细胞的生长增殖，采用 Western blotting检测敲低CRTAC1导致细胞凋亡蛋白BCL2表达降低和BAX表达增加。划痕伤口愈合实验、Transwell实验显示敲低CRTAC1可以显著抑制肿瘤迁移，为探究影响迁移的机制，本研究采用生物信息学联合Western blotting检测PI3K信号通路和EMT相关分子，结果显示敲低CRTAC1可以显著抑制PI3K信号通路蛋白表达，以及增加E钙黏和降低Vimentin蛋白表达量，提示CRTAC1通过促进PI3K信号通路和上皮间充质转化促进胃癌的生长增值及迁移，从而导致肿瘤转移。

肿瘤微环境中的免疫成分是调节肿瘤进展的极为有效的靶点，免疫治疗作为比较有前景的治疗方法^［37-39］，本研究采用CIBERSORT算法计算出各样本免疫细胞评分，并比对CRTAC1高、低表达组多种免疫细胞浸润丰度，发现CRTAC1不仅影响肿瘤细胞本身的生物学行为，还会导致肿瘤微环境免疫细胞浸润丰度的升高；为此，我们继续探索CRTAC1对肿瘤细胞免疫功能的影响，CRTAC1通过富集肥大细胞静息、M2型巨噬细胞、单核细胞等显著正相关，与巨噬细胞M0、肥大细胞活化等显著负相关，先前的研究已经证实，TME 中 M2巨噬细胞和肥大细胞的浸润与胃癌的不良预后有关^［40］；基于上述研究，我们将免疫浸润风险评分分为高风险组和低风险组。尽管免疫检查点抑制剂（ICI）对于晚期胃癌患者来说是一种很有前途的策略，但反应率仍然有限，并且需要新的策略来最大限度地提高ICI的疗效^［41］。众所周知，GC 分为4种不同的分子亚型：EBV阳性、MSI富集、基因组稳定和染色体不稳定，在这些亚型中，EBV阳性和MSI高的肿瘤对ICI表现出更高的敏感性，此外，高TMB已被建议作为预测ICI免疫疗法临床疗效的潜在生物标志物^{［42， 43］}；DNA损伤修复（DDR）是一个复杂的信号转导过程，在确保基因组稳定性方面起着重要作用^［44］，有缺陷的DDR可促进MSI和TMB，而新抗原负荷的增加可促进免疫原性并吸引更多免疫细胞至TME，几项研究发现，MUC16和TTN突变与GC和较高TMB的更好预后相关^［45-47］。在TCGA数据库中，胃癌的低风险组MUC16和TTN突变率较高。我们还发现在几种常用的免疫疗法生物标志物在不同免疫评分组之间存在显着差异，MSI和TMB在免疫评分低的组中更显著，与免疫评分呈负相关。为此，在低免疫评分组的肿瘤浸润性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能障碍较低，且排除了CTL水平。我们预计免疫评分低的患者将有更好的ICI反应，这在免疫治疗队列中得到了证实，并为临床试验中ICI治疗选择提供理论依据，为胃癌的综合治疗提供潜在的选择方案。

综上所述，CRTAC1通过PI3K/AKT信号通路及EMT促进胃癌细胞的生长增殖和迁移，且CRTAC1表达量与胃癌组织的肿瘤微环境及肿瘤突变负荷相关。CRTAC1可以作为预测胃癌患者预后及免疫治疗效果的分子标志物。

参考文献

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