木犀草素通过增加ROS的产生和下调AKT/mTOR通路及HO-1蛋白表达抑制肺癌A549细胞增殖

Luteolin inhibits proliferation of lung cancer A549 cells by increasing ROS production and inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway and HO-1 expression

摘要

目的 探究木犀草素（Lut）对肺癌A549细胞增殖的抑制作用及其内在机制。 方法 用不同浓度的Lut处理A549细胞48 h，通过MTT法检测细胞活性，通过平板克隆和EdU染色检测细胞增殖，通过DCFH-DA法检测细胞活性氧（ROS）水平，通过Hoechst33258 染色法检测细胞凋亡水平，通过MDC染色法检测细胞自噬水平，通过Western blotting实验检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9，自噬相关蛋白LC3B、Beclin1、P62，AKT/mTOR通路蛋白以及HO-1蛋白的表达。 结果 Lut剂量依赖性的抑制A549细胞的活力和增殖能力（P<0.05），引发细胞内ROS水平增加（P<0.05），上调凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-9和自噬相关蛋白Beclin1的表达，增加LC3B-II/LC3B-I的比值，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬相关蛋白P62的表达，诱导细胞凋亡和自噬（P<0.001）。此外，Lut可显著抑制AKT和mTOR的磷酸化，下调HO-1蛋白的表达（P<0.05）。 结论 Lut通过增加细胞内ROS的产生，抑制AKT/mTOR通路以及下调HO-1蛋白水平诱导A549细胞的凋亡和自噬。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of luteolin for inhibiting proliferation of lung cancer A549 cells. Methods A549 cells treated with different concentrations of luteolin for 48 h were evaluated for changes in cell viability, proliferation, reactive oxygen species (ROS) production and apoptosis using MTT assay, plate cloning assay, EdU staining, DCFH-DA assay and Hoechst33258 staining. The changes in cell autophagy were examined with MDC staining, and the expressions of apoptosis-related proteins (Bax, Bcl-2, and cleaved caspase-9), autophagy-related proteins (LC3B, Beclin 1, and P62), AKT/mTOR pathway proteins, and HO-1 protein were detected using Western blotting. Results Treatment with luteolin dose-dependently inhibited the viability and proliferation of A549 cells, increased intracellular ROS levels, up-regulated the expressions of Bax, cleaved caspase-9, and Beclin 1, increased the LC3B-II/LC3B-I ratio, down-regulated the expressions of Bcl-2 and P62, and induced cell apoptosis and autophagy. Luteolin also significantly inhibited the phosphorylation of AKT and mTOR and down-regulated the expression of HO-1 protein in the cells. Conclusion Luteolin induces apoptosis and autophagy to inhibit proliferation of A549 cells by increasing ROS production, inhibiting the AKT/mTOR pathway and down-regulating HO-1 protein expression.

Graphical abstract

关键词

木犀草素 / 活性氧 / 凋亡 / 自噬 / AKT/mTOR通路 / HO-1

Key words

luteolin / reactive oxygen species / apoptosis / autophagy / AKT/mTOR signaling pathway / HO-1

肺癌是我国常见的癌症类型之一，发病率和死亡率近年来呈上升趋势^［1］。现阶段肺癌的治疗以化疗为主，由于化疗的破坏性副作用，寻求更有效和毒性更低的治疗方法成为必要^［2］。近年来，一些植物活性成分在缓解包括癌症在内的各种病理状况方面的应用取得了很多进展，因为其高效、对哺乳动物无毒、对环境友好的特点获得了人们大量的关注。

活性氧（ROS）主要由线粒体电子传递链和三羧酸循环产生。一些外源性刺激，如电离辐射、化疗药物和环境损伤等，也能诱导ROS的大量产生^［3］。ROS在癌症的发生、发展、抑制和治疗中起着双重作用，维持ROS稳态对于调节各种细胞过程至关重要^{［4， 5］}。不受控制的细胞增殖和细胞生长是癌细胞的特征，一些药物可通过ROS依赖的方式抑制癌细胞的增殖。比如，大黄提取物Rhein可通过诱导口腔癌细胞中ROS的积聚来诱导细胞凋亡^［6］，百里醌通过诱导ROS产生抑制肾细胞癌细胞的增殖^［7］，叶黄素通过ROS介导的机制选择性地抑制乳腺癌细胞的生长^［8］，Bruceine D在体内和体外通过上调ROS诱导肺癌细胞的凋亡和自噬^［9］。ROS的过量产生会触发癌细胞凋亡信号，继而通过调控各种信号通路，如MAPK/ERK、PI3K/AKT、Nrf2/HO-1信号通路等，抑制癌细胞的增殖^［10］。其中，PI3K/AKT/mTOR信号通路在人类癌细胞中普遍被激活，可促进癌细胞的生长、存活和代谢。一些植物活性成分对癌细胞增殖的抑制就有PI3K/AKT/mTOR信号通路的参与。如卷柏提取物Delicaflavone对结直肠癌细胞凋亡的诱导同对PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制相关^［11］。Rhein对胰腺癌细胞凋亡的诱导也是通过PI3K/AKT通路的失活所致^［12］。

木犀草素（Lut）是植物中一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于各种水果蔬菜中，具有神经保护、抗炎、抗癌等多种有益的生物活性^［13］。有研究表明，在神经胶质瘤细胞，Lut通过诱导细胞凋亡和自噬抑制细胞的生长^［14］；在三阴性乳腺癌细胞，Lut通过SGK1-FOXO3a-BNIP3信号传导诱导细胞凋亡和自噬，抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^［15］；在胆管癌细胞，Lut通过抑制 Wnt 信号传导的活性，导致细胞周期停滞在 G2/M 期，引起细胞凋亡并抑制细胞迁移^［16］。这些研究表明，Lut可能成为预防和治疗癌症的一种新型药物。然而，Lut在肺癌细胞中的作用及其潜在的机制尚未得到很好的研究。本研究从Lut对A549细胞氧化应激水平的改变和对AKT/mTOR信号通路的影响探究Lut的抗癌作用，为Lut未来成为治疗肺癌的可能药物提供新的证据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞（A549）和人支气管上皮细胞（Beas-2B）（ATCC）。细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，并置于37 ℃，5% CO₂的细胞培养箱里，当细胞融合度达到70%~80%时，即可进行传代或用于实验。

1.2 试剂和抗体

Lut粉末（Sigma），NAC （上海源叶生物科技有限公司），LY294002（Cell Signaling Technology），胎牛血清（Clark Bioscience），RPMI 1640培养基（HyClone）， MTT（Solarbio）。活性氧检测试剂盒、EdU检测试剂盒和Hoechst 33258（碧云天）。β‑actin，LC3B，P62，Beclin1，Bax，Bcl-2，HO-1，AKT，phospho-AKT， mTOR，phospho-mTOR抗体（武汉三鹰），Cleaved caspase-9抗体（Cell Signaling Technology）。

1.3 细胞活力测试

将细胞以4×10³/孔的密度接种到96孔板中，培养过夜后用不同浓度的Lut处理A549细胞，每种浓度设置6个复孔。连续培养48 h后，通过MTT法检测各孔的吸光度值。

1.4 平板克隆

用不同浓度的Lut处理A549细胞48 h。随后，将细胞以1×10³/孔的密度接种到6孔板中进行常规培养，3 d/次更换培养基，14 d后，用含4%多聚甲醛的溶液固定培养板15 min，然后用结晶紫（0.1%）进行染色后拍照^［17］。

1.5 EdU染色

收获对数生长期细胞并接种到6孔板中，培养过夜并使其贴壁，然后用不同浓度的Lut处理细胞48 h。使用BeyoClickEdU细胞增殖试剂盒进行染色后用倒置荧光显微镜拍照。

1.6 ROS检测

细胞处理同1.5。将DCFH-DA工作液加入培养基中并孵育30 min，然后用无血清培养基洗涤细胞3次后使用流式细胞术检测细胞ROS水平^［18］。

1.7 Hoechst33258染色

细胞处理同1.5。使用Hoechst33258染色30 min，并用PBS洗涤2次，在倒置荧光显微镜下观察各处理组细胞核染色情况并拍照。

1.8 MDC染色

细胞处理同1.5。加入MDC染色液避光染色30 min后在倒置荧光显微镜下拍照^［19］。

1.9 Western blotting

将细胞以适当的密度接种到10 cm的皿中培养过夜，然后用不同浓度的Lut处理48 h。Western和IP细胞裂解缓冲液裂解细胞，然后收集上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。等体积上样，10% SDS-PAGE分离蛋白，转膜，用封闭液在室温下封闭2h，与相应的抗体孵育过夜。用相应的二抗室温孵育后，用化学发光成像仪曝光并拍照^［20］。

1.10 统计学方法

使用GraphPad 8.0进行统计分析，组间数据比较采用单因素方差分析。计量数据以均数±标准差表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lut抑制A549细胞的活力和增殖

MTT结果表明，Lut剂量依赖性的抑制A549细胞的活性（P<0.001，图1A）。本研究选择20 μmol/L和40 μmol/L作为后续实验中Lut的处理浓度。而20 μmol/L和40 μmol/L的Lut对Beas-2B细胞的生长不具有抑制作用（图1B）。EdU染色结果表明20 μmol/L和40 μmol/L 的Lut均抑制了A549细胞的增殖（P<0.05，图1C、D）。此外，平板克隆形成结果显示20 μmol/L和40 μmol/L 的Lut都抑制了细胞集落的形成（P<0.01，图1E、F）。

2.2 Lut诱导 A549细胞产生活性氧

ROS流式细胞仪检测结果表明，与对照组相比，40 μmol/L Lut处理组细胞ROS水平上调（P<0.05，图2A、B）。MTT结果表明，用ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理细胞可以缓解Lut诱导的A549细胞损伤（P<0.01，图2C）。

2.3 Lut诱导A549细胞发生凋亡

Hoechst33258染色结果表明，与对照组相比，Lut处理组细胞的细胞核染色亮度增加，出现细胞核的固缩、碎裂和染色质凝聚现象（图3A）。Western blotting结果显示，促凋亡蛋白Bax、Cleaved caspase-9的表达水平增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低（P<0.001，图3B~D）。

2.4 Lut诱导A549细胞自噬

MDC结果显示，与对照组相比，Lut处理组的细胞中检测到具有高亮点状荧光的自噬体的数量逐渐增多，细胞自噬水平上调（P<0.05，图4A、B）。Western blotting结果显示，自噬相关蛋白Beclin1的表达上调，LC3B-II/LC3B-I比值增加，P62的表达水平下降（P<0.001，图4C~F）。

2.5 Lut对A549细胞AKT，mTOR，HO-1蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，与对照组相比，Lut处理抑制了AKT和mTOR的磷酸化，下调了HO-1蛋白的表达（P<0.001，图5A~D）。Lut和LY294002单独处理均可降低细胞中HO-1蛋白的表达，Lut+LY294002处理组HO-1蛋白表达水平进一步降低（P<0.001，图5E、F）。Lut+NAC处理组细胞P-AKT和P-mTOR的蛋白水平高于Lut单独处理组（P<0.05，图5G~I）。

3 讨论

目前，使用膳食中含有的天然植物活性成分逐渐成为控制和治疗癌症的一种安全、有效的方法^{［22， 23］}。Lut可以抑制神经胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、胆管癌细胞等癌细胞的增殖^［14-16］。与这些研究相一致，在本研究中，在同样浓度下，Lut选择性地抑制了A549细胞的活性，抑制了细胞的增殖和克隆形成。

癌细胞内ROS过度积聚可导致氧化应激，破坏氧化还原信号传导，造成生物分子的损害^［24］。由于遗传畸变和多种失调信号通路间复杂的相互作用，癌细胞与正常细胞相比通常具有较高水平的ROS，经常有上调的抗氧化分子来平衡ROS并维持癌细胞中的氧化还原稳态^［25］。ROS的过量产生可能导致癌细胞比正常细胞更早达到氧化应激阈值，通过氧化应激诱导癌细胞死亡。因此，能够引起癌细胞ROS水平升高的一些来源于植物的天然化合物对癌细胞具有选择性靶向作用。比如，血根碱通过诱导肺癌细胞ROS产生引起细胞凋亡，抑制癌细胞的增殖和转移，发挥抗癌作用^［26］；姜黄素调节宫颈癌细胞内ROS水平，诱导自噬和细胞凋亡^［27］。本研究探索了ROS水平改变在植物活性成分Lut对A549细胞的抑制作用中的作用，与对照组相比，Lut可显著增加A549细胞中的ROS水平，用NAC抑制细胞ROS水平后可以显著缓解Lut诱导的A549细胞活力下降。这与Wang等^［28］的研究相一致，在他们的研究中，Lut处理可显著增加神经胶质母细胞瘤U251MG和U87MG细胞内ROS的水平，引起线粒体功能障碍，进而诱发细胞凋亡。随后，本研究检测了Lut对A549细胞凋亡和自噬水平的影响，发现Lut在诱导A549细胞ROS产生的同时显著增强了细胞的凋亡和自噬。

细胞凋亡是一种重要的细胞死亡机制，癌细胞存活和肿瘤进展往往伴随着凋亡功能障碍^［29］。细胞自噬是溶酶体降解真核细胞中细胞内蛋白质和细胞器的生理过程。过度自噬可诱导肿瘤细胞出现自噬性死亡，增强肿瘤细胞对一些化疗药物的敏感性^［30］。一些植物活性成分可通过对癌细胞凋亡和自噬的诱导抑制癌细胞的增殖。比如，鸦胆子种子提取物Bruceine D通过激活MAPK信号通路诱导肺癌A549和H292细胞发生凋亡和自噬，进而抑制细胞的增殖^［9］。苔类植物富含的ent-Kaurane二萜类化合物通过诱导细胞凋亡对多种癌细胞系具有很强的抑制活性^［31］。姜黄素可诱导人宫颈癌SiHa细胞发生细胞凋亡、自噬、细胞周期停滞^［27］。在本研究中，Lut明显诱导了A549细胞的凋亡和自噬。由此推测，在本研究中，Lut对A549细胞增殖的抑制可能是通过对细胞凋亡和自噬的诱导所致。

Bcl-2 相关家族的Bcl-2和Bax可通过内在或外在途径调控细胞凋亡^［32］。半胱天冬酶家族的Caspase-9也是细胞凋亡过程中的关键成分之一，当细胞受到凋亡刺激时，可被活化剪切形成Cleaved caspase-9，导致细胞凋亡^［33］。本研究发现Lut处理下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调了促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-9的表达。这些结果表明，Lut可能是通过对Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-9的调控诱导的细胞凋亡。P62、LC3B和Beclin1都是自噬标志物，蛋白表达水平的改变能反映癌细胞的自噬状态^［34］。自噬过程中，P62、LC3B均被降解，LC3B-II/LC3B-I的比例发生变化。Beclin1分子的表达与Bcl-2蛋白的表达负相关，在自噬起始过程中就与Bcl-2分子分离，具有抑癌作用^［35］。本研究也检测了Lut处理对这些自噬标记蛋白表达水平的影响，发现Lut处理可明显上调Beclin1的表达，下调p62的表达，使得LC3BII/ LC3B-I比例增加，这些也侧面印证了Lut对A549细胞自噬的诱导。

AKT激活后可以磷酸化Nrf2，促进Nrf2的入核，导致抗氧化基因如HO-1等的转录激活，清除过量产生的ROS，发挥抗氧化作用^{［36， 37］}。本研究Lut处理后降低了A549细胞中P-AKT、P-mTOR的表达。为了进一步探讨ROS在Lut抑制AKT/mTOR通路中的作用，本研究检测了用NAC抑制细胞ROS水平后对Lut抑制AKT/mTOR磷酸化的影响，发现NAC显著缓解了Lut对A549细胞 AKT/mTOR磷酸化的抑制。这些结果表明Lut对AKT/mTOR磷酸化的抑制可能是通过对ROS的诱导发挥的作用。有研究表明，抑制AKT/HO-1通路后可促进氧化应激诱导的细胞凋亡^［38］。本研究发现Lut处理在下调P-AKT、P-mTOR的表达的同时也下调了HO-1蛋白的表达，用AKT/mTOR通路抑制剂LY294002可进一步增加Lut对HO-1蛋白表达水平的抑制。此外，AKT是mTOR关键的上游正调控因子之一，后者在调节细胞增殖和自噬之间的平衡中起着至关重要的作用，抑制mTOR能够引起细胞凋亡和自噬的发生^［39］。Yang等^［40］的研究也显示芹菜素可通过抑制AKT/mTOR通路诱导肝癌细胞凋亡和自噬。这些研究与本研究的结果相一致。

综上所述，Lut可通过诱导细胞内ROS的产生，调控AKT/mTOR通路和HO-1的表达，抑制肺腺癌A549细胞的增殖。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究项目(2022AH051454)

安徽省高校自然科学研究项目(2022AH051425)

蚌埠医学院自然科学研究项目(2021byzd030)

蚌埠医学院研究生科研创新项目(Byycx22066)

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