PAD4抑制剂GSK484通过抑制H3Cit表达减轻小鼠脓毒症肺损伤后内皮功能障碍的发生

GSK484, a PAD4 inhibitor, improves endothelial dysfunction in mice with sepsis-induced lung injury by inhibiting H3Cit expression

摘要

目的 探讨PAD4抑制剂（GSK484）对脓毒症后H3Cit表达的抑制作用，并探究其对脓毒症引起的内皮功能障碍的改善效果。 方法 C57BL/6小鼠18只通过盲肠结扎穿孔术（CLP）构建小鼠脓毒症模型，实验分为假手术组，模型组和GSK484治疗组，6只/组，治疗组在术后第2天腹腔注射给予GSK484（4 mg/kg）。ELISA检测小鼠血清VEGF、ESM-1、IL-6、IL-1β水平，HE染色观察肺组织病理学变化，免疫荧光和Western blotting检测各组小鼠肺组织中F-actin、VE-cadherin、ZO-1蛋白表达，Western blotting检测肺组织VE-Cadherin和H3Cit蛋白表达情况。肺组织原代分离培养肺微血管内皮细胞，使用脂多糖（LPS，10 μg/mL）干预24 h构建脓毒症模型。检测细胞成管能力，CCK-8检测细胞增殖，流式检测细胞凋亡，ELISA检测细胞上清中VEGF、ESM-1、IL-6、IL-1β水平。 结果 与假手术组相比，脓毒症小鼠肺组织肺脏血管充血、肺泡断裂、肺泡腔及肺间质水肿、肺泡隔增厚、中性粒细胞浸润等，血清中炎症因子IL-6、IL-1β和内皮细胞因子VEGF、ESM-1含量均升高（P<0.05），肺组织中胞间连接蛋白F-actin、VE-cadherin、ZO-1表达降低，H3Cit蛋白表达升高（P<0.05），GSK484治疗可以有效改善这些变化。LPS诱导肺微血管内皮细胞上清中炎症因子表达量升高、内皮细胞因子VEGF、ESM-1含量均升高（P<0.05），细胞成管能力降低；2.5 μmol/L浓度GSK484处理可降低炎症因子和内皮细胞因子表达（P<0.05）。 结论 GSK484的使用可有效抑制脓毒症后H3Cit表达，进一步改善脓毒症后内皮功能障碍的发生。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of GSK484, a PAD4 inhibitor, on H3Cit expression following sepsis and its effects for improving sepsis-induced endothelial dysfunction. Methods Eighteen C57BL/6 mice were randomized into sham-operated group, sepsis model group and GSK484 treatment group (n=6), and in the latter two groups, models of sepsis were established by cecal ligation and puncture (CLP). The mice in GSK484 treatment group were given an intraperitoneal injection of GSK484 (4 mg/kg) on the second day following the surgery. Twenty-four hours after the injection, the mice were euthanized for measurement of serum levels of VEGF, ESM-1, IL-6 and IL-1β using ELISA. Lung tissue pathology was observed with HE staining, and pulmonary expressions of F-actin, VE-cadherin, ZO-1 and H3Cit proteins were detected using immunofluorescence staining and Western blotting. In primary cultured of mouse lung microvascular endothelial cells, the effect of stimulation with LPS (10 μg/mL) for 24 h on tube formation, proliferation, apoptosis and expressions of VEGF, ESM-1, IL-6 and IL-1β were assessed using CCK-8 assay, flow cytometry and ELISA. Results Compared to the sham-operated mice, the septic mice exhibited significant lung tissue pathologies characterized by vascular congestion, alveolar rupture, edema, and neutrophil infiltration. Serum levels of IL-6, IL-1β, VEGF, and ESM-1 were elevated, pulmonary expressions of F-actin, VE-cadherin, and ZO-1 were decreased, and H3Cit expression was increased significantly in the septic mice. GSK484 treatment effectively mitigated these changes in the septic mice. The LPS-stimulated endothelial cells showed increased productions of IL-6, IL-1β, VEGF and ESM-1, which were significantly reduced after treatment with 2.5 μmol/L GSK484. Conclusion GSK484 treatment effectively suppresses H3Cit expression in septic mice to ameliorate sepsis-induced endothelial dysfunction.

Graphical abstract

关键词

脓毒症 / 肺损伤 / PAD4抑制剂 / 小鼠肺微血管内皮细胞 / 内皮功能障碍 / GSK484

Key words

sepsis / lung injury / PAD4 inhibitor / mouse pulmonary microvascular endothelial cells / endothelial dysfunction / GSK484

脓毒症是宿主对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，脓毒症感染会引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），脓毒症期间肺部特别容易发生损伤^［1］，超过50%的脓毒症患者发生急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征（ARDS）^{［2， 3］}。内皮功能障碍作为脓毒症的病理基础，是演变为多器官功能障碍的核心环节，内皮相关的蛋白和分子发生一系列改变，最终导致机体发生凝血功能紊乱等。因此，血管内皮细胞可能是抑制和预防脓毒症相关器官功能障碍的重要靶点。脓毒症的早期诊断至关重要，及时干预可以降低死亡率。中性粒细胞被认为是脓毒性感染期间先天免疫系统关键的组成部分之一^［4］，中性粒细胞细胞外陷阱（NETs）是由核染色质、组蛋白、颗粒状抗菌蛋白和一些细胞质蛋白组成的复杂结构^［5］，NET的形成与各种疾病状态（如自身免疫性疾病）以及脓毒症有关，这表明它们会导致过度炎症和组织损伤^{［6， 7］}。瓜氨酸化组蛋白H3（H3Cit），已被确定为NETs的组成成分，作为中性粒细胞对感染的反应的一部分释放到细胞外间隙^［8］，H3Cit也可作为脓毒性肝损伤中中性粒细胞胞外陷阱的早期生物标志物^［9］。有临床实验数据表明，脓毒症患者的NETs标志物H3Cit水平升高^［10］。有研究H3Cit在介导微血管内皮屏障功能障碍中的作用，发现H3Cit可能直接影响内皮屏障的损伤，并通过破坏微血管内皮屏障直接促进炎症损伤^［11］，H3Cit也可作为检测脓毒症中严重肝损伤的生物标志物，抑制其表达对预防NETs引起的肝功能障碍^［12］。

肽基拉金氨酸脱胺酶4（PAD4）通过靶组织蛋白H3、H4和H2A的高柠檬酸化介导染色质脱粘，在NET形成中具有调节作用^［13］，PAD4敲除的小鼠在出血性休克和脓毒症中可以受到保护，免受肺损伤。同样，通过其抑制剂靶向PAD4可降低NET形成，并改善脓毒症小鼠的生存率^［14］。当小鼠被PAD抑制剂氯-酰胺（Cl-Amidine）处理时，降低了激活的中性粒细胞释放NETs的能力，瓜氨酸化被调节，提高脓毒症小鼠的存活率^［11］，表明PAD4的化学抑制剂有利于降低脓毒症的死亡率。尽管很多研究表明PAD4介导的中性粒细胞在脓毒症疾病的作用，但仍没有特异性抑制剂来研究脓毒性感染期间NET抑制与随后的内皮损伤改善之间的直接相关性。GSK484是一种有效且可逆的PAD4抑制剂。GSK484高亲和力与可与PAD4结合抑制其蛋白功能。

因此，本研究拟采用一种特异性PAD4抑制剂GSK484，体内体外实验探究GSK484的使用是否可有效抑制脓毒症后H3Cit表达，并进一步阻止脓毒症后内皮功能障碍的发生。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠18只，购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（苏）2018-0008；所有小鼠被置于12 h∶12 h的光照-黑暗循环环境下，适宜的温度为23 ℃，相对湿度为50%~60%，并自由获取水和食物。本实验按照实验动物护理和使用的指导方针进行，并经长沙市第一医院伦理委员会批准，伦理批号：（2021）伦审［临研］第（93）号。

1.2 试剂与材料

实验试剂：GSK484（MCE）；LPS（Solarbio）；小鼠白介素β（IL-1β）试剂盒、小鼠白介素6（IL-6）试剂盒、小鼠血管内皮生长因子（VEGF）试剂盒（联科）；小鼠内皮细胞特异性因子（ESM-1）试剂盒（酶联）；F-actin抗体（1∶200）、ZO-1抗体（1∶200）；VE-Cadherin抗体（1∶1000）、H3Cit抗体（1∶2000）、PAD4抗体（1∶500）；超纯RNA提取试剂盒（CW0581M，CWBIO）；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒（KGA317，凯基生物）。

1.3 动物模型及治疗

使用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症诱导的ALI模型，根据之前的研究方法并进行了一些改进^［6］，由中洪博元构建动物模型。小鼠进行麻醉后消毒，取腹正中切口1.5 cm。找出盲肠，用3-0线结扎一半盲肠，用18号针头穿刺盲肠稍微挤压一小滴粪便，将盲肠重新放于腹腔。假手术组只进行开关腹，不进行结扎，术后皮下注射1mL生理盐水以补充体液。造模后48 h后，假手术组和模型组随机选2只HE染色观察肺组织病理学变化是否造模成功，治疗组术后第2天按照4 mg/kg腹腔注射GSK484 ^［15］，治疗后24 h观察小鼠生存率。给药24 h后处死各组小鼠，取肺组织和血清（小鼠处死取血，静置，离心取血清）进一步分析。

1.4 细胞与培养

小鼠肺微血管内皮细胞，中洪博元动物实验室提供C57BL/6小鼠取肺组织，采用组织块法获取原代小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC），取出肺组织放入培养基中，用微型镊去除肺组织表面的脏层胸膜，反复冲洗后用外科剪取出肺组织的边缘部分，放入含1 mL胎牛血清的培养基中，并使用微型剪将边缘肺组织剪成约1.5 mm×1 mm×1 mm的组织块，将培养皿置于37 ℃，5%CO₂的细胞培养箱内30 min。吸取培养基皿中的组织块接种于24孔细胞培养板中，按照10块/孔进行接种，接种完毕后将24孔板细胞培养板倾斜放入培养箱中固化。1 h后按照200 μL/孔加入RPMI 1640（含20%FBS，90 U肝素钠，青霉素100 U及链霉素100 U）。第2天按照1 mL/孔加入培养基。贴块60 h后将组织块去除，并更换条件培养基RPMI 1640。取第3代PMVEC，采用免疫荧光法检测细胞中CD31表达。将细胞培养至对数生长期，给予0、5、10、20、40 µmol/L GSK484处理细胞3 h，CCK-8 检测细胞增殖情况，筛选出2.5、10 µmol/L GSK484进行后续实验。采用不同浓度的LPS（0、10、20、40 µg/mL），确定10 μg/mL LPS可诱导24 h构建脓毒症细胞模型。确定造模条件以及GSK484处理浓度，细胞实验分为对照组、10 μg/mL LPS组、10 μg/mL LPS+2.5 µmol/L GSK484组和10 μg/mL LPS+10 µmol/L GSK484组。作用结束后，收集各组细胞进行下一步检测分析。

1.5 肺组织HE染色及免疫荧光

小鼠肺组织组织用4%多聚甲醛固定过夜，并进行石蜡包埋。使用切片机（BQ-318D，伯纳）将石蜡块切成5 μm切片，用苏木精和伊红（HE）染色，采用显微镜（CX43，OLYMPUS）进行拍照。对于VE-Cadherin、ZO-1和F-actin免疫荧光，肺组织切片进行抗原修复、封闭后，分别加入VE-Cadherin、ZO-1和F-actin抗体4 ℃孵育过夜，然后在室温下滴加稀释好的荧光二抗Cy3，湿盒中37 ℃孵育45 min。复染核，滴加DAPI避光孵育3 min，对标本进行染核，用PBS冲洗多余的DAPI，冲洗1 min。用吸水纸吸干玻片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜（CKX53，OLYMPUS）拍照。根据中性粒细胞浸润程度、肺泡和间质水肿、肺组织出血程度记录评分。0分，肺正常；1分，轻度肺损伤（小于25%的损伤）；2分，中度肺损伤（25%~50%的损伤）；3分，广泛性肺损伤（50%~75%的损伤）；4分，极端肺损伤（大于75%的损伤）。将各标准的个体得分相加，作为最终的肺损伤评分。

1.6 ELISA实验

CLP术后24 h收集小鼠血清，收集各组小鼠肺微血管内皮细胞上清，使用ELISA试剂盒，严格按照试剂盒测定说明书进行实验操作，测定血清中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、内皮细胞特异性分子-1（ESM-1）、炎症因子IL-6、IL-1β水平。

1.7 Western blotting

术后24 h收集小鼠肺组织，加入裂解液，进行蛋白提取。提取好的总蛋白取一部分加入上样缓冲液进行加热变性（100 ℃，5 min），利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1~2 h，湿法转膜30~50 min。4 ℃孵育一抗［Mouse Monoclonal Anti-Actin（1∶2000）、VE-Cadherin（1∶1000）、H3Cit（1∶2000）］溶液过夜；室温孵育二抗［IgG（H+L）（1∶2000）］1~2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用全自动化学发光图像分析系统（Tanon-5200，上海天能）对蛋白进行可视化，用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值，使用Image J软件用密度法定量蛋白质水平，分别使用Actin进行归一化。

1.8 RT-PCR检测

细胞收集于培养皿中，吸除培养皿中的细胞培养液，使用Trizon Reagent试剂及mRNA超纯提取试剂盒提取总mRNA，利用紫外可见分光光度计测定mRNA的浓度和纯度（A_{260 nm}/A_{280 nm}），通过mRNA逆转录试剂盒合成cDNA，利用荧光PCR仪（CFX Connect™实时，Bio）进行荧光定量PCR。反应体系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free dH₂O 8.2 μL。反应步骤如下：预变性95 ℃ 10 min；变性95 ℃ 10 s；退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s；40个循环。β-actin作为内参，基因的相对表达量根据2^-△△Ct法计算。引物在通用生物（安徽）股份有限公司合成，序列如表1。

1.9 细胞成管实验

将预处理的微血管内皮细胞悬浮于培养基中，接种至有Matrigel涂层的培养板中，于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养，培养14 d。期间使用倒置显微镜观察管腔形成的动态变化。为了定量分析内皮细胞的管腔形成情况，常采用图像处理软件ImageJ进行分析。定量参数包括管腔长度及管腔结点数量，反映内皮细胞成管能力。

1.10 统计学方法

所有数据均用 GraphPad Prism 8.0软件作图，采用SPSS 19.0软件进行处理分析，数据以均数±标准差表示。并根据多重比较的需要，使用Student's T-test或单因素方差，并对正态分布数据进行事后Tukey分析。对于非正态分布的数据，采用Mann-Whitney非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脓毒症诱导的小鼠肺组织病理形态观察

CLP手术引起了明显的病理改变，包括支气管扩张充血、肺泡断裂、肺泡腔及肺间质水肿、肺泡隔增厚、中性粒细胞浸润、大量炎性细胞浸润等，而GSK484治疗改善了CLP诱导的肺损伤（P<0.05，图1）。

2.2 各组脓毒症诱导的小鼠血清中血管内皮相关因子和炎症因子变化

与假手术组相比，脓毒症模型组小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6，血管内皮因子VEGF和ESM-1含量均上升（P<0.05）；与模型组相比，GSK484治疗组小鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6，血管内皮因子VEGF和ESM-1含量均下降（P<0.05，图2）。

2.3 免疫荧光检测各组脓毒症诱导的小鼠肺组织中F-actin、VE-cadherin和ZO-1表达比较

与假手术组相比，脓毒症模型组小鼠肺组织中F-actin、VE-cadherin、ZO-1表达均下降（P<0.05）；与模型组相比，GSK484治疗组小鼠肺组织中F-actin、VE-cadherin、ZO-1表达均上升（P<0.05，图3）。

2.4 Western blotting检测各组脓毒症诱导的小鼠肺组织中VE-Cadherin和H3Cit表达比较

与假手术组相比，脓毒症模型组小鼠肺组织中VE-Cadherin表达下降（P<0.05），H3Cit表达量上升；与模型组相比，GSK484治疗组小鼠肺组织中VE-Cadherin表达上升（P<0.05），H3Cit表达下降（P<0.05，图4）。

2.5 原代分离小鼠肺微血管内皮细胞免疫荧光鉴定

新生小鼠饲养至7 d龄，取肺组织原代分离培养小鼠肺微血管内皮细胞，免疫荧光鉴定CD31成功（图5）。

2.6 GSK484和LPS作用浓度筛选

当GSK484浓度达20、40、80 μmol/L时，细胞存活率下降（P<0.05，图6A），选择GSK484对细胞活性无影响的浓度，低浓度选择2.5 μmol/L，高浓度选择10 μmol/L。10、20、40 μg/mL浓度的LPS处理后，细胞中炎症因子IL-6、IL-1β的转录水平均上升（P<0.05，图6B），根据qPCR结果LPS浓度确定为10 μg/mL。

2.7 GSK484预处理对LPS诱导脓毒症细胞模型成管能力影响

与正常对照组相比，LPS处理组管腔结数量下降，管腔总长度下降（P<0.05），细胞成管能力下降；与LPS处理组相比，2.5 μmol/LGSK484预处理组管腔结数量无明显变化，管腔总长度上升（P<0.05），细胞成管能力有所恢复；10 μmol/L GSK484预处理组管腔结数量增加，管腔总长度上升（P<0.05），细胞成管能力增强（图7）。

2.8 GSK484预处理对LPS诱导脓毒症细胞上清中血管内皮相关因子和炎症因子水平影响

与正常对照组相比，LPS处理组与10 μmol/L GSK484预处理组细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-6，血管内皮因子VEGF和ESM-1含量均上升（P<0.05）；与LPS处理组相比，2.5 μmol/L GSK484预处理组细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-6，血管内皮因子VEGF和ESM-1含量均下降（P<0.05，图8）。

3 讨论

内皮细胞屏障连接的破坏是脓毒症患者多器官损伤和死亡的重要原因^［16］。临床证据表明脓毒症患者通常会出现进行性组织和体腔水肿，这表明血管通透性普遍增加^{［17， 18］}，因此，寻找改善内皮功能障碍的靶点机制研究是十分有必要的。本研究证明了PAD4抑制剂GSK484可以通过影响中性粒细胞标志因子H3Cit表达从而对脓毒症肺损伤后内皮功能障碍进行改善。

ALI是脓毒症的一个关键特征，其特点是炎症加剧以及中性粒细胞过度流入肺部^{［19， 20］}。中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞和内皮细胞释放的炎症介质级联导致ALI发病过程中肺微血管通透性和间质性和肺泡性肺水肿的增加^［21］。本研究显示进行CLP手术后，小鼠肺组织除了发生支气管扩张充血、肺泡断裂及间质水肿等损伤，还有中性粒细胞浸润，气管周围伴有炎性细胞浸润，而GSK484可以改善这种病理损伤，我们的数据表明GSK484介导的NET阻断导致肺组织中中性粒细胞浸润减少，这表明脓毒症诱发的NET可能通过正反馈回路发挥趋化作用以增强中性粒细胞的肺组织浸润。这与无菌中性粒细胞炎症密切相关的其他疾病状况的发现一致。

脓毒症血液中高表达水平的促炎细胞因子IL-1β、IL-6，从而引发全身性炎症^［22-24］。血管内皮生长因子（VEGF）是控制血管通透性的关键分子，脓毒症早期VEGF增高，致微血管通透性增加，毛细血管渗漏，加重炎症反应。内皮细胞特异性分子-1（ESM-1）可以影响白细胞粘附和外渗，促进白细胞和内皮细胞的黏附，在脓毒症患者血液中会异常高表达^［25］。通过降低炎症因子及内皮生长因子和内皮细胞特异性分子可以使脓毒症得到改善。本研究中，小鼠在经过CLP手术后，会导致血清中炎症因子IL-1β、IL-6和内皮细胞因子VEGF、ESM-1过度表达，这与前人研究结果一致^［26］，经LPS作用后的肺微血管内皮细胞中炎症因子的表达量也是显著上升的，而GSK484可以降低CLP脓毒症小鼠血清中以及内皮细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和内皮细胞因子VEGF、ESM-1的表达，这表明GSK484可以改善脓毒症的全身炎症反应及内皮损伤。

血管内皮钙黏附蛋白（VE-cadherin）、紧密连接蛋白（ZO-1）和肌动蛋白（F-actin）是内皮粘附连接的主要细胞-细胞粘附分子，可以稳定维持内皮细胞屏障功能^{［27， 28］}。我们观察到在脓毒症小鼠肺组织中VE-cadherin、ZO-1和F-actin蛋白表达量降低，而GSK484可以逆转这种抑制作用，上调VE-cadherin、ZO-1和F-actin，改善内皮细胞通透性。LPS诱导的肺微血管内皮细胞成管能力下降也可以被GSK484改善。

GSK484介导的中性粒细胞激活阻断是通过与PAD4结合抑制其蛋白功能，通过抑制H3Cit表达，降低中性粒细胞释放NETs的能力。Molinaro R等研究发现PAD4抑制剂GSK484的减少了内膜损伤部位的NET积累，并保持了内皮的连续性^［29］，这与我们的研究结果一致。本研究中脓毒症小鼠肺组织中H3Cit表达升高，GSK484处理后可以抑制H3Cit表达，这是因为GSK484亲和性与PAD4结合，阻断下游信号通路的激活，抑制中性粒细胞形成，抑制H3Cit表达，并改善脓毒症感染期间的内皮功能障碍。

综上所述，本研究通过脓毒症小鼠体内实验发现GSK484对脓毒症致ALI小鼠具有一定治疗作用，能改善小鼠肺组织病变；通过LPS诱导肺微血管内皮细胞损伤体外实验也证实GSK484的使用有效抑制LPS对肺微血管内皮细胞的损伤，该作用机制是GSK484作为一种PAD4抑制剂，在脓毒症模型中，可有效抑制其下游H3Cit表达，进一步改善脓毒症后内皮功能障碍。

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基金资助

长沙市自然科学基金(Kq2202010)

睿意急诊医学研究专项基金(R2020009)

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