SLC2A1抑制肺腺癌铁死亡并促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭

High expression of SLC2A1 inhibits ferroptosis and promotes proliferation and invasion of lung adenocarcinoma cells

摘要

目的 探讨细胞能量代谢中的葡萄糖转运蛋白SLC2A1对肺腺癌增殖和迁移能力的影响及其分子机制。 方法 分析TCGA数据库中SLC2A1基因在肺腺癌正常组织和肿瘤组织中的表达差异及其对预后的影响。收集我院临床肺腺癌患者的肿瘤组织和癌旁配对组织，进行免疫组化染色，分析SLC2A1蛋白在肿瘤中的表达水平。验证肺腺癌肿瘤组织和癌旁组织中SLC2A1蛋白的表达差异，探讨该蛋白与患者临床病理特征之间的关系。体外构建稳定过表达和稳定干预SLC2A1基因的细胞系，通过Western blotting实验和qRT-PCR实验验证干预效果。采用CCK-8和Transwell实验体外验证细胞表型，明确其对肿瘤细胞增殖、迁移能力的影响。检测干预SLC2A1后细胞的铁死亡和细胞自噬相关蛋白的表达水平，并通过ROS荧光染色、Fe²⁺荧光染色明确铁死亡的发生过程。 结果 与正常肺组织相比，SLC2A1在肺腺癌肿瘤组织中高表达（P<0.05），且与肺腺癌患者的病理参数及不良预后相关（P<0.05）。与对照组相比，过表达SLC2A1，细胞中该基因上调（P<0.05），细胞增殖活性增加（P<0.05），细胞侵袭和迁移能力增强（P<0.05）。干预SLC2A1基因表达后，细胞死亡比例增加（P<0.05），侵袭和增殖能力均被抑制（P<0.05）。干预SLC2A1激活了铁死亡，GPX4、xCT等铁死亡指标表达下调，细胞内ROS累积，Fe²⁺增多（P<0.05）。同时检测到细胞自噬的发生，LC3B增加，且这一过程可被3-MA挽救。 结论 SLC2A1在肿瘤组织中高表达且与不良预后有关。靶向抑制SLC2A1可以促进肺腺癌中的铁死亡和自噬发生，有望成为肺腺癌诊断和治疗的新潜在分子靶点。

Abstract

Objective To examine how the glucose transporter SLC2A1 influences the proliferation and migration of lung adenocarcinoma (LUAD) and explore the underlying molecular mechanisms. Methods We examined the differential expression of SLC2A1 between normal and LUAD tissues in the TCGA database and its prognostic implications. Immunohistochemistry was used to detect SLC2A1 protein levels in clinical samples of LUAD and adjacent tissues, and the association of SLC2A1 expression levels with clinicopathological features of the patients was analyzed. In PC9 cells with stable SLC2A1 overexpression or knockdown, the effects of SLC2A1 expression level on cell proliferation and migration were assessed using CCK-8 and Transwell assays, and the changes in expressions of ferroptosis- and autophagy-related proteins were measured; the occurrence of ferroptosis was confirmed using ROS and Fe²⁺ fluorescence staining. Results SLC2A1 expression was significantly higher in LUAD tumor tissues than in normal lung tissues (P<0.05) and was associated with worse pathological parameters and prognosis of the patients (P<0.05). In PC9 cells, SLC2A1 overexpression significantly promoted cell proliferation, invasion and migration, and SLC2A1 knockdown significanty increased cell death and inhibited cell invasion and proliferation. SLC2A1 knockdown caused obvious activation of cell ferroptosis, reduced GPX4 and xCT expressions, and increased intracellular levels of ROS and Fe²⁺. SLC2A1 knockdown also resulted in increased cell autophagy shown by increased LC3B expression, which could be reversed by treatement with 3-MA. Conclusion High SLC2A1 expression is correlated with poor prognosis of patients with LUAD, and inhibiting SLC2A1 can induce ferroptosis and autophagy of LUAD cells, suggesting the potential of SLC2A1 as a target for LUAD diagnosis and treatment.

Graphical abstract

关键词

肺腺癌 / 葡萄糖转运蛋白1 / 铁死亡 / 细胞自噬

Key words

lung adenocarcinoma / glucose transporter 1 / ferroptosis / autophagy

肺癌的发病率及死亡率均居于恶性肿瘤前列^［1］，其组织学类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC），肺腺癌是NSCLC最常见的病理类型^［2］。手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗及联合治疗等方案在一定程度上改善了肺腺癌患者的预后，然而由于多数患者会产生耐药，肺腺癌患者的5年生存率仍不足20%^［3］，亟需寻找新的治疗靶点。

SLC2A1是细胞能量代谢途径中的关键蛋白，也称为葡萄糖转运蛋白1。其主要功能是当细胞内葡萄糖浓度较低时，通过促进葡萄糖分子进入质膜为细胞提供葡萄糖^［4］。由于葡萄糖的摄取是糖酵解中的第一个限速步骤，SLC2A1在多种肿瘤组织中高表达^［5-8］。铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡方式^［9］，与细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬和焦亡等其他形式的细胞死亡不同，铁死亡由铁累积、脂质过氧化及质膜损伤共同触发^［10］。铁死亡与肿瘤的发生发展密切相关，多种癌蛋白、肿瘤抑制因子和致癌信号转导途径可以调节铁死亡^［11］。SLC2A1也是铁死亡的主要调节因子，SLC2A1可通过促进GPX4表达抑制结直肠癌细胞发生铁死亡^［12］。然而SLC2A1在肺腺癌铁死亡中的作用尚未见报道，有待进一步探索。

本研究通过分析肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中SLC2A1在肺腺癌的表达情况和预后价值，探究SLC2A1与肺腺癌发生进展的关系。在此基础上，本研究通过慢病毒载体系统在人肺癌细胞株中过表达和敲低SLC2A1基因，研究SLC2A1对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响；进一步对肺腺癌中SLC2A1是否通过调控铁死亡参与肿瘤进展进行探究，为肺腺癌的临床治疗提供新的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人肺腺癌细胞系PC9（普诺赛）；RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清、胰酶、双抗（Gibco）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR实时荧光定量PCR试剂盒（诺唯赞）；SLC2A1抗体（Proteintech 21829-1-AP Western blotting 1∶1000 免疫组化 1∶200）、GPX4抗体（Proteintech 30388-1-AP 1∶1000）、GAPDH抗体（Proteintech 10494-1-AP Western blotting 1∶2000 免疫组化 1∶200）、xCT抗体（abcam ab307601 1∶1000）、SLC3A2抗体（abcam ab307587 1∶1000）、LC3B抗体（CST 2775 1∶1000）、P62抗体（CST 23214 1∶1000）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher）；多功能酶标仪（Biotek）；实时荧光定量PCR仪、全自动化学发光成像仪（Bio-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 生信分析

从TCGA数据库中收集516例肺腺癌患者和59例正常肺组织样本的RNA-seq数据和临床数据。根据SLC2A1蛋白在肺腺癌患者中的表达中位数，将肿瘤患者分为高表达SLC2A1组（n=253）和低表达SLC2A1组（n=263）。使用R 4.0.3对SLC2A1在肺腺癌和正常组织样本的表达进行统计分析。R软件包pROC用于绘制ROC曲线，以验证SLC2A1对肺腺癌的诊断价值。

1.2.2 细胞培养

PC9细胞在包含10%血清、1%双抗的RPMI 1640培养基中培养，孵箱环境为37 ℃、5% CO₂。

1.2.3 慢病毒载体构建

根据NCBI序列，设计SLC2A1的shRNA引物和过表达引物，由博迈德公司合成引物；对引物进行退火后，转化至TOP10感受态细胞内，冰浴30 min后，热激90 s，之后冰上反应5 min，完成转化过程；37 ℃摇床过夜，对测序结果正确的序列进行质粒提取；在293TN细胞中完成病毒包装实验，选取工具质粒（PAX2和VSVG）与目的质粒按照比例混合，采用Jet Primer的试剂盒完成病毒包装实验，于48 h、72 h后分别收取293TN细胞上清，采用滤膜（0.22 μm）过滤后放-80 ℃保存；在六孔板中转染病毒，选对数生长期的细胞，加入1 mL病毒和1 mL培养基，添加聚凝胺促转染，培养24 h后添加嘌呤霉素筛选转染成功的细胞；72 h后收细胞进行Western blotting和qRT-PCR实验验证效率。

1.2.4 Western blotting实验

将样本经过研磨及转染处理后进行超声破碎，加入RIPA高效裂解液，提取组织或细胞中的总蛋白。取25 μg蛋白配置成上样体系，经过沸水浴变性后，采用SDS-PAGE凝胶进行电泳。通过湿转法将电泳分离的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜在室温条件下用5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗（SLC2A1、GPX4、xCT、SLC3A2、LC3B、P62），并在4 ℃条件下孵育过夜。孵育完成后，洗膜，并在室温条件下用二抗（HRP标记的羊抗兔，GAPDH）孵育1 h。再次洗膜后，使用ECL化学发光液进行显色，并在全自动化学发光仪中进行显影拍照。导出各泳道蛋白的灰度值，以GAPDH为内参计算目的蛋白的相对表达水平。每组样本重复3次。

1.2.5 qRT-PCR实验

收集目的样本后采用Trizol法提取总RNA，随后将RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，在RT-qPCR仪上进行扩增反应，反应总体积为20 μL，包含特定比例的SYBR、FAST、qPCR Master Mix、上下游引物、cDNA和无酶水。SLC2A1的上游引物为：GGCCAAGAGTGTGCTAAAGAA；下游引物为：ACAGCGTTGATGCCAGACAG；GAPDH的上游引物为：ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA；下游引物为：TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA。反应条件为95 ℃预变性3 min，随后进行40个循环的扩增（95 ℃变性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s），每个样本设置3个复孔。实验结束后，采用2^-ΔΔCT法（以GAPDH作为内参）计算基因相对表达水平。

1.2.6 CCK-8实验

检测细胞增殖活性，将2000个细胞种植在96孔板，待贴壁后添加CCK-8试剂20 μL，放入孵箱反应2 h，采用分光光度计检测吸光度，明确初始吸光度处于同一基线后，分别于24、48、72、96 h检测吸光度，方法同上。使用酶标仪测量各孔的吸光度值A_450nm，表示各组细胞的增殖活性。

1.2.7 划痕实验

检测细胞迁移能力，将20000个细胞铺板在6孔板内，待细胞贴壁并成单层汇合状态后，开始划痕实验。使用枪头对细胞做垂直十字划线，确保划线竖直；划线后12、24、36 h观察细胞迁移情况。明场下拍照，分析不同组细胞的侵袭能力差异，实验重复3次，确保结果均一性。

1.2.8 Transwell实验

取转染后的各组细胞，用不含FBS的培养液重悬，然后取100 μL细胞重悬液（细胞数10 000）接种于Transwell上室，同时在下室加入含FBS的培养液，培养48 h后进行处理。处理包括弃去培养液，用棉签擦去上层细胞，并用甲醛固定，加入结晶紫染色30 min后漂洗干燥。小心除去Transwell小室内未发生迁移的细胞，最后在显微镜下统计每个视野中的细胞数目，计算迁移或侵袭细胞数目比例，分析细胞的迁移与侵袭能力。

1.2.9 活性氧（ROS）染色

取处理好的细胞，以20 000/孔接种在6孔板，细胞密度约60%~70%，使用ROS检测试剂盒（碧云天）对细胞进行ROS检测，随后在荧光显微镜下观察ROS产生情况。每组样本重复3次。

1.2.10 Fe²⁺染色

检测细胞内亚铁离子累积情况，使用亚铁离子检测试剂盒（碧云天）对12孔板内处理好的细胞进行检测，按照1∶2000的比例添加，观察亚铁离子浓度，反应30 min后在荧光显微镜下记录。每组样本重复3次。

1.2.11 细胞死亡流式分析

取转染后的各组细胞，以20 000/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h后收集细胞。将细胞以500 g的离心力离心5 min，弃去上清液，随后在沉淀内加入1 mL预冷的PBS重悬细胞，再次以500 g的离心力离心5 min，并弃去上清液。随后加入500 μL的1×Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的碘化丙啶（PI），充分混匀后，在室温条件下避光孵育15 min。最后，采用流式细胞术检测细胞的死亡比例。

1.2.12 免疫组化

纳入2017~2022年在我院就诊且手术的207例肺癌患者，选取通过病理验证为肺腺癌的肿瘤组织样本以及正常肺组织样本。 研究已通过我院伦理委员会审核（伦理批号：S2024-377-01），所有患者均签署知情同意书。

所有样本取材均严格遵守标准流程：新鲜组织离体后10~15 min放入液氮，低温分离后部分用于蛋白提取，部分进行福尔马林浸泡 24 h，行脱水和石蜡包埋流程，切片后进行免疫组化实验。对切片组织进行脱蜡和水化，梯度处理后进行抗原修复和封闭，添加一抗（SLC2A1）和二抗（GAPDH），采用DAB显色，明确染色情况后进行复染和封片，采用显微镜观察着色情况，请病理科专家进行免疫组化评分，按照“染色强度结合阳性细胞数乘积”计算，并根据不同强度积分：

染色强度评分：0分=无着色；1分=浅黄或浅棕色；2分=黄棕色；3分=深黄色或深棕色。阳性细胞评分：0分=无细胞着色；1分=0%~25%；2分=26%~50%；3分=51%~75%；4分=76%~100%。计算方式为：（细胞评分1×1）+（细胞评分2×2）+（细胞评分3×3），满分300分。

1.3 统计学分析

采用 SPSS22.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，计数资料采用中位数（四分位间距）表示。计量资料两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；采用Log-rank检验和Kaplan-Meier曲线比较组间生存差异，并将截止值设置为SLC2A1的中位表达水平；使用Spearman相关分析描述非正态分布资料之间的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC2A1在肺腺癌和肺腺癌细胞系中的表达水平

SLC2A1在肺腺癌组织中的表达水平高于正常肺组织样本（P<0.0001，图1A）。SLC2A1的表达量在不同T分期亚组之间存在差异（P<0.05，图1B）。qRT-PCR验证实验结果显示，SLC2A1在肺腺癌细胞系PC9中的表达量高于支气管上皮细胞系BEAS-2B（P<0.0001，图1C）。

分析516例肺癌患者的临床数据提示，肺腺癌患者中65岁以下患者高表达SLC2A1的比例较高（P<0.0001），肿瘤直径大于4 cm的肺腺癌患者更容易高表达该基因（P=0.0351，表1）。

2.2 SLC2A1在肺腺癌中的诊断和预后价值

受试者工作特征（ROC）曲线显示SLC2A1具有良好的肺腺癌诊断价值，曲线下面积（AUC）为0.961（95% CI：0.945~0.977，图2A）。与SLC2A1低表达组相比，SLC2A1高表达组患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）均较差（OS：HR=1.969，95% CI=1.46~2.657，P=9.18e^-6；DFS：HR=1.546，95% CI=1.174~2.036，P=0.002）。单因素和多因素回归分析结果显示，SLC2A1高表达的肺腺癌患者预后差（HR>1，表2、3），作为独立的预后评估指标。

2.3 SLC2A1蛋白在肿瘤组织中高表达

肺腺癌患者与其对应的癌旁组织染色并比较SLC2A1蛋白的表达情况，结果显示SLC2A1在肿瘤组织中高表达，差异有统计学意义（P<0.0001，图3）。

2.4 干预SLC2A1抑制肺腺癌细胞增殖转移能力

根据Cell atlas分析结果，选取PC9进行敲底实验，通过Western blotting和qRT-PCR技术验证了干预SLC2A1的敲底效率（图4A、B）。CCK-8实验显示，干预SLC2A1后细胞增殖能力下降（P<0.001，图4C）。细胞划痕和Transwell实验结果显示，干预SLC2A1后，肿瘤细胞侵袭和迁移能力下降（P<0.01，图4D、E）。

2.5 过表达SLC2A1促进肺腺癌增殖转移

构建稳定过表达SLC2A1的细胞株，通过Western blotting和qRT-PCR技术验证了过表达效率（图5A、B），明确肿瘤细胞中稳定过表达SLC2A1。CCK-8实验结果显示过表达该基因后细胞增殖能力上调（P<0.01），Transwell实验显示处理组能促进肿瘤细胞侵袭能力（P<0.01，图5C、D）。

2.6 SLC2A1调控自噬和铁死亡过程参与肿瘤进程

干预SLC2A1后能抑制GPX4和xCT的表达（图6A）。铁死亡相关检测指标验证结果显示，处理组Fe²⁺累积，ROS增加，线粒体内的Fe²⁺累积（P<0.01，图6B~D）。干预该基因后自噬被激活（图6E），细胞发生自噬，加入自噬抑制剂3-MA后，干预SLC2A1诱导的细胞死亡表型部分挽救（图6F）。细胞死亡流式分析显示，干预SLC2A1后细胞死亡比例增加（图6G）。

3 讨论

肺腺癌是肺癌最常见的病理类型，由于肺腺癌起病隐匿，多数患者在诊断时已处于中晚期，总体预后不佳^［13］。虽然靶向治疗为肺腺癌治疗带来了曙光和机遇，然而存在大量患者无驱动基因突变，而无法接受靶向治疗^［14］。目前关于如何降低肺腺癌患者耐药性、靶向肺腺癌细胞发生调控性死亡成为主要的研究思路，为后续药物转化和治疗提供可能性。

本研究通过分析TCGA数据库中肿瘤组织样本及临床信息，发现SLC2A1在肺腺癌组织中高表达，并与患者的不良预后相关。ROC曲线显示SLC2A1诊断肺腺癌的AUC值为0.961，表明SLC2A1在肺腺癌诊断方面具有潜在价值。SLC2A1在其他肿瘤被报道与糖代谢有关^［15］，但尚未见报道铁死亡等机制研究。

本文讨论了SLC2A1作为葡萄糖代谢过程中的关键酶，在肺腺癌发生发展中的具体促进机制，并通过铁死亡和自噬解释了高表达SLC2A1蛋白患者抵抗死亡的机制。分析病理组织的免疫组化染色结果发现，肺腺癌患者中的SLC2A1蛋白表达远高于正常组织，同时TCGA数据库分析发现该分子表达与不良预后相关。在体外模型中干预SLC2A1发现其能显著抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，提示该基因的促癌作用；同时过表达SLC2A1能促进增殖转移，表明该分子可能作为潜在的治疗和诊断靶点。本研究发现该分子可能参与铁死亡过程，通过铁死亡相关指标检测发现，干预SLC2A1促进肺腺癌细胞发生自噬与铁死亡，细胞内ROS累计，亚铁离子上调，表明可以通过靶向该分子诱导肺腺癌细胞死亡。

自铁死亡被发现以来，有关其参与细胞命运的研究逐渐增多。脂质过氧化作为铁死亡介导的主要驱动因素之一，是当前杀伤肿瘤细胞的重要靶点^［16］。Erastin被发现可以作为特异性抑制system Xc-的铁死亡诱导剂^［17］。该类诱导剂引起抗氧化系统失活，诱导细胞发生过氧化性反应，展现出较好的治疗前景，但Erastin在体内代谢不稳定，因此开发了改进的Erastin类似物例如哌嗪-Erastin和咪唑-Erastin^［18］。近年来，铁死亡靶向肿瘤死亡成为新的治疗肿瘤的研究思路，多项研究表明促进肿瘤细胞发生铁死亡可以治疗耐药肿瘤模型。肝癌、结直肠癌、胃癌、肺癌中铁死亡发生较常见，不同类别肿瘤细胞可因不同的铁死亡机制而死亡，因此，靶向肿瘤细胞发生铁死亡成为了新的治疗方向。低密度脂蛋白被发现能促进脂质过氧化物的表达诱导肝癌细胞发生铁死亡；索拉菲尼作为治疗肝癌的蛋白激酶抑制剂，能通过抑制System Xc-的功能，诱导肝癌细胞铁死亡^［19-21］。在胃癌中，Erastin抑制System Xc-活性，引起ROS的积累，损坏细胞DNA或RNA，诱导铁死亡发生^［22］。进一步研究发现，铁死亡与肿瘤耐药有关。肿瘤细胞通过不同机制使胞内GSH升高，铁蓄积减少，抑制ROS产生，进而发生耐药^［23］。在不同肿瘤中诱导铁死亡发生，成为主要研究思路^［24］。新型的纳米颗粒材料能通过抑制GSH的合成过程促进细胞发生脂质过氧化，进而诱导肿瘤细胞发生铁死亡^［25］。热休克蛋白A5定位于内质网，通过与GPX4结合并稳定其活性，进而抑制细胞内ROS活性，抑制铁死亡^［26］。我们发现肺腺癌中报道铁死亡较少，如何调控肺腺癌中的铁死亡发生过程，成为主要的研究思路。

铁死亡发生过程与多种因素有关，如何调控肺腺癌铁死亡发生成为研究的切入点。本文通过建立葡萄糖转运蛋白与铁死亡之间的潜在联系，探索了糖代谢酶的非经典代谢功能，明确在铁死亡过程中该蛋白的作用机制，为后续肺腺癌耐药模型诱导铁死亡提供了研究思路。下一步将探索该分子抑制剂在体外模型验证情况，并通过小鼠模型明确体内是否发生铁死亡抵抗促进肿瘤发生发展。综上所述，本文发现了肺腺癌中新的潜在的治疗和诊断分子，并提出该分子新的作用机制，为进一步探索铁死亡发生过程提供了研究基础。

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