LINC00467高表达通过抑制AMPK/mTOR通路抑制细胞自噬促进肺腺癌细胞的增殖和转移

High expression of LINC00467 promotes proliferation and metastasis of lung adenocarcinoma cells by suppressing autophagy via inhibiting the AMPK/mTOR pathway

摘要

目的 探讨LINC00467对肺腺癌增殖和转移的影响及参与细胞自噬的机制。 方法 体外培养人支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞A549和H1299，A549和H1299细胞经慢病毒shlinc00467和shNC感染、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和AMPK抑制剂BML-275处理。分别设置shNC组、shlinc00467组、shNC+3-MA组、shlinc00467+3-MA组、shNC+BML-275组和shlinc00467+BML-275组。实时荧光定量PCR检测细胞中LINC00467的表达，TCGA数据分析组织中LINC00467的表达以及对肺腺癌患者生存率和临床分期的影响，克隆形成实验检测细胞增殖情况，Transwell实验测定细胞迁移和侵袭能力，免疫荧光染色检测LC3的表达，Western blotting检测蛋白表达，GSEA富集分析LINC00467与自噬通路的相关性。 结果 与16HBE细胞相比，LINC00467在A549和H1299细胞中表达增加（P<0.001）。与癌旁组织相比，肺腺癌组织中LINC00467高表达（P<0.001）且随着临床分期增加表达量增加（P<0.05），LINC00467高表达导致患者不良的总体生存率（OS，P=0.049）和第一阶段进展率（FP，P=0.026）。与shNC组相比，shlinc00467感染的A549和H1299细胞中LINC00467表达降低（P<0.001）。与shNC组相比，shlinc00467导致A549和H1299细胞克隆形成数（P<0.01）、迁移细胞数（P<0.001）、侵袭细胞数（P<0.001）减少、p-mTOR/mTOR（P<0.05）及p62（P<0.01）蛋白表达减少；p-AMPK/AMPK（P<0.05）和LC3II/I（P<0.05）增加；GSEA提示了LINC00467对自噬通路的抑制作用（|NES|>1，P<0.05，FDR<0.25）。 结论 LINC00467能促进肺腺癌细胞增殖和转移，可能是通过抑制AMPK/mTOR信号通路介导的自噬实现的。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effects of LINC00467 on proliferation and metastasis of lung adenocarcinoma cells and the involvement of autophagy in its regulatory mechanism. Methods LINC00467 expression levels in lung adenocarcinoma tissues and their correlation with the patients' survival outcomes were analyzed using data from TCGA database. LINC00467 expression was also examined using qRT-PCR in human bronchial epithelial cells 16HBE and lung adenocarcinoma cell lines A549 and H1299. In A549 and H1299 cells transfected with a short hairpin RNA targeting LINC00467 (shLINC00467), the effects of 3-methyladenine (3-MA, an autophagy inhibitor) and BML-275 (an AMPK inhibitor) treatment on cell proliferation, migration, and expressions of LC3 and the AMPK/mTOR pathway proteins were tested using colony formation assay, wound-healing and Transwell assays, immunofluorescence staining and Western blotting. GSEA enrichment analysis was conducted to analyze the correlation between LINC00467 and the autophagy pathway. Results The expression level of LINC00467 was significantly higher in lung adenocarcinoma tissues than in the adjacent tissues (P<0.001) and increased progressively with the clinical stage (P<0.05), and its high expression was associated with a poor overall survival (P=0.049) and a high first progression rate (P=0.026) of the patients. LINC00467 expression was also significantly higher in A549 and H1299 cells than in 16HBE cells. In A549 and H1299 cells, LINC00467 knockdown significantly decreased colony-forming, migration and invasion abilities of the cells, lowered p-mTOR/mTOR and p62 expressions, and increased p-AMPK/AMPK expressions and LC3II/I ratio, and these effects were strongly attenuated by application of either 3-MA or BML-275. GSEA analysis suggested an inhibitory effect on LINC00467 on the autophagy pathway (|NES|>1, P<0.05, FDR<0.25). Conclusion High expressions of LINC00467 promote proliferation and metastasis of lung adenocarcinoma cells possibly by inhibiting cell autophagy mediated by the AMPK/mTOR signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

LINC00467 / 肺腺癌 / 自噬 / 增殖 / 转移 / AMPK/mTOR信号通路

Key words

LINC00467 / lung adenocarcinoma / autophagy / proliferation / metastasis / AMPK/mTOR signaling pathway

肺癌目前在癌症致死原因中居于首位^{［1， 2］}，肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的亚型^［3］。对肺腺癌的治疗如靶向治疗和免疫治疗等，已经应用于临床管理和改善患者总生存期^［4］。然而，由于耐药和个性化药物的需要，发现与肺腺癌相关的新的治疗靶标分子至关重要。

长链非编码RNA（LncRNAs），是非编码RNA的一个子集，正常组织与肿瘤样本相比经常存在差异表达^［5］。一些LncRNA表达的增加或减少与癌症进展和患者预后密切相关^［6］。LINC00467是第一批在人类疾病中证明发挥作用的LncRNA，其在不同类型的癌症中上调^［7］。在肺腺癌中，LINC00467可通过DNA去甲基化和拷贝数变化而上调^［8］。研究表明，LINC00467可促进肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭^［9-11］ ，本研究组前期研究证实LINC 00467可募集EZH2调控HTRA3促进肺腺癌的增殖、迁移和侵袭^［10］。

自噬分为3种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬^［12］。巨自噬是研究最多的自噬形式，是细胞内通过溶酶体降解途径分解和回收各种细胞质成分的“自噬”过程，通过促进细胞存活或诱导细胞死亡来调节体内平衡。在肿瘤中，自噬在肿瘤发生、进展和治疗抵抗中起重要作用^［13］。自噬可作为肺癌治疗的关键靶点^［14］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被认为是调控自噬的关键分子，AMPK/mTOR信号通路被认为是调控自噬的关键通路^［15］。AMPK通过直接和间接抑制mTOR复合物1（mTORC1）活性正向调节自噬^［16］。mTOR是自噬的负调节因子，它由mTORC1和mTORC2组成。其中，mTORC1是正常细胞或肿瘤细胞中主要的自噬调节因子^［17］。目前LINC00467是否调控自噬影响肺腺癌进展尚无相关报道，LINC00467是否通过AMPK/mTOR信号通路调节细胞自噬促进肺腺癌进展也未见报道。

本研究旨在探讨LINC00467在肺腺癌中的表达是否通过AMPK/mTOR信号通路调节细胞自噬促进肺腺癌细胞增殖、侵袭、转移。为LINC00467将来是否作为新的筛查、诊断和治疗靶点提供依据，也为肺腺癌的发生机制提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞A549和H1299（上海纪宁实业有限公司）。RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素（Gibco， ThermoFisher Scientific）。靶向LINC00467的短发夹RNA（shlinc00467）-pEGFP-N1及其阴性对照（LINCOO467NC）（汉恒生物科技有限公司）。Lipofectamine 2000和TRIzol试剂（Invitrogen）。3-甲基腺嘌呤（3-MA）、BML-275和结晶紫（MedChemExpress）。PrimeScript逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）。引物序列（生工生物工程（上海）股份有限公司）。抗淬灭封片液、RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜和超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）。一抗LC3B（1∶2000）、p62（1∶10000）、AMPK（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、mTOR（1∶10000）、p-mTOR（1：1000）和β-actin（1∶1000）及Alexa Fluor® 594（1∶100）和HRP标记的二抗（1∶1000）（Abcam）。

1.2 细胞培养、转染与处理

16HBE、A549和H1299细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中在37 ℃含5% CO₂的培养箱中培养。使用Lipofectamine 2000将shLINC00467和LINC00467NC转染到A549和H1299细胞中，Axio Observer D1荧光显微镜（Carl Zeiss）下观察转染效果，干涉效率采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。为了研究抑制剂的作用，A549和H1299转染后用自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）和AMPK抑制剂BML-275（10 mmol/L）处理24 h。

1.3 qRT-PCR

采用TRIzol试剂提取A549和H1299细胞总RNA。用PrimeScript逆转录试剂盒将5 µg总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR反应并在QuantStudio 5 Real-Time PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行扩增。引物序列如下：linc00467 F：5'-GCGTAGGCCGGACATTTCTA-3'，R：5'-CACCAAGGTTCAGCAGATCCGC-3'；GAPDH F：5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，R：5'-ATCC GTTGACTCCGACCTTCAC-3'。基因表达水平使用2^-ΔΔCt法计算。

1.4 生物信息学分析

利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的RNA测序数据，对LINC00467基因在肺腺癌患者肿瘤组织与正常对照组织中的表达水平进行比较分析。采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险模型分析LINC00467基因表达对患者总体生存期（OS）和无进展生存期（FP）的影响。根据LINC00467的表达水平将患者分为高表达组和低表达组，并绘制Kaplan-Meier生存曲线，使用Log-rank检验评估两组生存曲线的差异显著性，同时计算风险比（HR）及其95%置信区间（95% CI）。此外，通过方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验，对不同分期患者中LINC00467基因的表达水平进行比较，并进一步通过Dunn's检验进行事后分析，以确定具体分期之间的表达差异。

采用基因集合富集分析（GSEA）对LINC00467高低表达分组的基因表达数据进行富集分析，重点分析其在自噬相关信号通路中的富集情况。GSEA分析包括GOBP_REGULATION_OF_AUTOPHAGY、KUMAR_AUTOPHAGY_NETWORK和WP_AUTOPHAGY等自噬通路，计算标准化富集得分（NES）、显著性P值及假发现率（FDR），以评估LINC00467在这些通路中的富集趋势及其可能的调控作用。

1.5 克隆形成实验

不同处理后的A549和H1299细胞（800/孔）在6孔板中培养。2 d更换1次培养基。培养2周后，用4%多聚甲醛固定1 h，0.1%结晶紫在室温下染色30 min。计算形成的菌落数量，以评估细胞增殖情况。

1.6 Transwell实验

Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。对于侵袭实验：将50 μL Matrigel（5 μg/μL）加入Transwell上室中形成凝胶，将不同处理组A549和H1299细胞用无血清培养基制成单细胞悬液后加入上室，下室中加入含10%胎牛血清的培养基。培养24 h后，用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色10 min，用棉签去除膜上表面的细胞，在显微镜下拍照并计数跨膜细胞数。迁移实验除Transwell上室不加Matrigel外，其余步骤同侵袭实验。

1.7 免疫荧光实验

免疫荧光实验检测A549和H1299细胞中LC3的表达。将各处理组A549和H1299细胞接种在共聚焦小皿（2.5×10⁵/mL）中，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，加入0.1%Triton X-100室温通透10 min，加封闭液室温封闭60 min。然后加入抗LC3的一抗4 ℃孵育过夜，加入Alexa Fluor® 647标记的荧光二抗37 ℃避光孵育1 h，滴加DAPI避光孵育10 min。PBST清洗3次，在蔡司LSM800激光共聚焦显微镜下观察LC3的表达。

1.8 Western blotting

收集各处理组A549和H1299细胞，加入RIPA裂解缓冲液裂解细胞，收集裂解液并离心。取上清液，用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白进行定量。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，然后转移到NC膜上。用5%BSA室温孵育2 h。加入一抗（LC3B、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR和β-actin）4℃孵育过夜，用相应的二抗室温孵育2 h，用超敏ECL化学发光试剂盒显色，使用ImageJ软件分析蛋白表达水平。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 8对数据进行统计分析，并以均数±标准差表示。两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用单因素方差分析并用Tukey's多重比较进行事后检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00467在肺腺癌细胞中的表达

qRT-PCR结果显示，与16HBE细胞相比，A549和H1299细胞中LINC00467的表达显著升高（P<0.001，图1）。

在TCGA数据中肿瘤组的LINC00467表达值（黄色箱体）明显高于正常组（蓝色箱体），且差异具有统计学意义（P<0.001，图2）。

2.2 LINC00467与肺腺癌临床特征的相关性

Kaplan-Meier生存曲线显示，LINC00467高表达组的OS显著低于低表达组（HR=1.28，95% CI： 1.01-1.63， Logrank P=0.049）；LINC00467的高表达与FP的缩短密切相关（HR=1.41， 95% CI： 1.04-1.88， Logrank P=0.026，图3A）。

在临床分期分析中，LINC00467在不同临床分期（Stage I-IV）中的表达水平存在显著差异。随着临床分期的进展，LINC00467的表达水平显著升高，尤其是在Stage III和Stage IV中，LINC00467的表达明显高于早期分期的患者（Stage I vs. Stage III， P<0.05； Stage I vs. Stage IV，P<0.01，图3B）。

2.3 shlinc00467敲低效率

shlinc00467和shNC转染A549和H1299细胞48 h后，荧光显微镜下观察转染效果（图4A）。qRT-PCR检测敲低效率，与shNC组相比，shlinc00467转染后，A549和H1299细胞中LINC00467的表达显著降低（P<0.01、P<0.001，图4B）。

2.4 敲低linc00467对肺腺癌细胞增殖的影响

克隆形成实验结果显示，与shNC组相比，敲低LINC00467的A549和H1299细胞克隆形成数显著减少（P<0.01，图5）。

2.5 敲低LINC00467对肺腺癌细胞转移的影响

Transwell实验结果所示，shlinc00467组迁移细胞数（P<0.001）和侵袭细胞数（P<0.001）明显少于shNC组（图6）。

2.6 敲低LINC00467对肺腺癌细胞自噬和AMPK/mTOR信号通路的影响

与shNC组相比，在A549和H1299细胞中敲低LINC00467可导致LC3的表达增多（图7A）。Western blotting结果显示，与shNC组相比，shlinc00467组A549和H1299细胞中p-AMPK/AMPK（P<0.05）和LC3II/I（P<0.05）明显增加，而p-mTOR/mTOR（P<0.05）和p62（P<0.01）的表达则显著减少（图7B~E）。

在LINC00467基因的GSEA富集分析中，结果显示LINC00467在多条自噬相关通路中显著富集。具体而言，GOBP_REGULATION_OF_AUTOPHAGY通路、KUMAR_AUTOPHAGY_NETWORK通路和WP_AUTOPHAGY通路均呈现出显著的负富集趋势， LINC00467可能在自噬过程中发挥抑制作用。

2.7 自噬抑制剂对肺腺癌细胞自噬的影响

与shNC组相比，shlinc00467转染的A549和H1299细胞中LC3表达明显增加；与shlinc00467转染组相比，自噬抑制剂3-MA处理则抑制了敲低LINC00467引起的LC3表达的增加（图8A）。Western blotting结果显示，与shNC组相比，shNC+3-MA组A549和H1299细胞中LC3II/I的比值降低（P<0.05、P<0.001），而p62的表达升高（P<0.05）；shlinc00467组细胞中LC3II/I的比值增加（P<0.05），而p62的表达减少（P<0.01、P<0.001）。与shlinc00467组相比，shLINC00467+3-MA组细胞中LC3II/I的比值降低（P<0.05），而p62的表达升高（P<0.01，图8B~E）。

2.8 LINC00467通过调控自噬影响肺腺癌细胞增殖

与shNC组相比，shlinc00467组细胞克隆数显著减少（P<0.001）；与shLINC00467组相比，shlinc00467+3-MA组细胞克隆数明显增多（P<0.001，图10）。

2.9 LINC00467通过调控自噬影响肺腺癌细胞转移

与shNC组相比，shNC+3-MA组迁移细胞数（P<0.05）和侵袭细胞数（P<0.001）明显增多，shlinc00467组迁移细胞数（P<0.01）和侵袭细胞数（P<0.05，P<0.01）明显减少；shlinc00467+3-MA组迁移细胞数（P<0.05）和侵袭细胞数较shlinc00467组均显著增加（图11）。

2.10 LINC00467通过调控AMPK/mTOR信号通路影响肺腺癌细胞自噬

与shNC组相比，shNC+BML-275组A549和H1299细胞中p-AMPK/AMPK（P<0.05）和LC3II/I（P<0.05）显著降低，p-mTOR/mTOR（P<0.05、P<0.01）和p62（P<0.01、P<0.05）的表达明显升高；shlinc00467组细胞中p-AMPK/AMPK（P<0.05）和LC3II/I（P<0.05、P<0.01）增加，而p-mTOR/mTOR（P<0.05）和p62（P<0.01）的表达则减少。与shlinc00467组相比，p-AMPK/AMPK和LC3II/I降低（P<0.05），而p-mTOR/mTOR和p62的表达则升高（P<0.05，图12）。

2.11 LINC00467通过调控AMPK/mTOR信号通路影响肺腺癌细胞增殖

与shNC组相比，shlinc00467组细胞克隆数显著减少（P<0.01，P<0.001）；与shlinc00467组相比，shlinc00467+BML-275组细胞克隆数明显增多（P<0.01，P<0.05，图13）。

2.12 LINC00467通过调控AMPK/mTOR信号通路影响肺腺癌细胞转移

与shNC相比，shNC+BML-275组迁移细胞数（P<0.05）和侵袭细胞数（P<0.05）明显增多，shlinc00467组迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少（P<0.01，P<0.001）；shlinc00467+BML-275组迁移细胞数和侵袭细胞数均较shlinc00467组显著增加（，P<0.01图14）。

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，按照病理学特征分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌^［3］。非小细胞肺癌是肺癌的主要类型，约占肺癌患者的80%~85%^［18］，而肺腺癌又是非小细胞肺癌的主要类型，约占肺癌总量的40%^［19］，因此，研究肺腺癌的发病机制及治疗策略至关重要。

LncRNAs在癌症免疫、癌症代谢、癌症转移和耐药中具有关键作用^［20］。据报道，LINC00467在肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、骨肉瘤等多种恶性肿瘤中高表达^［21］。LINC00467与许多临床特征相关，也被认为是疾病诊断、预后和治疗中的潜在生物标志物。研究表明，LINC00467可作为分子海绵吸附多种miRNAs，并可调节NF-κB、STAT1、Wnt/β-catenin、Akt和ERK1/2等多种信号通路的活性^{［22， 23］}。LINC00467在非小细胞肺癌组织中高表达，且与晚期临床分期和不良预后相关；机制研究结果表明，LINC00467的高表达是由TDG介导的乙酰化引起的，敲低LINC00467通过调节Akt信号通路抑制肺癌细胞生长和转移^［24］。在肺腺癌组织和细胞中，LINC00467表达升高，并通过负调控miR-4779和miR-7978而促进肺腺癌细胞增殖和干性特征并抑制细胞凋亡^［25］。此外，LINC00467与肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭密切相关^［9-11］。本研究亦发现，LINC00467在肺腺癌细胞A549和H1299中高表达，敲低LINC00467可抑制A549和H1299细胞的增殖、迁移和侵袭，表明LINC00467可促进肺腺癌细胞恶性表型。以LINC00467在肺腺癌组织中高表达，LINC00467高表达组的总体生存期和无进展生存期的显著低于低表达组。LINC00467的高表达可能是肺腺癌患者预后的不良指标。

自噬是一种进化上保守的降解系统，可降解细胞内受损的细胞器或错误折叠的蛋白质，与癌症、基因组损伤和代谢应激等密切相关^［26］。自噬通常被认为在促进细胞存活中起作用^［27］。然而，最近的研究表明，自噬在多种癌症中通过诱导细胞死亡发挥细胞毒性作用，提示其潜在的抗肿瘤作用^［28］。据报道，LncRNAs可通过调控自噬参与肿瘤的发生发展^［29］。在肺癌细胞中，LncRNA linc01279表达的增加通过调节SIN3A蛋白稳定性阻止细胞死亡相关的自噬^［30］。沉默LncRNA FAM83A-AS1通过MET-AMPK信号通路阻碍肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞自噬^［31］。敲低LncRNA LOC389641通过EGFR/MET信号通路抑制肺腺癌细胞增殖和侵袭，并诱导自噬和凋亡^［32］。此外，LncRNA NFYC-AS1抑制的肺腺癌细胞的自噬和凋亡参与了其对增殖、迁移和侵袭的促进作用^［33］。然而，LINC00467对自噬的影响尚未见报道。在本研究中，敲低LINC00467增加了A549和H1299细胞中LC3II和LC3I的表达，而减少了p62蛋白的表达，并且利用TCGA数据集也验证了LINC00467对肺腺癌自噬通路的抑制作用。自噬抑制剂3-MA处理可减弱敲低LINC00467对A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示LINC00467可能通过抑制细胞自噬促进肺腺癌细胞增殖和转移。

AMPK/mTOR信号通路是调控自噬的主要和关键通路。AMPK是能量代谢、细胞生长和自噬的重要调节因子，当细胞营养不足时，AMPK被激活^［34］。mTOR是自噬的关键调控因子，是生长因子存在和营养丰富条件下抑制自噬的主要信号^［35］。AMPK/mTOR信号通路可协调决定癌细胞的存活和自噬，在肿瘤发生中起至关重要的作用^［36］。既往研究表明^{［37，38］}，LncRNAs可通过直接或间接靶向AMPK和mTORC1分子调控自噬。LncRNA NBR2直接绑定AMPK促进AMPK活化并抑制mTORC1的表达而抑制肿瘤形成；NBR2缺失导致能量应激时AMPK失活，从而促进mTORC1活化、细胞增殖和肿瘤发生^［37］。LncRNA DRAIC通过下调NF-κB靶基因GLUT1激活AMPK和抑制mTOR，导致下游蛋白质翻译减少和自噬增加而抑制胶质母细胞瘤衍生细胞系的侵袭、迁移、集落形成和异种移瘤的生长^［38］。本研究发现，敲低LINC00467可导致A549和H1299细胞中AMPK和AMPK磷酸化水平升高，mTOR和p-mTOR水平降低，表明LINC00467可抑制肺腺癌细胞中AMPK/mTOR信号通路的活化。自噬抑制剂3-MA预处理可逆转LINC00467敲低引起的LC3II和LC3I表达的升高及p62蛋白表达的减少。此外，AMPK抑制剂BML-275预处理A549和H1299细胞可减少LINC00467敲低增加的LC3II、LC3I和AMPK的表达及AMPK的磷酸化水平，而增加linc00467敲低减少的细胞克隆数、迁移细胞数、mTOR和p62的蛋白表达及mTOR的磷酸化水平。结果表明，LINC00467在肺腺癌细胞中通过抑制AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬而促进肺腺癌细胞增殖和转移。

本研究证实了LINC00467在肺腺癌细胞中高表达，LINC00467通过失活AMPK/mTOR信号通路抑制细胞自噬，继而促进肺腺癌细胞增殖和转移，这为LINC00467作为潜在的肺腺癌治疗靶点提供了依据。

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基金资助

安徽省高校优秀青年人才支持计划项目(gxyq2021256)

安徽省教育厅重点科研项目(KJ2021A0841)

皖南医学院弋矶山医院引进人才科研基金(YR202118)

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