中药泽漆抑制非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭、迁移以及促进细胞凋亡

Euphorbia helioscopia inhibits proliferation, invasion, and migration and promotes apoptosis of non-small cell lung cancer cells

摘要

目的 探究中药泽漆对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞PC-9和A549细胞的作用。 方法 PC-9细胞和A549细胞体外培养，采用不同浓度泽漆作用于PC-9细胞（0、0.4、0.8、1.2 mg/mL）和A549细胞（0、0.8、1.2、1.6 mg/mL），CCK-8法和集落克隆实验检测泽漆对NSCLC细胞增殖的影响；流式细胞实验检测泽漆对NSCLC细胞凋亡的影响；划痕实验和Transwell实验检测泽漆对NSCLC细胞侵袭迁移的作用；Western blotting实验检测泽漆对NSCLC细胞凋亡和侵袭迁移相关蛋白Bax、Bcl-2、E-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9表达的影响；将PC-9细胞注射到BALB/C裸鼠皮下，建立裸鼠皮下瘤动物模型，根据皮下瘤生长情况，小鼠被随机分为对照组：每日灌胃生理盐水；泽漆处理组：每日灌胃泽漆65 mg/mL，泽漆颗粒剂用生理盐水溶解；顺铂治疗组：每5 d腹腔注射顺铂4 mg/kg，每组6只小鼠，测量小鼠皮下肿瘤体积及质量变化，观察泽漆对荷瘤小鼠心、肝、脾、肺、肾的毒副作用以及治疗作用。 结果 CCK-8和集落克隆实验结果显示泽漆呈浓度依赖性抑制PC-9和A549细胞增殖和存活（P<0.01）；流式细胞实验结果显示泽漆诱导细胞凋亡（P<0.05）；划痕实验和Transwell实验结果显示泽漆能够抑制NSCLC的侵袭迁移能力（P<0.05）；Western blotting实验结果显示泽漆处理后上调E-Cadherin、Bax蛋白表达水平，下调Bcl-2、vimentin、MMP2、MMP9蛋白表达水平（P<0.05）；动物实验结果显示：与对照组相比，泽漆能够抑制小鼠NSCLC皮下瘤的生长，并观察到对小鼠脏器没有产生明显毒性。 结论 泽漆能够抑制NSCLC细胞增殖和侵袭迁移，诱导细胞发生凋亡。

Abstract

Objective To investigate the effect of Euphorbia helioscopia on biological behaviors of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Methods NSCLC cell lines PC-9 and A549 treated with different concentrations of Euphorbia helioscopia preparations were examined for changes in proliferation, apoptosis, invasion and migration using CCK-8 assay, colony formation assay, flow cytometry, wound healing assay and Transwell assay. Western blotting was performed to detect the changes in protein expressions of Bax, Bcl-2, E-cadherin, vimentin, MMP2, and MMP9 in the treated cells. PC-9 cells were injected subcutaneously into BALB/C nude mice to establish a nude mouse subcutaneous tumor model. According to the growth of subcutaneous tumors, mice were randomly divided into control group: gavaged daily with saline; Euphorbia helioscopia-treated group: gavaged daily with Euphorbia helioscopia 65 mg/mL, and Euphorbia helioscopia granules were dissolved in saline; cisplatin-treated group: injected intraperitoneally with cisplatin 4 mg/kg every 5 days, 6 mice per group. The subcutaneous tumor volume and mass changes of mice were measured, and the toxic effects of Euphorbia helioscopia on heart, liver, spleen, lung and kidney as well as the therapeutic effects of Euphorbia helioscopia were observed in the mice bearing tumor. Results Euphorbia helioscopia granules concentration-dependently inhibited the proliferation and survival of PC-9 and A549 cells, significantly promoted cell apoptosis, suppressed invasion and migration abilities of the cells, up-regulated the expression levels of E-cadherin and Bax, and down-regulated the expressions of Bcl-2, vimentin, MMP2, and MMP9. In the tumor-bearing mice, treatment with Euphorbia helioscopia significantly inhibited tumor growth without producing obvious toxicity in the vital organs. Conclusion Euphorbia helioscopia can inhibit proliferation, invasion, and migration and induces apoptosis of NSCLC cells in vitro.

Graphical abstract

关键词

泽漆 / 非小细胞肺癌 / 增殖 / 凋亡 / 侵袭迁移

Key words

Euphorbia helioscopia / non-small cell lung cancer / proliferation / apoptosis / invasion and migration

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的主要原因^［1］，环境污染和人们的吸烟行为很大程度上导致了肺癌的发生，肺癌主要分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌，非小细胞肺癌患者约占肺癌患者的85%^［2］。临床数据显示，高达50%的NSCLC患者在被确诊时已经发展到晚期，并伴随着剧烈咳嗽，咳血，胸痛等症状^{［3， 4］}。此外，晚期NSCLC患者易发生肿瘤远处转移，转移也是导致晚期NSCLC患者死亡的主要原因。目前，临床上针对NSCLC患者主要采用手术治疗、免疫治疗、化疗、放射治疗以及分子靶向治疗等^［5-7］，虽然临床上积极采用各种治疗方法干预肿瘤进展，但NSCLC患者易出现术后复发，放化疗毒副作用大导致的患者免疫功能下降，药物靶向治疗后患者易产生耐药等问题^［8］，肺癌患者总体无进展生存期仍然较低且生活质量较差，因此改善NSCLC患者生活质量，减轻不良反应，寻找更有效的疗法显得极为重要。

近年来，中医药治疗临床肿瘤患者的方案越来越受到临床医生青睐，传统中医学认为肺主宣发肃降，肺气失宣，则气机不利，发为咳嗽，肺癌属于肺积，胸痛等范畴^［9］，有研究^［10］指出NSCLC为本虚标实之证，气滞血瘀、痰瘀郁毒于肺中，肺气不能宣发肃降，导致患者出现咳嗽咯血，胸闷，呼吸困难等临床表现，因此活血化瘀，祛痰解毒，止咳平喘为主要治则。中药泽漆是大戟属植物泽漆（Euphorbia helioscopia L.）的干燥全草， 广泛分布于全国多地，现代《中药学》中记载泽漆有利水消肿、消痰退热、散结杀虫等功效^［11］，现代药理研究也表明泽漆具有止咳平喘、抗菌及抗肿瘤等作用^{［12， 13］}。在临床实践中，常采用高剂量泽漆配伍其他中药治疗肺癌，其单日常规剂量为30~90 g，最高可达300 g^［14］，用量越大，消痰化饮作用越强，不良反应较小。近年来，有研究指出，以泽漆为君药，辅以姜半夏、白前、紫菀、桂枝、生姜、黄芩、党参、甘草制成的中药复方泽漆汤^［15-17］对治疗NSCLC患者具有良好疗效，能够降低化疗药物毒性，改善患者生活质量，还有研究证明从泽漆中分离得到的黄酮类、糖苷类、萜类、没食子酸及其酯类衍生物等单体成分具有一定的抗肿瘤活性^{［13， 18， 19］}，在肺癌^［20］，乳腺癌^［21］，肝癌^［22］，胃癌^［23］等多种恶性肿瘤中发挥作用，主要的作用机制包括抑制肿瘤细胞增殖，侵袭和迁移能力，促进细胞凋亡，以及调节机体的免疫微环境^［24］等。目前基础研究大多对泽漆汤整体复方或泽漆的活性成分开展研究，缺乏对中药泽漆的单独研究。本研究通过体外实验证实泽漆能够抑制PC-9和A549细胞增殖、侵袭迁移，诱导细胞凋亡，通过构建裸鼠异种移植瘤模型证实泽漆在体内具有抗肿瘤作用，旨在为临床治疗NSCLC提供相应的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株和实验动物

人非小细胞肺癌细胞株PC-9和A549细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。实验动物：SPF级BALB/C裸鼠，［杭州子源实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK（浙）2019-0004］。裸鼠在SPF环境中饲养并提供充足的水和食物，动物研究方案经蚌埠医科大学实验动物教学与研究委员会审议通过（伦理批号：伦动科批字［2022］第177号）。

1.2 试剂

泽漆颗粒剂（华润三九医药股份有限公司），RPMI 1640培养基、DMEM-F12培养基（Gibco），胎牛血清（ExCell Bio），Bcl-2、β‑actin、MMP9抗体（Affinity），E-cadherin抗体（Abcam），Bax、Vimentin、MMP2抗体（Proteintech），CCK-8试剂（APExBIO），Annexin V-FITC/PI试剂盒（贝博生物），Transwell小室（Labselect），胰酶消化液、青霉素-链霉素溶液、BCA蛋白浓度测定试剂（Biosharp），RIPA裂解液（碧云天）。

1.3 细胞培养

PC-9细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中，A549细胞培养于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM-F12培养基中，所有细胞置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养。

1.4 CCK-8实验

收集处于对数生长期的PC-9和A549细胞种于96孔板中，5000/孔细胞，置于恒温培养箱中培养，待细胞密度为70%~80%时，更换孔中培养液为含泽漆的RPMI 1640培养基和DMEM-F12培养基，设置泽漆作用于PC-9细胞的浓度为0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg/mL，作用于A549细胞的浓度为0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL，每浓度6个复孔，分别孵育24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8试剂，37 ℃孵育30 min左右，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度OD值，细胞存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，计算药物半数抑制浓度。

1.5 集落克隆实验

PC-9和A549细胞种于6孔板中，2000/孔接种个细胞，待细胞贴壁后吸除培养基，在培养PC-9细胞的孔中加入含不同浓度泽漆（0、0.4、0.8、1.2 mg/mL）的RPMI 1640培养基2 mL，在培养A549细胞的孔中加入含有泽漆（0、0.8、1.2、1.6 mg/mL）的DMEM-F12培养基2 mL，作用24 h后，更换新鲜培养基，10 d后移除培养基，用PBS清洗2遍，4 %多聚甲醛固定30 min后结晶紫染色，室温干燥后拍照记录。

1.6 细胞形态学观察

将PC-9和A549细胞接种于6孔板中，2×10⁵/孔，待细胞密度达到70%~80%时吸除培养基，分别在培养PC-9和A549细胞的孔中加入含不同浓度泽漆的RPMI 1640培养基（0、0.4、0.8、1.2 mg/mL）和DMEM-F12培养基（0、0.8、1.2、1.6 mg/mL）2 mL，培养24 h后显微镜下拍照。

1.7 流式细胞实验

将PC-9和A549细胞种于6孔板中，每孔2×10⁵细胞，待细胞密度达到70%~80%时吸除旧培养基，分别在培养PC-9和A549细胞的孔中加入含不同浓度泽漆的RPMI 1640培养基（0、0.4、0.8、1.2 mg/mL）和DMEM-F12培养基（0、0.8、1.2、1.6 mg/mL）2 mL，培养24 h后收集细胞，加入双染试剂染色，纱布过滤后流式细胞仪上机检测。

1.8 划痕实验

将PC-9和A549细胞种于6孔板中，2×10⁵/孔，待细胞密度达到90%左右，用灭菌后的枪头在孔内画直线，用PBS洗去漂浮细胞后，在显微镜下进行拍照，之后分别在培养PC-9和A549细胞的孔中加入含不同浓度泽漆的RPMI 1640培养基（0、0.4、0.8、1.2 mg/mL）和DMEM-F12培养基（0、0.8、1.2、1.6 mg/mL）2 mL，培养24 h后显微镜下记录划痕照片，对不同样本的划痕实验结果进行统计和分析，实验重复3次。

1.9 Transwell侵袭实验

Transwell小室上室内加入50 μL基质胶，置于培养箱中1 h左右。收集PC-9和A549细胞，使用无血清培养基配制含有不同浓度泽漆的细胞悬液，泽漆作用于PC-9细胞的浓度为0、0.4、0.8、1.2 mg/mL，作用于A549细胞的浓度为0、0.8、1.2、1.6 mg/mL，上室加入2×10⁴细胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的空白培养基，培养24 h后取出上室，用PBS轻轻冲洗，加入4 %多聚甲醛室温固定15 min，结晶紫染液室温染色20 min，PBS冲洗后室温晾干，显微镜下观察拍照。

1.10 Transwell迁移实验

操作过程中无需加入基质胶，其余步骤同1.9。

1.11 Western blotting检测相关蛋白表达

将PC-9和A549细胞种于100 mm大皿中，待细胞密度达到70%~80%时吸去培养基，加入含有不同浓度泽漆的培养基处理，培养24 h后刮取蛋白，蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度以定量。蛋白上样后进行电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭3 h，加入对应一抗4℃孵育过夜，次日TPBS清洗3遍，每次5 min，加入对应二抗室温孵育1 h，显影曝光，Image J软件扫描条带灰度值。实验中使用的抗体及其稀释比例如下，一抗：E-cadherin（1∶800）、vimentin（1∶2000）、MMP2（1∶2000）、MMP9（1∶1000）、Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶4000）、β-actin（1∶3000），二抗：兔抗（1∶1000）、鼠抗（1∶1000）。

1.12 体内实验

收集PC-9细胞，用PBS与基质胶混悬制成细胞悬液，将细胞注射到小鼠皮下，待肿瘤体积长至100 mm³左右，根据小鼠皮下瘤生长情况随机分组进行给药，分为对照组、泽漆处理组和顺铂处理组，每组6只小鼠，对照组给予生理盐水灌胃，根据临床治疗70 kg体质量患者， 每日服泽漆生药质量为99 g，按照“人和动物体表面积折算的等效剂量比值表”计算小鼠等效剂量并配制泽漆颗粒溶液，得到泽漆给药剂量为65 mg/mL，顺铂治疗组小鼠腹腔注射给予顺铂4 mg/kg，根据临床治疗方案，泽漆处理组每日给药1次，顺铂治疗组每5日给药1次，治疗周期持续21 d。每2 d记录1次裸鼠体质量、肿瘤体积大小（瘤体积=长×宽²/2）、治疗结束后取裸鼠心、肝、脾、肺、肾脏组织拍照采集，称瘤质量。

1.13 统计学方法

本研究根据资源方程式确定法得到实验动物数量^［25］，计算公式为：

E=N-K=K\times n-K=K\times (n-\mathrm{1})

其中N为实验动物的总数，n为每组动物样本量，K为实验组数，E为两者之间的差值，E值在10~20，因此换算后得到Min n=10/K+1，Max n=20/K+1，本研究中分为3个实验组，代入公式计算得到n=6~8，E=18~24，因此我们选用了每组6只小鼠进行动物实验。本研究采用Graphpad Prism 9.0软件对实验结果进行分析，数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析检验各组间差异，P<0.05表示差异具有统计学意义，所有实验独立重复3次。

2 结果

2.1 泽漆抑制PC-9和A549细胞增殖

CCK-8实验结果表明，随着泽漆给药浓度和给药时间的增加，两种细胞存活率均显著下降（P<0.01），泽漆作用于PC-9细胞24、48 h的IC₅₀分别为0.98 mg/mL、0.78 mg/mL，泽漆作用于A549细胞24、48 h的IC₅₀分别为1.29 mg/mL、0.76 mg/mL（图1A）。根据CCK-8结果，选用泽漆作用于PC-9细胞的浓度为0、0.4、0.8、1.2 mg/mL，作用于A549细胞的浓度为0、0.8、1.2、1.6 mg/mL。集落克隆结果显示，泽漆抑制PC-9和A549细胞集落形成（图1B）；给予不同浓度泽漆处理24 h后，通过显微镜观察PC-9和A549细胞形态与密度，与对照组相比，给药组细胞皱缩、细胞密度明显降低（图1C）。

2.2 泽漆诱导PC-9和A549细胞凋亡

流式细胞实验结果表明，与对照组相比，随着泽漆给药浓度（泽漆作用于PC-9细胞的浓度为0、0.4、0.8、1.2 mg/mL，作用于A549细胞的浓度为0、0.8、1.2、1.6 mg/mL）的增加，PC-9和A549细胞凋亡率增加，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01，图2A、B）。Western blotting实验检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，结果表明，与对照组相比，不同浓度泽漆处理组的PC-9和A549细胞中Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著下降（P<0.05或P<0.01，图2C、D）。

2.3 泽漆抑制PC-9和A549细胞侵袭和迁移

给予PC-9和A549细胞不同浓度泽漆处理，泽漆作用于PC-9细胞的浓度为0、0.4、0.8、1.2 mg/mL，作用于A549细胞的浓度为0、0.8、1.2、1.6 mg/mL，结果表明，与对照组相比，泽漆处理组细胞的侵袭和迁移数目显著减少（P<0.05或P<0.01，图3A~C、图4A~C）；Western blotting实验检测侵袭迁移相关蛋白E-cadherin、vimentin、MMP2、MMP9的表达，结果表明，与对照组相比，不同浓度泽漆处理组PC-9和A549细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高，vimentin、MMP2、MMP9蛋白表达显著下降（P<0.05或P<0.01，图3D、E，图4D、E）。

2.4 泽漆抑制裸鼠体内PC-9移植瘤生长

与对照组相比，泽漆（65 mg/mL）能够显著抑制皮下瘤生长（P<0.01，图5A~C），但对裸鼠体质量变化影响不大（图5D）。为观察泽漆在荷瘤裸鼠体内的毒副作用，对心肝脾肺肾组织采集拍照，和对照组相比，顺铂治疗组肝脏表面有明显白色病变，脾脏色泽较深，泽漆治疗组器官表面较光滑平整，无明显病变（图5E）。

3 讨论

中药具有多成分、多靶点、多机制的特点，可有效针对NSCLC患者的不同临床表现和症状，泽漆汤在较多基础研究和临床应用中均证实对NSCLC具有良好药效，但对于泽漆的研究通常是以其复方制剂或者从泽漆中提取的单体成分进行报道，而针对泽漆的基础药理学实验和机制研究缺乏。基于此，本研究选用泽漆颗粒剂，对泽漆在NSCLC细胞中的作用机制进行初步探讨。本研究结果发现泽漆论是对EGFR突变型（PC-9）或者野生型（A549）的NSCLC细胞都具有较好的抑制增殖作用，通过CCK-8和集落形成实验观察到泽漆对这两种NSCLC细胞增殖活力抑制具有显著的时间和浓度依赖性，这也与目前报导的泽漆汤对NSCLC的药效一致^{［13， 26］}。

NSCLC发生转移是导致肺癌相关死亡的主要原因，肿瘤细胞由原发部位经历上皮间质转化过程到达转移部位。细胞失去上皮表型，获得间充质细胞特征的^{［27， 28］}，使细胞获得侵袭迁移能力和干细胞特性，恶性程度增强，向远处转移能力增加。本研究发现泽漆体外抑制PC-9和A549细胞的侵袭迁移，诱导细胞发生凋亡，上皮细胞标志物E-cadherin表达，降低间充质细胞标志物Vimentin的表达，说明泽漆抑制了NSCLC的上皮间质转化过程。在已报道的研究中也发现，泽漆汤或泽漆中提取的活性成分发挥抗NSCLC的作用通常与抑制上皮间质转化和促进细胞凋亡相关^［26］，因此，我们在这里进一步证实泽漆自身具有一定的抑制NSCLC的能力。

目前含有泽漆的配方如泽漆汤在肺癌动物模型上的研究已有报道，采用Lewis细胞建立肺癌皮下瘤或原位模型，结果发现泽漆汤对两种模型均具有较好的抑制肿瘤生长的作用^{［29， 30］}。但近年来，泽漆针对肺癌的动物药效研究相对较少。本研究同样利用A549细胞建立异种移植瘤模型，观察泽漆灌胃给药对小鼠的作用，发现泽漆能显著抑制小鼠皮下瘤进展，给药小鼠体质量波动较小且对小鼠的体内脏器没有明显毒副作用。

综上所述，本研究中，泽漆在治疗NSCLC中发挥有效作用，能够抑制肿瘤细胞增殖，侵袭迁移，诱导细胞发生凋亡，结合以往研究中已经证明泽漆有效单体成分及其复方制剂能够减少NSCLC治疗过程中的放化疗毒副作用，逆转耐药，改善患者生活质量，延长生存期等^{［13， 31， 32］}，因此中药泽漆有较好的临床应用前景。目前由于复方制剂中药物配伍的复杂性和不确定性，我们难以对泽漆及其复方制剂进行更加深入的系统性的研究，其抗肿瘤机制有待进一步明确与完善，临床广泛用药尚缺乏合理理论依据，因此在未来，我们还需要更多的基础研究，加强与临床病例研究相结合，为临床抗癌事业做更多贡献。

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