槲皮素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制小鼠成纤维细胞焦亡

Quercetin suppresses pyroptosis in mouse fibroblasts by inhibiting the NLRP3/caspase-1/GSDMD pathway

摘要

目的 探究槲皮素通过NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/ 消皮素D（GSDMD）信号通路调控小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）焦亡的影响及其机制。 方法 实验分为对照（Control）组、模型（Model）组、槲皮素（HPS）组、NLRP3特异性抑制剂（MCC950）组。CCK-8法检测槲皮素对NIH-3T3细胞活力的影响。光镜下观察细胞形态变化，ELISA检测白细胞介素（IL）-18、IL-1β含量，Western blotting和qRT-PCR检测NLRP3、活化半胱氨酸蛋白酶 1（Cleaved caspase-1）、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平。TUNEL染色及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞焦亡情况。 结果 槲皮素作用于NIH-3T3细胞最佳干预浓度和时间分别是20 μmol/L和24 h。与Control组相比，Model组细胞出现明显肿胀、破裂、细胞内容物流出，IL-18、IL-1β含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平均明显升高（P<0.001，P<0.0001），TUNEL染色的阳性细胞数及LDH释放量增加（P<0.0001）。与Model组相比，HPS组和MCC950组细胞焦亡情况改善，IL-18、IL-1β含量和NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平显著降低（P<0.01，P<0.001），TUNEL染色阳性细胞数及LDH释放量明显减少（P<0.0001）。 结论 槲皮素可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制成纤维细胞焦亡，下调炎症因子释放从而发挥治疗作用。

Abstract

Objective To investigate whether quercetin inhibits pyroptosis of mouse fibroblast NIH-3T3 cells by regulating the NLRP3/caspase-1/GSDMD signaling pathway. Methods NIH-3T3 cells were treated with quercetin or MCC950 (a specific inhibitor of NLRP3) before stimulation with lipopolysaccharide (LPS) and ATP to induce cell pyroptosis. The optimal quercetin concentration and duration were screened using the CCK-8assay after testing various concentrations and times. Morphological changes of the treated cells was observed, and the levels of IL-18 and IL-1β in the cell culture supernatant were detected with ELISA; the protein expressions of NLRP3, cleaved caspase-1, and GSDMD-N and the mRNA levels of NLRP3, caspase-1 and GSDMD were detected using Western blotting and qRT-PCR. The changes in cell pyroptosis were examined with TUNEL staining and LDH release assay. Results The CCK-8 assay indicated that 24-hour treatment with 20 μmol/L quercetin yielded the most favorable results. LPS and ATP stimulation of NIH-3T3 cells induced obvious swelling, cell membrane rupture and leakage of cell contents, significantly increased IL-18 and IL-1β levels, and enhanced protein expressions of NLRP3, cleaved caspase-1 and GSDMD-N and mRNA levels of NLRP3, caspase-1 and GSDMD. LPS and ATP stimulation also caused a significant increment of TUNEL-positive cell counts and LDH release in NIH-3T3 cells. Treatment with quercetin or MCC950 significantly reduced cell pyroptosis induced by LPS and ATP, lowered the concentrations of IL-18 and IL-1β, decreased the expression levels of NLRP3, caspase-1/cleaved caspase-1, GSDMD/GSDMD-N, and reduced the number of TUNEL-positive cells and LDH release. Conclusion Quercetin suppresses pyroptosis of mouse fibroblasts stimulated with LPS and ATP and reduces secretion of inflammatory cytokines by inhibiting the NLRP3/caspase-1/GSDMD pathway.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / 细胞焦亡 / NLRP3 / 成纤维细胞

Key words

quercetin / pyroptosis / NLRP3 / fibroblasts

慢性输卵管炎（CS）是妇科常见疾病，多因支原体、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌等病原体感染逆行至输卵管所致^［1］。研究显示，育龄期妇女的发病率为0.6%~11%^［2］。炎症长期刺激可导致输卵管组织纤维化，使其拾卵、运卵等功能受阻，进而诱发不孕。目前临床多用抗生素治疗，但副作用较大，炎症引起的纤维化病变亦无明显改善。因此，探索CS发病机制，寻找有效的治疗靶点具有重要意义。

细胞焦亡是一种促炎性细胞死亡^{［3， 4］}，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体是细胞焦亡的关键分子^［5］，在呼吸、消化、免疫等多个系统的炎症性疾病中均被证实存在NLRP3炎症小体的异常激活^［6-8］。研究发现，NLRP3炎症小体介导的经典焦亡途径在CS的发病机制中扮演重要角色^［9］。输卵管炎性大鼠中存在NLRP3炎症小体活化，促使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）剪切体形成，进而诱导消皮素D（GSDMD）裂解，引起细胞膜破裂，白细胞介素（IL）-18和IL-1β释放，加重CS大鼠输卵管组织损伤^{［10， 11］}。因此，通过调控NLRP3/Caspase-1/ GSDMD信号通路，可能是抑制CS细胞焦亡发生的关键环节。

课题组前期研究发现膈下逐瘀汤加减方治疗CS疗效显著^{［2， 12］}，可有效改善患者输卵管通畅度、提高妊娠率，同时缓解CS大鼠输卵管肿胀、管壁增厚、盆腔粘连等炎症情况，降低IL-6、IL-8以及转化生长因子等的表达，抑制炎性损伤。目前中药复方疗效确切，槲皮素为其主要有效成分^［13］，具有较好的抗炎功效，在多种炎症性疾病中应用广泛^［14-16］。研究表明，槲皮素可通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻炎症反应，同时根据生物信息学分析发现，NLRP3可能是CS的关键调控因子^［11］，但槲皮素是否通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD来改善CS，进而抑制输卵管纤维化的发生，目前尚未见报道。此外，对于CS的机制研究多集中在体内实验，缺乏有效的体外细胞实验验证。MCC950是一种特异性小分子抑制剂，可选择性阻断NLRP3炎症小体激活^［17］。基于此，本实验选取小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）为研究对象，采用脂多糖（LPS）联合三磷酸腺苷（ATP）诱导成纤维细胞焦亡模型，观察槲皮素处理后的变化，并与MCC950进行阳性对照，以揭示槲皮素调控CS的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

小鼠胚胎成纤维细胞（武汉梓杉生物）。

1.2 药品与试剂

LPS（上海语纯）；三磷酸腺苷（北京金克隆）；槲皮素（MCE）；MCC950（MCE）；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液（武汉塞维尔）；二甲基亚砜DMSO（BioFroxx）；胰酶消化液、磷酸盐缓冲液、无血清细胞冻存液、CCK-8试剂盒、通用型细胞组织固定液、逆转录试剂盒、qRT-qPCR试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、彩色快速凝胶配制试剂盒（北京赛文）；RIPA裂解液（上海碧云天），Trizol试剂（Thermo）；小鼠IL-18、IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒（江莱生物）；GSDMD antibody N-terminal（ImmunoWay）；NLRP3 Antibody（武汉Proteintech），Cleaved caspase-1（Ala317） p10 antibody（江苏Affinity Biosciences）、GAPDH antibody（上海爱必信）；HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Immunoway）；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天）；乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒（北京索莱宝）。

1.3 仪器

超微量分光光度计（Implen）；酶标仪（PerkinElmer）；荧光倒置显微镜（奥林巴斯）；数显恒温振荡器（江苏金坛吉特）；荧光定量Pcr仪（Roche），电子分析天平（OHAUS），电泳仪、半干转印电泳槽、凝胶成像仪（BIO-RAD）；离心机（Beckman Coulter）等。

1.4 细胞培养

NIH-3T3细胞置于含有10%胎牛血清、0.5%青链霉素混合液的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO₂的恒温箱内培养，隔日更换1次培养基，待细胞生长密度于80%~90%时进行传代及后续实验操作。

1.5 细胞分组与处理

细胞分为4组：对照（Control）组，模型（Model）组，槲皮素（HPS）组，NLRP3特异性抑制剂（MCC950）组。干预方法如下：Control组给予完全培养基培养；Model组采用1 μg/mL LPS联合5mmol/L ATP制备细胞焦亡模型；HPS组于LPS联合ATP诱导的焦亡模型前，根据“1.6CCK-8法检测槲皮素对细胞活力的影响”的实验结果，给予20 μmol/L的槲皮素预处理24 h；MCC950组在Model组的基础上给予1 μmol/L的NLRP3特异性抑制剂MCC950预处理1 h。

1.6 CCK-8法检测槲皮素对细胞活力的影响

将细胞计数后接种至96孔培养板，细胞密度为3000/（100 µL·孔），依次设置0、5、10、20、40、80、160 μmol/L浓度的槲皮素处理细胞，每个浓度设置5个复孔，培养24、48、72 h后，每孔加入10 µL的CCK-8溶液，恒温箱孵育2 h，酶标仪测450 nm处各孔的吸光度，并计算相对于对照组的细胞活性百分比。

1.7 细胞形态学观察

将NIH-3T3细胞接种至6孔板中（1×10⁵/mL，2 mL/孔）。待细胞长满孔底后，给予“1.5细胞分组与处理”所述方法干预，处理结束后在光学显微镜下观察各组细胞形态，并于200倍数采集图像。

1.8 ELISA检测IL-18、IL-1β含量

将NIH-3T3细胞按照“1.5细胞分组与处理”所述方法处理后，采用EP管收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，待测样品及标准品均设置3个复孔，最后在酶标仪测定450 nm处的吸光值，根据公式计算出各组细胞上清液IL-18、IL-1β含量。

1.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测NIH-3T3细胞内NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表达

采用Trizol法提取细胞RNA，通过分光光度计测定所提取RNA浓度及质量，根据逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA，以此为模版，进行荧光定量PCR检测。反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。扩增结果采用2^‐ΔΔCt法分析。实验所需引物均由安徽通用生物公司提供，引物序列：NLRP3，正向-GACCAGCCA GAGTGGAATGA，反向-CTTCAAGGCTGTCCTCC TGG；GSDMD，正向-AGTGCTCCAGAACCAGAAC CG，反向-TCTGCCCTGAATGTTCCCATC；Caspase-1，正向-CTATGGACAAGGCACGGGAC，反向-TCAGC TGATGGAGCTGATTGA；β-actin，正向-AGCCATGT ACGTAGCCATCCA，反向-TCTCCGGAGTCCATCA CAATG。

1.10 Western blotting检测NIH-3T3细胞内NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N蛋白表达

各组细胞加入总蛋白提取试剂（RIPA裂解液+蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心5 min，取上清液。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经100 ℃变性后上样，每孔20 μg，SDS⁃PAGE凝胶电泳分离样品蛋白，转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗NLRP3（1∶1000）、Cleaved caspase-1（1∶1000）、GSDMD-N（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入Goat Anti-Rabbit IgG（1∶10 000），摇床室温孵育1 h。洗膜后经ECL化学发光剂显影，应用ImageJ软件计算条带的灰度值进行定量分析。

1.11 TUNEL染色检测细胞DNA损伤情况

各组细胞采用4%多聚甲醛固定30 min，清洗后加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5 min。每组样本加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS清洗，加入抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜200倍数下观察各组细胞染色情况并采集图像。

1.12 乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞膜损伤情况

按照LDH活性检测试剂盒说明书操作，测定组、对照组和标准组均设置3个复孔，配制相应溶液，混合均匀，室温放置3 min后在酶标仪450 nm下测定吸光度，根据公式计算出各组细胞上清液中LDH释放量。

1.13 统计学方法

采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9软件统计分析，计量数据以均数±标准差表示，多组间比较应用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素对NIH-3T3细胞活力的影响

将浓度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的槲皮素作用于NIH-3T3细胞24、48、72 h后。与0 μmol/L相比，除5、10 μmol/L外，槲皮素其余浓度处理细胞后，细胞活力呈现剂量和时间依赖性，即随着时间及药物浓度的增加，细胞活力逐渐降低。当药物浓度立 20 μmol/L，处理24 h，细胞活力最接近对照组，为减少药物干扰作用，故选此用于后续实验的干预条件（图1）。

2.2 细胞焦亡形态观察

与Control组相比，Model组、HPS组、MCC950组细胞形态均发生改变，Model组细胞肿胀、扩张较为明显，细胞膜出现破裂，胞质皱缩，泡状内容物流出，此为细胞焦亡的典型表现。HPS组和MCC950组细胞肿胀、破裂等情况呈现不同程度改善（图2）。

2.3 槲皮素对NIH-3T3细胞IL-18、IL-1β的影响

ELISA检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞上清液中IL-18、IL-1β含量明显升高（P<0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组的IL-18、IL-1β含量显著下降（P<0.0001，图3）。

2.4 槲皮素对NIH-3T3细胞焦亡相关mRNA水平的影响

qRT-PCR检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞内NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平显著升高（P<0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组的各mRNA水平均明显降低（P<0.0001，图4）。

2.5 槲皮素对NIH-3T3细胞焦亡相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞中NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N的蛋白表达显著升高（P<0.001，P<0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组各蛋白表达降低（P<0.01，P<0.001，图5）。

2.6 TUNEL染色检测NIH-3T3细胞DNA损伤情况

TUNEL染色检测结果显示，与Control组相比，Model组细胞阳性细胞明显增多。槲皮素和MCC950组阳性细胞数明显低于Model组（图6）。

2.7 LDH释放实验检测NIH-3T3细胞膜损伤情况

LDH释放实验结果显示，与Control组相比，Model组细胞上清液中LDH含量明显升高（P<0.0001）；与Model组相比，HPS组和MCC950组LDH含量均显著降低（P<0.0001，图7）。

3 讨论

成纤维细胞是炎症和纤维化的主要效应细胞^［18］，慢性炎症的持续存在，刺激成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，分泌趋化因子、活性氧等，加重炎症反应，引起细胞外基质沉积，组织纤维化。抑制成纤维细胞激活可能是调控炎症、减轻纤维化的重要途径。在肺、肝、肾等器官的炎症性疾病中，NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡是引起组织炎症-纤维化病变的关键靶点^［19-21］。本实验选用LPS联合ATP构建体外细胞焦亡模型，给予槲皮素干预，与MCC950进行对照，在细胞水平上探索CS的发病机制。

目前LPS联合ATP是体外细胞焦亡模型的常用方法^{［22， 23］}。LPS作为细菌外壁的组成成分，可通过信号转导系统激活免疫细胞，释放多种炎性介质，诱发炎症反应。ATP是体内能量储存物质，亦是炎症反应重要内源性信号分子，与LPS联合可激活NLRP3炎症小体介导的经典焦亡途径。细胞经LPS联合ATP处理后，光学显微镜下可见其发生明显肿胀，部分细胞膜破裂，泡状内容物流出等形态改变，与Liu等^［24］描述的形态相似。给予槲皮素和MCC950干预后，上述状况明显减轻。在细胞焦亡过程中，伴随着DNA断裂和细胞膜穿孔^［25］。TUNEL染色可检测DNA断裂以证明细胞损伤^［26］，研究结果显示Model组细胞TUNEL染色阳性细胞数明显高于HPS组和MCC950组。同时，LDH可通过孔隙释放到胞外，因而通过检测细胞上清液中LDH含量，可量化细胞膜损伤情况。经槲皮素和MCC950处理后， LDH的释放量明显减少，间接证实细胞膜损伤情况较Model组少。相似的结果也发生在肺损伤和肠道损伤等的体外研究中，兰悦嘉等^［27］采用LPS联合ATP处理THP-1细胞，细胞焦亡率、LDH释放量均显著增加。Zhang等^［28］应用槲皮素干预LPS+ATP联合诱导的大鼠肠道微血管内皮细胞，结果显示细胞焦亡水平明显改善，与MCC950的作用类似。上述结果表明LPS联合ATP诱导成纤维细胞发生焦亡损伤，出现形态改变，而槲皮素可抑制这一作用。

NLRP3是机体免疫和炎症反应的关键调节蛋白，经受外来病原体和内源性危险信号而激活，进而启动NLRP3炎症小体（NLRP3-ASC-Caspase-1）组装。Caspase-1是NLRP3炎症小体的效应蛋白，活化前，以无活性的procaspase-1存在于胞内，通过炎症小体的组装，裂解为Cleaved caspase-1，之后将致炎因子前体pro-IL-18、pro-IL-1β剪切为成熟的IL-18、IL-1β^［29-31］。另一方面，Cleaved caspase-1可识别并切割焦亡的关键执行蛋白——GSDMD特定位点，高亲和力的结合具有抑制性的GSDMD-C结构域并释放GSDMD-N结构域^［32］。后者附着于细胞膜，并发生寡聚化以形成焦亡孔，IL-1β和IL-18等胞内容物经焦亡孔流出，随后招募炎症细胞聚集，诱发炎症级联反应^［33］。在CS的研究中发现，NLRP3炎症小体的激活及其介导的经典细胞焦亡途径是重要调控靶点。刘梅等研究证实通过抑制NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路，可降低炎性因子的释放，进而减轻CS炎症反应和组织损伤^［10］。本研究结果显示，LPS联合ATP处理细胞后NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N的蛋白表达及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA水平明显上升，细胞上清液IL-18、IL-1β含量增加。槲皮素可逆转上述变化，表明槲皮素能够抑制成纤维细胞的炎性损伤和细胞焦亡。同时，采用MCC950对焦亡模型细胞进行干预，发现上述焦亡相关分子水平与槲皮素干预的结果相似。以上结果从分子水平上表明，槲皮素通过抑制NLRP3炎症小体的激活来抑制焦亡损伤。目前关于槲皮素通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导细胞焦亡在其他炎性细胞中已有证明，Luo等^［34］采用槲皮素干预LPS+ATP诱导THP-1巨噬细胞焦亡模型，发现NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD-N、IL-1β等焦亡相关分子均明显下调，与本研究结果一致。Zhao等^［28］研究发现槲皮素还可缓解乙醇诱导的肝细胞焦亡及NLRP3炎症小体的活化，说明槲皮素在不同疾病中通过抑制NLRP3炎症小体的激活，达到治疗疾病的目的。

综上所述，本研究发现NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路介导的细胞焦亡在CS的发病过程中具有重要作用，槲皮素可通过下调相关基因的表达，抑制细胞焦亡，减少促炎因子释放，降低输卵管炎症损伤，这为今后槲皮素治疗慢性输卵管炎提供了参考。

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基金资助

黑龙江省省属本科高校中央支持地方高校改革发展资金(2021ZYGLG001)

黑龙江省自然科学基金(H2015026)

黑龙江省中医药科研课题(ZYW2023-120)

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