HNRNPA1基因在结直肠癌组织中高表达及其潜在的诊断和治疗价值

HNRNPA1 gene is highly expressed in colorectal cancer: its prognostic implications and potential as a therapeutic target

摘要

目的 通过生物信息学和细胞实验探究HNRNP A1在结直肠癌中的临床意义及其在肿瘤组织中的表达情况。 方法 使用HPA、TIMER和GEPIA数据库，分析HNRNP A1在结直肠癌组织中的表达水平，并检验HNRNP A1与Ki-67/VEGFA在结直肠癌中表达的相关性。使用Kaplan-Meier Plotter数据库评估HNRNP A1 mRNA水平与结直肠癌患者生存率之间的联系。通过基因富集途径分析，预测HNRNP A1在结直肠癌中的潜在生物学作用。通过免疫组织化学（IHC）和Western blotting技术检测HNRNP A1在结直肠癌及其癌旁组织中的蛋白表达。利用TIMER数据库网站对HNRNP A1在免疫浸润细胞中的表达进行预测。使用慢病毒敲低RKO/Caco2细胞中HNRNP A1的表达；通过CCK-8实验检测细胞增殖，使用克隆形成实验检测HNRNP A1对细胞增殖能力的影响；利用细胞划痕实验和Transwell迁移实验评估两组细胞（RKO/Caco2-nc、RKO/Caco2-sh）的迁移能力。最后验证HNRNP A1小分子抑制剂（VPC-80051）对肿瘤细胞增殖的影响。 结果 在结直肠癌（CRC）肿瘤组织中HNRNP A1的表达显著上调并与患者的不良预后显著相关（P<0.01）。TIMER数据库的分析结果指出，HNRNP A1与肿瘤微环境中的免疫细胞之间存在一定的相关性。根据GEPIA数据库的分析，CRC组织中HNRNP A1、MKI67和VEGFA的表达均较高（P<0.05），且HNRNP A1与这两者之间存在正相关关系。通过Kaplan-Meier Plotter进行的生存分析表明，在CRC中，HNRNP A1的高表达预示着较差的总生存期（P=0.0081）和无进展生存期（P=0.012）。基因富集通路分析的数据显示，HNRNP A1可能参与到多个与CRC进展相关的生物途径中。HNRNP A1影响RKO/Caco2细胞的增殖和迁移能力，对照组（RKO/Caco2-nc）的增殖能力、克隆形成能力和迁移能力均优于实验组（RKO/Caco2-sh），差异有统计学意义（P<0.05）；HNRNP A1小分子抑制剂（VPC-80051）可以有效抑制结直肠癌增殖活性，并具有时间和浓度依赖性；IHC显示HNRNP A1在结直肠癌中高表达，且与肿瘤分期有密切关系（P<0.0001）。 结论 HNRNP A1基因在CRC组织中表达较高，并可调节细胞的增殖和迁移能力，与不良预后密切相关，同时HNRNP A1小分子抑制剂（VPC-80051）也可以抑制结直肠癌细胞的增殖，因而可作为CRC治疗过程中新的潜在治疗靶点。

Abstract

Objective To investigate the expression level of HNRNP A1 in colorectal cancer (CRC) and its prognostic implications. Methods We investigated HNRNP A1 expression level in CRC using HPA, TIMER, and GEPIA databases and analyzed its association with Ki-67 and VEGFA expressions. Kaplan-Meier Plotter database was used to analyze the correlation of HNRNP A1 mRNA levels with the survival rates of CRC patients. Pathway enrichment analysis was performed for predicting the biological roles of HNRNP A1 in CRC progression. Immunohistochemistry and Western blotting were used to examine the protein levels of HNRNP A1 in CRC versus adjacent tissues, and TIMER was used for assessing its expression in the infiltrating immune cells. In RKO/Caco2 cells, the effects of lentivirus-mediated knockdown of HNRNP A1 on cell proliferation and migration were observed, and the inhibitory effect of VPC-80051 (a HNRNP A1 inhibitor) on cell proliferation was evaluated to assess its potential as a therapeutic agent. Results HNRNP A1 was significantly overexpressed in CRC tissues and correlated with a poor prognosis of the patients. HNRNP A1 expression level was correlated with the infiltrating immune cells in CRC microenvironment and positively correlated with MKI67 and VEGFA expressions in CRC. A high HNRNP A1 expression predicted a in survival and progression-free survival of CRC patients and was involved in multiple biological processes related with CRC progression. In RKO/Caco2 cells, HNRNP A1 knockdown significantly suppressed cell proliferation and migration, and treatment with VPC-80051 also effectively inhibited CRC cell proliferation. Immunohistochemical study demonstrated a close correlation of HNRNP A1 overexpression with tumor stage of CRC. Conclusion HNRNP A1 is overexpressed in CRC tissues to modulate cell proliferation and migration and is correlated with a poorer prognosis. VPC-80051 can effectively inhibit CRC cell proliferation, suggesting the potential of HNRNP A1 as a therapeutic target for CRC.

Graphical abstract

关键词

结直肠癌 / HNRNP A1 / 增殖与转移 / 预后 / 生物信息学

Key words

colorectal cancer / HNRNP A1 / proliferation and metastasis / prognosis / bioinformatics

结直肠癌（CRC）是全球范围内常见的消化道肿瘤，其作为全球第3大常见癌症和第2大致命肿瘤，一直是威胁人们健康的常见疾病^{［1， 2］}。近年来，随着结直肠癌筛查和检测技术的不断进步，死亡率有所降低，但发病率却随着年龄的增加而急剧上升^［3］。CRC在晚期被发现时死亡率很高，其主要原因是具有高度的侵袭和转移能力，这将大大影响患者的生活质量^［4］。因此，为明确CRC的转移机制急需寻找潜在治疗靶点。

核内不均一核糖核蛋白A1（hnRNP A1）作为一类RNA结合蛋白在许多类型的癌症中呈现出高表达的存在，可以刺激与肿瘤相关蛋白及调控因子的合成和翻译过程，对肿瘤生长代谢和癌症进展有重大意义^{［5， 6］}。HNRNP家族成员在肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用，其功能包括促进血管新生、调节基因表达、细胞凋亡以及提升癌细胞的侵袭和转移能力^［7-10］。此外，HNRNP家族在人类中包括20个成员，其中HNRNP A2B1在多种癌症中高表达，并通过直接与多种DNA、RNA和蛋白质相互作用来发挥促炎、抗炎或致瘤作用^［11］。研究表明HNRNP A1在前列腺癌中过表达，且是前列腺癌预后不良的独立预测因子^［12］。此外，有研究提出HNRNP A1可能是结直肠癌早期诊断、预后评估和疾病监测的一个潜在的生物标志物^［13］。不仅在RNA转运以及选择性剪切方面起作用，还有促进端粒延伸的效果^［14］。但HNRNP A1在CRC中仍未有明确的研究揭示其发挥的作用及机制，因此需要对该分子进行进一步的研究和发现。因此本研究利用生物信息学方法在分子以及细胞层面进行分析分析HNRNP A1和结直肠癌进展转移和预后之间关系，从而为结直肠癌的治疗提供治疗的可能。

1 材料和方法

1.1 实验主要材料和试剂

结直肠癌细胞系-RKO（赛维尔生物）；DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清（苏州双洳生物科技）；反转录及定量聚合酶链反应（qPCR）试剂盒（湖南艾科瑞生物）；CCK-8试剂盒和RNA提取试剂（新赛美生物）；针对HNRNP A1的敲低慢病毒（上海百易基因科技）；β-actin和HNRNP A1抗体（武汉三鹰生物）。HNRNP A1小分子抑制剂（VPC-80051，MCE）。

1.2 RT-qPCR法检测HNRNP A1 mRNA表达水平

经培养后收集RKO、Caco-2细胞，并根据RNA抽提试剂盒说明书进行操作，随后采用反转录试剂盒将提取的RNA合成为cDNA，再利用qPCR试剂盒以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增（表1）。最后通过2^-ΔΔCt法计算HNRNP A1 mRNA相对表达程度。

1.3 CCK-8和克隆形成检测细胞增殖活性以及给药实验

将细胞以3×10³/孔接种于96孔板中并以12 h为一节点培养48 h。在每个节点向各孔加入10 μL 的CCK-8溶液，并持续培养1 h。随后使用酶标仪测量吸光度A_{450 nm}。克隆形成实验：将细胞以1×10³/孔的密度接种在6孔板中，在14 d内，3 d/次更换培养基，当细胞增殖到肉眼可见的团块状程度时用PBS清洗细胞两遍，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，最后用0.1%的结晶紫染色15 min，最后使用相机对形成的克隆进行拍照。VPC-80051给药实验：同CCK-8实验，但细胞以1×10⁴/孔的数量接种于96孔板中并以24 h为一节点培养72 h。

1.4 Transwell小室和细胞划痕实验检测细胞迁移

Transwell小室：收集细胞后重悬，首先小室孔板下室中加入600 μL 10% FBS DMEM，上室加入100 μL 2% FBS DMEM（含10×10⁴个细胞）。24 h后取出Transwell小室并在PBS清洗后加入4%多聚甲醛，固定时间为20 min， 随后加入0.1%结晶紫染色15 min，棉签轻轻擦去上室细胞，最后于倒置显微镜下拍照并计数。细胞划痕实验：在显微镜下观察到细胞密度融合到单层状态时，用200 μL枪头在板内制造一个“十”字的空白区域，随后置于培养箱中培养。在适当的时间点（0、48 h）通过显微镜观察划痕宽度并拍照，使用Image J来测量划痕区域从而比较细胞迁移速率。

1.5 Western blotting法检测β-actin、HNRNP A1蛋白表达水平

首先对细胞裂解并提取总蛋白，随后进行BCA法定量。然后进行蛋白电泳分离，将条带转印至PVDF膜上并用5%脱脂奶粉封闭2 h。按照抗体说明书推荐的稀释比例（HNRNPA1：1∶5000；β-actin：1∶10 000），将膜置于一抗溶液中（4 ℃孵育过夜）。第2天用TBST缓冲液洗膜3次，然后加入稀释的二抗（室温孵育1 h），再次用TBST缓冲液洗膜3次，最后使用化学发光试剂曝光和显影。

1.6 免疫组织化学

标本先经4%多聚甲醛固定，然后进行石蜡包埋脱水处理，厚度为5 μm切片置于70 ℃烘箱烤60 min。接着二甲苯脱蜡10 min，以乙醇梯度性脱水（100%、90%、80%、70%）各5 min，最后蒸馏水冲洗3 min，每个操作重复3次。加入3%H₂O₂室温孵育10 min，然后蒸馏水冲洗后甩干水分，加入5% BSA封闭液，37 ℃封闭2 h。进行一抗、二抗及DAB溶液显色（均按说明书进行操作），显微镜下观察染色合适即可停止染色，自来水冲洗。进行苏木精复染，1%盐酸酒精分化3 s，自来水冲洗，自来水冲洗，脱水后滴加适量中性树胶封片。评估：使用Densito Quant软件自动识别并设定深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性，最后进行H-score的评分。

1.7 生物信息学分析

HPA数据库（https：//www.proteinatlas.org）下载CRC与癌旁组织数据及HNRNP A1数据。使用TIMER2.0（http：//timer.cistrome.org）数据库分析HNRNP A1 mRNA在泛癌中的表达水平和免疫细胞浸润的程度。在Kaplan－Meier Plotter数据库（http//：Kmplot.com）分析HNRNP A1 的表达与CRC患者预后的关系。通过GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）数据库分析HNRNP A1与MKI67、VEGFA在CRC中的表达。cBioPortal（https：//www.cbioportal.org）数据库下载与HNRNP A1在CRC中共表达的潜在基因，利用SangerBox生信网站数据库分析与 HNRNP A1富集相关数据。

1.8 统计学处理

对于生物信息学的数据，使用数据库中预设的统计方案，而其他类型的数值则通过Prism 9.0和Image J软件进行了统计分析，计量资料组间比较采用t检验，连续变量的组间比较采用方差分析，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均重复3次。

2 结果

2.1 HNRNP A1的筛选及家族成员在CRC中的预后情况

HNRNPA1在CRC中表达高于其他HNRNP家族蛋白，且在肿瘤组织中表达丰度高、HNRNP家族蛋白对预后的影响（图1A）。利用Kaplan－Meier Plotter数据库进一步分析HNRNP家族蛋白对预后的影响（图1B~K），结果显示HNRNP A1高表达与CRC患者预后密切相关（图1L）。

2.2 HNRNP A1在细胞中的定位

通过HPA数据库分析HNRNP A1在细胞模型及免疫荧光后人体细胞中的定位，在细胞模型中HNRNP A1主要定位于核质（图2A），而在人体细胞中，经免疫荧光表达后检测HNRNP A1的位置，发现大部分定位于核质，还有少部分定位于微核（图2B）。

2.3 HNRNP A1在正常人体结直肠组织、免疫细胞及多种核心细胞中的表达

经HPA数据集和GTEx转录组数据库结合分析表明HNRNP A1广泛存在于身体各组织且表达较高，相较于其他组织，HNRNP A1在结肠和直肠中表达处于中等位置且RNA特异性较低（图3A）。HNRNP A1在T细胞、B细胞、树突状细胞以及NK细胞中表达较高，但在粒细胞和单核细胞中表达较低（图3B）。另外，HNRNP A1 在正常的结肠组织和多种核心细胞中也有广泛的表达，比如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等（图3C）。

2.4 HNRNP A1在不同细胞类型中高表达

通过TIMER 2.0数据库和TCGA数据库分析发现，HNRNP A1基因在结肠癌（COAD）、直肠癌（READ）、胆管癌（CHOL）、食管癌（ESCA）、胃癌（STAD）等14中癌症呈现高表达趋势，在肾嫌色细胞癌中显著下调（图4A）。基于GEPIA数据库分析，HNRNP A1在结肠癌和直肠癌组织中的表达水平均高于正常组织（图4B）。此外HPA结直肠癌和癌旁组织数据库中免疫组化染色分析显示HNRNP A1在结直肠癌组织中表达较高（P<0.05，图4C）。

2.5 CRC不同分期下HNRNP A1的表达及其预后

HNRNP A1与MKI67、VEGFA呈正相关（图5A、B），且HNRNP A1癌组织的表达量明显高于正常组织（图4B）。结直肠癌组织中MKI67和VEGFA的表达水平也显著高于正常组织（图5C、D）。HNRNP A1在结肠癌Ⅰ期中表达相对较高（图5E），而在直肠癌分期中表达差异不明显（图5F）。HNRNP A1的高表达与较短的总生存期（图5G）和进展后生存期（图5H）显著相关。

2.6 HNRNP A1对肿瘤微环境的影响

结肠癌组织中HNRNP A1的表达与自然杀伤细胞和B细胞的浸润水平呈正相关，而与其他免疫细胞类型则呈负相关（图6A）。直肠癌HNRNP A1的表达与巨噬细胞和单核细胞的浸润水平呈负相关（图6B），但与Tregs、B细胞和NK细胞无明确关联（P>0.05）。

2.7 结直肠癌中的基因通路富集

在BP、CC和MF的构成的GO分析中发现这些基因在RNA metabolic process、RNA splicing和RNA binding等与RNA相关的信号通路中显著富集（P<0.05，图7A~C）。HNRNP A1的潜在靶基因也在许多与癌症发展相关的通路中富集，例如NOD-like receptor signaling pathway、mRNA surveillance pathway和RNA transport等（P<0.05，图7D）。

2.8 HNRNP A1促进CRC细胞的增殖、迁移

利用慢病毒对RKO/Caco2细胞进行HNRNP A1 mRNA的敲低并通过Western blotting和qPCR进行验证（图8A、B、G、H），通过CCK-8检测RKO/Caco2-nc和RKO/Caco2-sh hnrnpa1细胞的增殖活性，RKO/Caco2-sh hnrnp a1增殖活性显著低于对照组（图8C、I）。克隆形成实验结果显示RKO/Caco2-nc的增殖能力高于RKO/Caco2-sh hnrnp a1细胞（图8D、J）。细胞划痕和Transwell实验验证敲低HNRNP A1后是否影响RKO/Caco2细胞的迁移能力（图8E、F、K、L），发现VPC-80051可以对结直肠癌细胞的增殖有抑制作用，并且随着时间和浓度梯度的改变抑制效果会有一定的上升（图8M~N）。细胞活性实验发现Caco2对VPC-80051的敏感性更高，抑制其增殖的效果更明显（图8O）。

2.9 HNRNP A1在结直肠癌组织中的表达

对49例临床结直肠癌组织样本和配对的癌旁组织进行了收集，并通过免疫组织化学染色深入研究了HNRNP A1在结直肠癌组织中的分布情况（表2）。

IHC分析的结果显示，HNRNP A1在结直肠癌组织中的组织化学评分显著高于相邻的癌旁组织，并且与TNM分期中的染色强度有关，且TNM I、II期的染色强度弱于III、IV期（图9A）。IHC评分进一步证实了HNRNP A1在结直肠癌组织中呈高表达状态（图9B），差异具有统计学意义（P<0.0001）。此外，通过Western blotting检测10对结直肠癌组织及其相应的癌旁组织，发现HNRNP A1在结直肠癌组织中的蛋白表达水平高于癌旁组织（图9C）。

3 讨论

结直肠癌是全球癌症致死相关的第2大原因，进一步了解结直肠癌进展和转移的机制尤为重要。中国作为胃肠道恶性肿瘤大国之一，大部分胃肠道恶性肿瘤患者在确诊时已处于中晚期。手术治疗是病人长期生存的唯一机会，虽然能取得一定的效果但仍存在术后复发率高、5年生存率低的缺点^［15］。HNRNP在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用，涉及DNA修复、RNA剪接、端粒保持、细胞信号传递以及基因表达调节等环节^［16-18］。当HNRNP的这些正常生理功能受到干扰，如在遗传和环境因素的影响下，可能会导致多种疾病的发生^{［19， 20］}。有研究指出，长链非编码RNA（lncRNA）lnc-CTHCC能够通过与HNRNP K结合并激活YAP1转录，从而促进肝细胞癌的发生和发展^［21］。HNRNP K也通过参与细胞外基质、细胞粘附、侵袭和血管生成的信号级联反应来促进转移^［22］。在肺癌的研究中，HNRNP A1的乙酰化作用被发现参与了肺腺癌进展的调控过程^［23］。在子宫内膜癌中，Esculetin可通过靶向HNRNP A1下调 BCLXL和XIAP促进细胞凋亡从而抑制肿瘤细胞的增殖^［10］。因此，对于结直肠癌的发展和转移过程中靶基因的深入研究具有显著的临床价值，并为后续的相关研究工作奠定了基础并指明了研究方向。

本研究基于GEPIA和Kaplan-Meier Plotter数据库探索了HNRNP家族基因在结直肠癌中的表达和相关的预后情况，发现HNRNP A1较家族其它基因在结直肠癌中表达高且存在显著差异；高表达的HNRNP A1在结直肠癌中存在更差的生存期。HNRNP AB是影响CRC患者总生存期的重要独立因素，在结直肠癌中高表达也同样存在预后较差的情况^［24］。所以，我们通过IHC和Western blotting实验，对结直肠癌及其相关组织中的HNRNP A1表达进行了检测，这些实验数据与生物信息学分析完全一致。HNRNP与癌症发展的多个方面相关联，且HNRNP A1和HNRNP AB在多数肿瘤类型中呈现高表达，这与癌症相关信号通路、免疫细胞的相互作用以及预后评估价值紧密相关^［25］。后续又通过TCGA、GEPIA和UALCAN数据库研究了HNRNP A1在泛癌、结直肠癌和正常组织的中的表达差异以及不同分期中的差异，并分析了HNRNP A1与增殖相关因子VEGFA和MKI67的相关性，结果显示在结直肠癌组织中高表达且与VEGFA和MKI67表达呈现正向相关性。同样有研究表明，HNRNP A1与MKI67存在相关性，通过nc-HNRNP A1和sh-HNRNP A1异种移植肿瘤组织分析了其余MKI67之间表达，IHC显示敲低HNRNP A1后MKI67的表达水平降低^［26］。HNRNP L在结肠癌细胞中异常表达，促进了与细胞周期蛋白D3和Ki-67表达增强相关的细胞周期进程^［27］，同时与miR-574-3p相互作用进而调节VEGFA的翻译和肿瘤发生^［28］。由于肿瘤微环境中免疫细胞的作用十分复杂^［29］，因此通过TIMER数据库对肿瘤微环境的免疫细胞浸润进行分析，结果存在复杂的相互关系。HNRNP A1作为一类RNA结合蛋白，在富集通路中涉及多种与结直肠癌癌症发生发展相关的通路，如NOD-like receptor signaling pathway、mRNA surveillance pathway和RNA splicing、RNA transport等，NOD样受体家族成员NLRP12可以通过与 STK38 相互作用下调 Wnt/β-catenin 通路从而抑制结直肠癌^［30］。RNA剪切在癌症的发生、发展和转移中扮演着重要角色，癌症相关的剪接失调可以通过多种机制促进肿瘤发生，有助于增加细胞增殖、减少凋亡、增强迁移和转移潜力、对化疗的耐药性和逃避免疫监视^{［31， 32］}。此外，mRNA监控系统的异常可能导致错误蛋白的合成，而mRNA转运和翻译的失调可能影响细胞对环境变化的响应，这两者都可能与结直肠癌的发生和发展有关。HNRNP A1上调可以促进肝细胞癌的上皮间充质转化以及侵袭/迁移^［33］，因此通过细胞实验进行进一步验证其在结直肠癌中的作用，显示敲低HNRNP A1后对RKO/Caco2细胞的增殖、迁移均产生了显著的效果，提示HNRNP A1可能是结直肠癌发生发展的一个重要因子。VPC-80051是一类hnRNP A1小分子抑制剂，可与HNRNP A1蛋白UP1结构域结合并降低细胞活力^［34］，为了探讨其在结直肠癌治疗中的价值，使用不同浓度的VPC-80051处理结直肠癌细胞（RKO、Caco2），结果显示细胞活力都受到了不同程度的影响，表明了VPC-80051在临床治疗的潜在效果和应用价值。

综上所述，结直肠癌中HNRNP A1的高表达与不良预后密切相关，可能作为结直肠癌的潜在预后生物标志。但本研究存在一些局限性，如未对临床结直肠癌患者的数据进行深入分析，未探讨具体的分子作用机制，也未通过裸鼠肿瘤模型实验来验证HNRNP A1对实体肿瘤生长的影响。

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