复氧改善间歇性缺氧所致的肥胖大鼠下丘脑瘦素反应性降低

Reoxygenation improves reduced hypothalamic leptin responsiveness induced by intermittent hypoxia in obese rats

摘要

目的 使用饮食诱导肥胖（DIO）大鼠模型，探索间歇性缺氧-复氧（IHR）对肥胖大鼠体质量、食水摄入量、循环代谢因子和中枢瘦素注射反应的影响。 方法 通过12周高脂饮食（HFD）喂养建立DIO大鼠模型，将其随机分为3组并继续HFD喂养：常氧组（NM，n=15）、间歇性缺氧组（IH：6%O₂，30周期/h，8 h/d，4周，n=15），IHR组（缺氧2周后复氧2周，n=15）。记录大鼠体质量、饮食饮水情况，检测循环瘦素、IL-6、Ang-II含量。IHR干预结束后，大鼠接受4 μg瘦素侧脑室注射，1 h后处死取材下丘脑及肝脏。通过免疫组化观察下丘脑POMC、FRA-1、FRA-2表达，Western blotting检测下丘脑POMC、pSTAT3、LepR表达，RT-PCR检测下丘脑和肝脏中LepR mRNA含量，对比各组大鼠下丘脑瘦素受体（LepR）及下游通路蛋白的变化。 结果 IH暴露导致DIO大鼠体质量 （P=0.001）和摄食量（P=0.001）增加，全身炎症因子升高（瘦素P=0.004；IL-6 P=0.008；Ang-II P<0.001）。IH抑制下丘脑食欲抑制肽POMC表达（P<0.001 vs NM组），降低反映瘦素反应性神经元活性的FRA-1表达（P<0.001 vs NM组），抑制对瘦素响应的pSTAT3表达（瘦素+vs瘦素-，P=0.241），降低对外源性瘦素给药的反应性（P<0.001 vs NM组），并下调下丘脑和肝脏LepR mRNA含量（P<0.001 vs NM组）。经过2周的复氧治疗后，IH加剧的体质量增加和代谢紊乱能够得到改善，下丘脑瘦素反应性也有所提高。 结论 IH可能通过下调LepR表达损害下丘脑瘦素信号传导，从而促进肥胖大鼠增重，这可以通过复氧治疗得到改善。

Abstract

Objective To evaluate the effects of intermittent hypoxia-reoxygenation (IHR) on body weight, diet and water intake, circulating metabolites, and responses to central leptin injection in a rat model of diet-induced obesity (DIO). Methods Rat models of DIO established by 12-week high-fat diet (HFD) feeding were randomized into normoxia group (n=15), intermittent hypoxia group (6% O₂, 30 cycles/h, 8 h/day for 4 weeks; n=15), and IHR group (2 weeks of intermittent hypoxia followed by 2 weeks of reoxygenation; n=15). Body weight, diet and water intake of the rats were recorded, and circulating leptin, IL-6, and Ang-II levels were detected. After IHR treatment, the rats received intracerebroventricular injection of 4 μg leptin, and the hypothalamus and liver were taken 1 h later for detecting POMC, FRA-1 and FRA-2 expressions in the hypothalamus using immunohistochemistry, POMC, pSTAT3 and LepR expressions in the hypothalamus using Western blotting, and LepR mRNA expression in the hypothalamus and liver using RT-PCR. Results The rats in intermittent hypoxia group showed significantly increased weight gain, food intake and elevated systemic inflammatory cytokine levels. Intermittent hypoxia obviously inhibited the expression of POMC, lowered the expressions of FRA-1 and pSTAT3, reduced the responsiveness of the rats to exogenous leptin, and downregulated the mRNA and protein expression of LepR. Two weeks of reoxygenation treatment obviously reduced intermittent hypoxia-induced weight gain and metabolic disorder and improved leptin sensitivity of the rats. Conclusion Prolonged intermittent hypoxia impairs hypothalamic leptin signaling by downregulating LepR expression to promote weight gain in obese rats, which can be improved by reoxygenation treatment.

Graphical abstract

关键词

间歇性缺氧 / 阻塞性睡眠呼吸暂停 / 肥胖 / 瘦素 / 复氧

Key words

intermittent hypoxia / obstructive sleep apnea / obesity / leptin / reoxygenation

阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）综合征是最常见的睡眠呼吸障碍，以慢性间歇性缺氧（IH）和睡眠片段化作为其主要特征^［1］。OSA引发全身炎症、氧化应激、交感神经活性升高等不良病理过程^{［1， 2］}，与代谢疾病高风险密切相关^{［3， 4］}。肥胖是OSA的主要独立危险因素，随着全球肥胖流行，OSA患病率也逐年升高^［5］。OSA患者似乎更易陷入“喝水都长胖”的怪圈，体质量持续增长。然而，多项临床研究结果表明，持续气道正压通气（CPAP）治疗作为OSA的一线疗法，在改善了间歇性缺氧后并未达到预期的减重效果^［6］，反而使肥胖OSA患者体质量轻微增加^［7］，依从性良好者中尤为显著^［8］，其归因复杂且机制并不明朗。因此，研究间歇性缺氧复氧（IHR）对肥胖者体质量的影响及其潜在机制，有利于理清肥胖与OSA之间的相互关系，为肥胖合并OSA 患者的体质量干预提供理论依据和精准靶点。

瘦素是由白色脂肪组织分泌的蛋白质激素，与肥胖程度直接相关^［9］。瘦素通过激活下丘脑摄食中枢的信号通路，发挥抑制食欲和减轻体质量的生理功能^{［9， 10］}。既往研究发现，OSA患者因IH影响而更易出现高瘦素血症和瘦素抵抗^{［11， 12］}，循环瘦素水平随着OSA缺氧的严重程度而升高，在CPAP治疗后体质量尚未发生改变的情况下降低^［13-15］。CPAP治疗后的肥胖OSA患者较非肥胖患者体质量增加更明显^［7］，且增重者的瘦素水平高于未增重者^［16］。CPAP治疗肥胖OSA患者前后体质量的变化与瘦素相关，但外周瘦素水平无法确切反映CPAP治疗前后的体质量变化趋势，因此有必要着眼于中枢瘦素敏感性进行探索。

急性8 h的IH暴露可以通过激活下丘脑瘦素通路导致正常小鼠体质量减轻，而在瘦素缺陷的动物中无类似反应^［17］。但肥胖者普遍存在瘦素抵抗，下丘脑瘦素信号通路是否在肥胖慢性IH个体的体质量调控中发挥作用尚不清楚。本研究假设在肥胖者中，IH暴露可通过中枢瘦素信号通路导致体质量增加，因此探讨IHR对饮食诱导肥胖（DIO）大鼠体质量的影响及其下丘脑瘦素信号通路变化，以期为肥胖OSA患者的体质量干预及CPAP治疗的代谢效应提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

1.1.1 实验动物

80只3周龄SPF级雄性SD大鼠（许可证号：SCXK［京］2019-0010，斯贝福）于动物实验室适应性喂养1周后用于后续实验。在整个实验过程中，SD大鼠分笼饲养于温度20~26 ℃、湿度40%~70%、12h光暗周期的SPF级环境中，自由摄食饮水。所有实验程序和动物福利均由南方医科大学南方医院动物伦理委员会批准（伦理审批号：NFYY-2022-0119）。

1.1.2 实验试剂

瘦素ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、Ang-II ELISA试剂盒（仑昌硕），HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）（中杉金桥），重组瘦素蛋白（R&D），抗POMC抗体（Abcam），抗FRA-1抗体（博奥森），抗FRA-2抗体（Affinity），抗β-肌动蛋白抗体（TransGen），抗POMC抗体（Proteintech），抗pSTAT3抗体（Affinity），抗LepR抗体（Affinity）

1.1.3 实验仪器

动物间歇低氧实验系统（塔望科技），气体浓度控制器（玉研仪器），自动酶标分析仪（六一），脑立体定向注射仪（RWD），显微镜（Olympus），超高灵敏度化学发光成像系统（Bio-Rad），全自动化学发光图像分析系统（Tanon），RT-PCR仪（Bio-Rad）

1.2 实验方法

1.2.1 肥胖动物模型建立

70只4周龄雄性SD大鼠通过喂养高脂饮食（HFD）饲料（D12451，小黍有泰）12周建立DIO大鼠模型，10只正常饲料喂养的大鼠作为正常对照组。肥胖造模期间每周测量体质量，12周后挑选体质量超过正常饲料组大鼠平均体质量20%的HFD大鼠，排除25只肥胖抵抗大鼠以确保DIO大鼠造模成功。

1.2.2 缺氧复氧暴露干预

45只造模成功的DIO大鼠随机分为3组（n=15），并继续HFD喂养：常氧（NM）组：置于室内空气4周；IH组：置于密闭间歇缺氧舱4周，模拟重度OSA（6% O₂，30循环/h，8 h/d）；IHR组：2周缺氧后复氧处理2周。通过调节缺氧舱内的气体浓度控制器控制O₂和N₂比例：氧浓度在50 s内从室内空气水平（21%）降至6%，维持20 s，随后在30 s内恢复到室内水平，然后再维持20 s。按照8 h/d进行IH暴露处理（9∶00~17∶ 00）。记录各组大鼠在IHR干预期间体质量、饮水量、摄食量的变化。

1.2.3 瘦素侧脑室注射

IHR干预后，各组随机抽取9只大鼠作为空白对照组直接处死，其余6只大鼠在4%异氟烷麻醉下进行瘦素侧脑室给药，观察下丘脑对瘦素的反应性。重组瘦素蛋白溶于0.9%NaCl配制成0.4 μg/μL的瘦素溶液。大鼠麻醉状态下固定于脑立体定向仪，经侧脑室注射10 μL瘦素溶液（4 μg瘦素）1 h后处死，取材下丘脑和肝脏用于后续检测。

1.2.4 循环瘦素、IL-6、Ang-II水平检测

于IHR干预2周和4周的时间节点，禁食不禁水12 h后在次日上午8∶00左右采集大鼠空腹尾静脉血。使用商业化ELISA试剂盒检测循环瘦素、IL-6、Ang-Ⅱ水平，自动酶标分析仪在450 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 下丘脑POMC、FRA-1和FRA-2的免疫组织化学分析

大鼠异氟烷过量麻醉至呼吸停止，生理盐水经心灌流后用4%PFA固定。断头取脑，剥离周围组织分离出下丘脑，进行POMC、FRA-1、FRA-2的免疫组织化学分析。分离的下丘脑组织用4%PFA固定过夜，脱水后石蜡包埋，切片。切片经烘烤、脱蜡、水合等前置处理，加热修复抗原，加入3% H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，再用5%牛血清白蛋白封闭液封闭。切片滴加稀释后的一抗：抗POMC抗体（1∶200）、抗FRA-1抗体（1∶ 200）和抗FRA-2抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜。次日复温后孵二抗：HRP标记的羊抗兔抗体（H+L）（1∶100），37 ℃孵育30 min。然后用DAB显色试剂盒染色，苏木素复染后用盐酸乙醇分化，脱水，封片。显微镜下获得图像后在ImageJ软件（1.54 d版）中进行定量分析。

1.2.6 下丘脑POMC、pSTAT3、LepR的Western blotting

分离的下丘脑用于POMC、pSTAT3、LepR的蛋白分析。加入细胞裂解缓冲液以12 000 r/min高速离心，取上清液，加入BCA工作液孵育。在SDS-PAGE分离凝胶上以60 V压缩蛋白30 min，80 V分离蛋白60 min。然后在300 mA恒流条件下转膜至PVDF膜上，经3%脱脂牛奶封闭后孵育一抗过夜：抗β-肌动蛋白（1∶2000）、抗POMC抗体（1∶1000）、抗pSTAT3抗体（1∶1000）和抗LepR抗体（1∶500）。PVDF膜与二抗HRP标记山羊抗兔IgG（H+L）（1∶2000）室温孵育2 h，发光液浸湿后置于化学发光凝胶成像系统显像，使用ImageJ软件（1.54 d版）进行条带灰度分析。

1.2.7 RT-PCR检测下丘脑和肝脏LepR mRNA

移除下丘脑和肝脏后迅速冷冻于液氮中保存，检测中枢和外周LepR mRNA表达。使用Trizol裂解液和RNA提取试剂盒提取下丘脑和肝脏中的总RNA。根据Hicript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒操作配制逆转录反应体系，在PCR扩增仪中进行逆转录反应。然后进行实时聚合酶链式反应，引物序列见表1，循环条件为95 ℃ 10 min，40循环（95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）。使用2^-ΔΔCt法，以β-actin为内参基因计算LepR的相对表达量。

1.2.8 统计学分析

所有实验独立重复3次，数据使用均数±标准差来描述，在IBM SPSS Statistics 26软件中进行统计分析，并使用GraphPad Prism 9绘图。采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，Levene法进行方差齐性检验。两组间比较采用独立两样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD事后检验进行数据分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 复氧降低DIO大鼠因IH引起的体质量和摄入量增加

实验评估了IHR过程对DIO大鼠体质量、饮食饮水量、循环代谢因子的影响以及下丘脑瘦素通路蛋白的变化（图1A）。4周龄雄性大鼠通过喂养12周HFD建立DIO模型，饮食干预前所有大鼠平均体质量为144.95±10.28g（P=0.767），HFD喂养5周后HFD组大鼠体质量较Chow组显著增加（P=0.002），12周后HFD组大鼠体质量较Chow组大鼠增加了29.9%（P<0.001），提示DIO大鼠造模成功（图1B）。

在本研究中，设置了相当于重度OSA的120 s IH循环周期（6% O₂，30循环/h，8 h/d）（图1C）。随着IH暴露时间延长，IH组大鼠体质量明显高于NM对照组（P=0.001），而IHR组大鼠在恢复常氧后体质量明显下降（P=0.032，图1D）。经过IH干预的DIO大鼠体质量增量明显高于对照组（P<0.001），且在相同时间的复氧治疗后，IHR组大鼠的体质量增量仍高于NM组（P=0.031，图1E）。IH干预后的大鼠每日饮食和水分的摄入量与体质量变化一致（图1F、G）。IH暴露后大鼠摄食量（P=0.001）和饮水量（P=0.013）显著增加，而复氧处理后大鼠摄食量（P=0.013）及饮水量（P=0.010）显著减少。

2.2 复氧改善DIO大鼠中IH加剧的代谢紊乱

测定循环瘦素、Ang-II和IL-6水平，评估IHR期间外周瘦素抵抗等代谢异常。IH暴露2周后，循环瘦素（P=0.015）和Ang-II水平（P=0.001）急剧升高，4周后IL-6水平（P=0.008）也显著升高（图2A~C）。复氧虽然有助于恢复瘦素（P=0.037）和IL-6（P=0.022）水平，但并不能缓解IH诱导的Ang-II（P=0.285）水平持续升高。使用体质量标准化循环代谢因子含量发现，IH使得单位体质量的瘦素（P=0.003）和Ang-II（P=0.001）含量增加，同时也轻度提高IL-6的单位体质量含量（图2D~F）。

2.3 复氧改善DIO大鼠IH诱导的POMC下调

下丘脑瘦素信号通路中的POMC表达在IH后显著降低（P<0.001），并在复氧后回升（P<0.001），但仍低于单纯肥胖对照组（P<0.001，图3A、B）。FRA-1表达与POMC的变化趋势一致，表现为IH暴露后下降（P<0.001），复氧后迅速回升（P<0.001），提示瘦素反应性POMC神经元活动性升高（图3A、C）。FRA-2表达虽然也在IHR过程中发生显著改变，但与POMC和FRA-1的变化相反，表现为IH暴露后表达增加（P<0.001），并在复氧治疗后回落（P<0.001），且其复氧后水平显著低于NM对照组（P=0.007，图3A、D）。

2.4 复氧增强IH导致的DIO大鼠中枢瘦素反应减弱

通过急性瘦素侧脑室注射实验对比不同氧气处理肥胖大鼠的中枢瘦素反应性（图4A）。注射瘦素后，NM组pSTAT3表达显著升高（P<0.001），而在IH组（P=0.241）和IHR组（P=0.367）中均未观察到pSTAT3的显著变化（图4B）。与镜下观察到的变化趋势相同，IH组POMC表达降低，但在注射瘦素后无明显变化（图4C）。注射瘦素前，NM组下丘脑LepR表达显著高于IH组（P=0.004）和IHR组（P=0.004，图4D）。此外，IHR组中下丘脑LepR对外源性瘦素给药反应性表达增加（P<0.001），而NM组和IH组均无明显反应。

下丘脑LepR mRNA的变化与蛋白水平基本一致（图4E）。外源性注射瘦素后，IHR组LepR mRNA表达显著上调（P=0.001），而IH组LepR mRNA表达显著降低（P=0.011）。IH抑制DIO大鼠外周组织LepR mRNA表达（P<0.001），而复氧治疗后显著增加（P<0.001，图4F）。侧脑室注射瘦素后，各组大鼠肝脏LepR mRNA表达均显著升高（P<0.001），对瘦素存在一定的反应性（图4F）。

3 讨论

据流行病学调查估计，在全球30~69岁的成年人口中，OSA患者约有9.36亿^［18］。随着肥胖OSA人口增多，研究CPAP治疗前后对肥胖OSA患者体质量的调节及其机制具有重要的现实意义。本研究发现IH可能通过下调下丘脑LepR表达加剧肥胖大鼠中枢瘦素抵抗从而导致增重，而这可以通过短期复氧治疗缓解。

由于动物实验中设置的IH方案各不相同，IH对体质量影响的研究结果具有较大差异。急性IH暴露8h（6.5%O₂，18循环/h）会导致正常饮食小鼠体质量减轻、食物摄入量减少^［19］，瘦小鼠在IH暴露6周（6.3%O₂，20循环/h，12 h/d）或持续缺氧6周（8%O₂）后均出现体质量减轻^［20］。然而，也有研究与我们的结果一致，大鼠在IH暴露9周后（5% O₂，40循环/h，8 h/d）体质量增加^［21］。这些看似矛盾的结果可以解释为IH的双向性^{［22， 23］}，IH同时具有保护性和有害作用，具体取决于缺氧剂量，包括缺氧的严重程度、缺氧/复氧循环的频率、缺氧暴露的累积持续时间等。一般来说，长期频繁的严重缺氧，类似于本研究中模拟重度OSA的IH方案（6% O₂，30循环/h，8 h/d，持续4周），会促进全身氧化应激和炎症反应等不良病理生理机制^［2］。而轻度的短期IH暴露具有保护作用，在神经认知损伤、慢性心力衰竭、高血压、衰老等疾病中具有潜在的应用前景^［24-27］。此外，IH暴露对肥胖和非肥胖个体的体质量影响不尽相同。在相同IH条件下持续暴露3周，正常饮食的瘦小鼠体质量显著下降，DIO小鼠的体质量没有明显变化^［28］，而HFD大鼠的内脏脂肪组织重量显著增加^［29］。急性8h或慢性9周的IH暴露（6.5% O₂，18循环/h，8 h/d）后，瘦大鼠的体质量和摄食量均减少，循环瘦素和Ang-II水平显著升高^{［17， 19］}，并通过激活下丘脑瘦素信号通路促进POMC和pSTAT3表达，而这些指标在瘦素缺乏大鼠中无明显变化^［17］。临床研究也提示，与未患OSA的单纯肥胖者相比，肥胖OSA患者体质量更重，瘦素水平更高^［30］。瘦素自被发现以来就被赋予了抗肥胖的作用，但随着近年来研究的不断深入，提出了部分降低瘦素水平以减轻体质量的新见解^{［31， 32］}。研究发现，外源性增加DIO小鼠循环瘦素水平不仅不能达到预计的减重效果，反而会促进肥胖^［31］。通过中和瘦素减轻肥胖小鼠的高瘦素血症后，其体质量增量显著减少，下丘脑对瘦素的反应性也明显恢复^{［31， 33］}。和IH类似，瘦素的生理作用也具有剂量依赖性，在正常浓度范围内可以抑制食欲，促进产热、能量消耗和脂肪分解^［9］。但超过生理剂量后，其抗肥胖作用大幅下降，反而导致瘦素抵抗^［34］。本研究发现IH增加DIO大鼠体质量和摄入量，抑制下丘脑瘦素信号通路蛋白表达，减少FRA-1表达，并降低瘦素中枢反应性。FRA-1是由即早基因编码的转录因子，参与神经元的基因转录，在神经元对刺激的应答反应中被瞬时诱导产生，普遍认为与神经元活动性密切相关^［35］。肥胖个体瘦素抵抗的机制主要包括：肥胖诱导的中枢性炎症对血脑屏障的破坏，LepR表达减少和过度饱和，以及瘦素信号通路负性调控因子，如PTP1B、SOCS3等的过度表达^{［9， 36， 37］}。本研究表明，IH可能通过抑制下丘脑瘦素途径，尤其是下调LepR表达，起到促进DIO大鼠体质量正向调控的作用。但在正常饮食的非肥胖大鼠中，不管是急性还是慢性IH暴露都不会改变下丘脑LepR表达^{［17， 19］}，提示肥胖和非肥胖个体对IH暴露的反应存在差异，肥胖合并IH可能更易于诱发并加剧中枢瘦素抵抗，从而陷入体质量持续增加的恶性循环。复氧治疗，类似于CPAP，有助于恢复因IH引起的体质量改变。急性IH（6.5% O₂，18循环/h，8 h）引起的体质量变化可以在复氧治疗16 h后逆转^［19］。即使经过20周的IH暴露（6.3%O₂，20循环/h，12 h/d），瘦小鼠也能在常氧治疗6周后恢复体质量，并在12周后改善炎症反应和胰岛素抵抗^［38］。本研究发现，复氧减缓IH暴露肥胖大鼠的体质量增加，减轻全身炎症和高瘦素血症，促进LepR表达，改善中枢瘦素敏感性。虽然并未恢复到原有水平，但仍有显著改善。然而，临床研究发现，CPAP并不能显著改善肥胖OSA患者的体质量。这可能与影响临床个体体质量的因素多样且复杂有关：首先，CPAP治疗中存在残余AHI和残余症状，以及往往不甚满意的戴机依从性^［39］，不能完全达到动物实验中的理想复氧状态。其次，相比实验条件，过长的临床缺氧暴露时间可能产生的累积损伤会造成难以逆转或应答。另外，更重要的是，临床个体在饮食和运动上难以像实验动物一样得到较好控制，而且肥胖OSA患者CPAP治疗后因呼吸力度等变化引起基础代谢率显著降低^{［16， 40］}，即便在其体力活动和热量摄入无明显变化的情况下^［41］，也可能促使正向能量平衡。尽管有病例对照研究提示CPAP疗法在缓解肥胖OSA患者炎症和相关代谢紊乱方面发挥了有益作用^［42］，但CPAP的代谢效应，尤其是对体质量的调节作用，可能需要长期、多中心、严格控制其他变量如饮食、运动等的临床队列研究来进一步验证。

本研究的局限性在于，IH暴露需要在封闭的缺氧室中进行，不便使用代谢笼准确分析呼吸代谢、体力活动等能量消耗的变化，仅能从体质量和食物摄入量等宏观指标粗略评估。但在统一提供同类饮食以及未做额外运动方案且群居的前提下，DIO实验动物在饮食及运动方面能达到较均衡的控制。除此之外，尽管发现LepR表达在肥胖OSA大鼠的下丘脑瘦素反应性中起着至关重要的作用，但未在LepR敲除动物模型中验证，对此尚需进一步深入研究。

综上所述，IH过程可促使DIO大鼠的体质量继续增长，且通过调节能量代谢动态平衡的下丘脑中枢瘦素信号通路实现，其中LepR表达下调可能是重要原因。复氧在一定程度上具有下调肥胖OSA动物体质量的作用，因此有理由相信，在均衡控制饮食和运动等因素的前提下，良好的CPAP治疗对肥胖OSA患者的体质量和代谢会呈现显著且正向的影响，后续可以通过设计更加严谨的临床研究来证实。

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